Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, fare dalağından toplanan varyant doğal öldürücü T veya INKT hücrelerinde genişlemektir. Bu, önce splenik mononükleer hücrelerin izole edilmesi, ardından manyetik hücre ayrımı ile CD beş pozitif lenfosit popülasyonunun zenginleştirilmesi ile gerçekleştirilir. Splenik INKT hücre fraksiyonu daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ile daha da izole edilir.

Son adımda, sıralanan INKT hücreleri in vitro olarak genişleme için oturtulur. Sonuç olarak, genişlemiş INKT hücrelerinin sitokin profili Eliza tarafından değerlendirilebilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, INKT hücrelerinin saflaştırılması ve genişletilmesi için farklı tekniklerin kombinasyonunu gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir.

Bu prosedür laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olarak shrogen olacaktır. Dalağı topladıktan sonra, dokuyu 70 mikronluk bir naylon filtreye aktarın, ardından dalağı süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe nazikçe ezmek için iki mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın ve filtreyi beş mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra 15 mililitrelik bir tüpe üç mililitre kömür paketi ekleyin ve yoğunluk gradyanını beş mililitre hücresel süspansiyon ile kaplayın.

Hücreleri santrifüjleme ile ayırın ve arayüzü yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri 10 mililitre soğuk PBS'de yıkayın ve CD için beş pozitif splenik lenfositi zenginleştirmek için peleti iki mililitre faks tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre seyreltmesini daha fazla faks tamponu ile 90 mikrolitre başına 10 ila yedinci hücreye ayarlayın ve hücrelere 10 mikrolitre anti CD beş mikroboncuk ekleyin.

Dört santigrat derecede 15 dakika sonra, hücreleri dört mililitre faks tamponu ile yıkayın ve peleti 500 mikrolitre taze faks tamponunda yeniden süspanse edin. Üreticinin tavsiyesine göre manyetik hücre ayırma ile CD beş pozitif hücreyi izole edin. Daha sonra, zenginleştirilmiş CD beş pozitif lenfositi bir kez 10 kez 20 mikrolitre başına altı hücreye seyreltin, anti CD 16, CD 32 ve PE konjuge alfa gals hava CD 1D tetrameri içeren inax tamponu 30 dakika sonra karanlıkta oda sıcaklığında, hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede ilgilenilen antikorlarla 30 dakika daha inkübe edin.

Daha sonra hücreleri yeni faks tamponunda yıkayın ve beş dakika boyunca altı hücreye 10 kez 10 mikrolitre 20 mikromolar çalışma DPI çözeltisi ile boyayın. Oda sıcaklığında, şimdi yaklaşık bir kez 10 ila dördüncü zenginleştirilmiş CD, akış sitometresinde beş pozitif lenfosit olayı elde edin, hücre çiftlerini ve agregalarını elektronik olarak dışlamak için düşük hücrelerle ileri saçılma üzerinde elektronik olarak geçit oluşturur. Düşük popülasyonlu ileri dağılım içindeki DAPI pozitif CD sekiz pozitif CD 19 pozitif hücreyi kapatın ve yan saçılma ve ileri saçılma alanı grafiklerini kullanın.

Lenfositleri elektronik olarak seçmek için, alfa gal SER CD 1D tetramerlerini CD üç epsilon ile çizin ve alfa gal ser CD 1D tetramer pozitif CD üç epsilon pozitif INKT hücresini belirtildiği gibi elektronik olarak ga edin. Daha sonra, beşinciye 10 kattan fazla olmayan beş pozitif zenginleştirilmiş lenfosit elde ederek, zenginleştirilmiş hücresel fraksiyonda bulunan alfa gal SER CD 1D tetramer pozitif CD üç epsilon pozitif INKT hücresinin yüzdesini belirler. Bu kapı düşük sıralamasını kullanarak, alfa alser CD 1D tetramer pozitif CD, üç epsilon pozitif INKT hücresini, sıralamanın sonunda bir mililitre fetal buzağı serumu içeren bir faks tüpüne yerleştirir.

İzole edilmiş NKT hücrelerini faks tüpünün yanından 10 mililitre RPMI 1640 ortamı ile durulayın. Daha sonra hücreleri döndürün, peleti bir mililitre RPMI 1640'ta yeniden süspanse edin ve sıralanan hücrelerin saflığını değerlendirmek için hücrelerin 40 mikrolitrelik bir alikotunu kullanın. Aynı geçit stratejisini kullanarak.

INKT hücrelerini genişletmek için sıralama parametrelerinin ayarlanmasına gelince, hücreleri aşağı döndürün ve izole edilmiş hücreleri, IL iki IL 12 ve anti CD 28 ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamında mililitre başına beş kez 10 ila beşinci hücre arasında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri, 96 iyi düz tabanlı anti CD üç epsilon kaplı bir plakada oyuk başına 10 ila beşinci INKT hücresi olacak şekilde tohumlayın ve bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. İki gün sonra, hücreleri tam RPMI 1640'ta dinlenme koşulları altında kültür için taze, kaplanmamış düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.

İki günlük başka bir kuluçka için orta. Sıralamadan sonraki dördüncü günde, hücreleri çıkarmak ve 15 mililitrelik konik bir tüpte toplamak için süpernatanı her bir oyuğa hafifçe pipetleyin. Santrifüjlemeden sonra, damağı mililitre başına beş kez 10 ila beşinci hücrede yeniden askıya alın

Tam RPMI'de, 16 ortamı IL yedi ile desteklenir ve tohum bir kez kuyucuk başına 10 ila beşinci hücrelere bölünür. Yeni bir düz tabanlı 96 oyuklu plakada, hücreleri dört gün sonra inkübatöre geri koyun, santrifüjleme için 15 mililitrelik taze bir konik tüpe çekin. Peletleri, çözünür anti CD 28 içeren tam RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri, bir kez 10 kez beşinci hücrelerin 10'u olan anti CD üç epsilon ile kaplanmış 96 kuyulu düz bir alt plakaya tohumlayın ve hücreleri üç gün, dört gün, 11 ila 18 gün daha inkübatöre geri koyun.

IL yedi anti CD 28 ve anti CD üç epsilon tedavisini 19. günde gösterildiği gibi tekrarlayın. Hücreleri 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Onları döndürün ve peleti tam RPMI 1640.Medium'da mililitre başına beş kez 10 ila beşinci hücrede yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 10 ila beşinci hücre olacak şekilde tohumlayın ve hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe iki gün dinlenmesine izin verin. Sıralanmış INKT hücrelerinin IL iki IL 12 ve çözünür anti CD 28 varlığında plakaya bağlı anti CD üç epsilon ile uyarılması, iki günlük kültürün ardından INKT sayılarının yaklaşık üç kat genişlemesine neden olur. INKT hücrelerinin IL yedi varlığında müteakip genişlemesi, kültürde dördüncü günde bulunan INKT hücrelerinin sayısında üç ila dört kat artışa neden olur.

Özellikle, bu kültür koşullarının tekrarlanması, farklı günlerde kültür ortamındaki değişiklikler arasında gözle görülür bir hücre kaybı olmaksızın iki tur genişlemeden sonra ortalama yedi kez 10 ila yedinci INKT hücresi verebilir ve bu da 18 günde en az 70 kat genişleme ile sonuçlanır. Plakaya bağlı rekombinant murin ile aktive edilen daha da genişletilmiş INKT hücreleri. Alfa alser ile yüklenen CD 1D, stimülasyondan 48 saat sonra IL iki IL dört IFN gama, TNF alfa ve IL altı üretir, bu da INKT hücrelerinin genişleme sonrası TH bir ve TH iki sitokin üretme yeteneklerini koruduğunu gösterir.

Bu prosedürü denerken, akış sitometrisi sırasında INKT hücrelerini tanımlamak için INKT hücrelerinin alfa seramid yüklü cdre ile uygun şekilde boyanmasının gerekli olduğunu hatırlamak önemlidir. Emin.