Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, fare dalağından elde edilen invariant doğal katil T veya INKT hücrelerini genişletmektir. Bu işlem, öncelikle splenik mononükleer hücrelerin izole edilmesi ve ardından manyetik hücre ayırımı ile CD5 pozitif lenfosit popülasyonunun zenginleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Splenik INKT hücre fraksiyonu daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama yöntemiyle izole edilir.

Son adımda, ayrıştırılmış iNKT hücreleri in vitro ekspansiyon için hazırlanır. Nihayetinde, ekspande edilen iNKT hücrelerinin sitokin profili ELISA ile değerlendirilebilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler zorluk yaşayabilirler çünkü iNKT hücrelerinin saflaştırılması ve ekspansiyonu, farklı tekniklerin kombinasyonunun uygulanmasını gerektirir.

Bu prosedür, laboratuvarımdan bir lisansüstü öğrencisi tarafından gerçekleştirilecektir. Dalak toplandıktan sonra, dokuyu 70 mikronluk bir naylon filtreye aktarın, ardından iki mililitrelik bir şırınga pistonu kullanarak dalağı süzgeçtenle birlikte 50 mililitrelik konik bir tüpe nazikçe ezin ve filtreyi beş mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpe üç mililitre yoğunluk gradyanı solüsyonu ekleyin ve hücre süspansiyonunun beş mililitresini yoğunluk gradyanının üzerine yerleştirin.

Hücreleri santrifüj ile ayırın ve ara yüzeyi yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Ardından, CD5 pozitif splenik lenfositleri zenginleştirmek için hücreleri 10 mililitre soğuk PBS ile yıkayın ve pelletini iki mililitre fax tamponunda yeniden süspande edin. Hücre seyreltmesini daha fazla fax tamponu ile 90 mikrolitrede 1 × 10⁷ hücre olacak şekilde ayarlayın ve hücrelere 10 mikrolitre anti-CD5 mikroboncuk ekleyin.

Dört derece santigrat sıcaklıkta 15 dakika bekledikten sonra, hücreleri dört mililitre fax tamponu ile yıkayın ve pelletini 500 mikrolitre taze fax tamponunda yeniden süspande edin. Üreticinin önerisine göre manyetik hücre ayırımı ile CD5 pozitif hücreleri izole edin. Ardından, zenginleştirilmiş CD5 pozitif lenfositleri, anti CD16, CD32 ve PE konjuge alpha gals air CD1D tetramer içeren fax tamponunda 1x10⁶ hücre/20 mikrolitre olacak şekilde oda sıcaklığında ve karanlıkta seyreltin; 30 dakika sonra hücreleri ilgili antikorlarla dört derece santigrat sıcaklıkta ve karanlıkta 30 dakika daha inkübe edin.

Ardından hücreleri taze fax tamponu ile yıkayın ve 10⁶ hücre başına 20 µM'lık bir DPI çalışma çözeltisinden 10 µL kullanarak beş dakika boyunca boyayın. Oda sıcaklığında, hücre dubletlerini ve agregatlarını elektronik olarak dışlamak için forward scatter (ileri saçılım) ile low cells (düşük hücreli) üzerinden elektronik kapılamayla flow sitometrede yaklaşık 10⁴ zenginleştirilmiş CD5 pozitif lenfosit olayını edinin. Forward scatter ile low cells popülasyonu içerisinde DAPI pozitif, CD8 pozitif ve CD19 pozitif hücreleri kapı dışı bırakın ve side scatter (yan saçılım) ile forward scatter alan grafiklerini kullanın.

Lenfositleri elektronik olarak seçmek için, CD three epsilon'a karşı alpha gal SER CD 1D tetramerlerini grafiğe dökün ve belirtildiği üzere alpha gal ser CD 1D tetramer pozitif CD three epsilon pozitif iNKT hücrelerini elektronik olarak kapılayın. Ardından, 2 × 10⁵'ten fazla olmayacak şekilde CD five pozitif zenginleştirilmiş lenfositleri elde ederek, zenginleştirilmiş hücresel fraksiyonda bulunan alpha gal SER CD 1D tetramer pozitif CD three epsilon pozitif iNKT hücrelerinin yüzdesini belirleyin. Bu kapıyı kullanarak, alpha alser CD 1D tetramer pozitif CD three epsilon pozitif iNKT hücrelerini, ayıklamanın sonunda bir mililitre fetal sığır serumu içeren bir FACS tüpüne ayıklayın.

İzole edilen NKT hücrelerini faks tüpünün kenarından 10 milliliters RPMI 1640 medyumu ile durulayın. Ardından hücreleri santrifüjleyin, peleti bir milliliter RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin ve ayrıştırılmış hücrelerin saflığını değerlendirmek için hücrelerden 40 microliter'lik bir alikot kullanın. Aynı kapılama (gating) stratejisini kullanın.

INKT hücrelerini genişletmek için sıralama parametrelerini ayarlamaya gelince, hücreleri santrifüjleyin ve izole edilen hücreleri IL-2, IL-12 ve anti-CD28 ile desteklenmiş tam RPMI 1640 besiyerinde 5 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Ardından hücreleri, kuyuk başına 1 × 10⁵ INKT hücresi olacak şekilde anti-CD3ε kaplı 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakaya ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de inkübe edin. İki gün sonra, hücreleri tam RPMI 1640 içerisinde dinlenme koşullarında kültürlemek üzere kaplanmamış yeni bir düz tabanlı 96 kuyucuklu plakaya aktarın.

İki günlük daha inkübasyon için besiyeri ekleyin. Ayıklamadan sonraki dördüncü günde, hücreleri yerinden çıkarmak için her kuyuctaki süpernatantı nazikçe pipetleyin ve bunları 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Santrifüjden sonra, peleti mililitre başına 5 × 10⁵ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin.

IL-7 takviyeli tam RPMI 1640 ortamında, yeni bir düz dipli 96 kuyucuklu plakaya kuyucuk başına 1x10⁵ hücre olacak şekilde ekim yapın. Hücreleri inkübatöre geri koyun ve dört gün sonra santrifüj için taze 15 mL'lik konik tüplere aktarın. Pelleti çözünür anti-CD28 içeren tam RPMI 1640 ortamında yeniden süspande edin ve hücreleri, anti-CD3ε ile kaplanmış 96 kuyucuklu düz dipli bir plakaya kuyucuk başına 1x10⁵ hücre olacak şekilde ekleyip hücreleri üç gün daha inkübatöre geri koyun, günler 11 ila 18.

19. günde az önce gösterildiği gibi IL-7, anti-CD28 ve anti-CD3 epsilon işlemini tekrarlayın. Hücreleri yeni bir 15 mL'lik konik tüpe aktarın. Santrifüjle çöktürün ve peleti komple RPMI 1640 ortamında 5 × 10⁵ hücre/mL olacak şekilde yeniden süspande edin.

Ardından hücreleri, düz dipli 96 kuyucuklu bir plakaya kuyucuk başına 1x10⁵ hücre olacak şekilde ekin ve hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe iki gün boyunca dinlenmesine izin verin. Sıralanmış iNKT hücrelerinin, IL-2, IL-12 ve çözünür anti-CD28 varlığında, plakaya bağlanmış anti-CD3ε ile stimüle edilmesi, iki günlük kültürün ardından iNKT sayılarında yaklaşık üç katlık bir genişleme ile sonuçlanır. iNKT hücrelerinin ardından IL-7 varlığında genişletilmesi, kültürün dördüncü gününde mevcut olan iNKT hücre sayısında üç ila dört katlık bir artış sağlar.

Dikkat çekici şekilde, bu kültür koşullarının tekrarlanması, farklı günlerdeki kültür ortamı değişimleri arasında herhangi bir görünür hücre kaybı olmaksızın, iki genişletme döngüsünden sonra ortalama 7 x 10⁷ iNKT hücresi sağlayabilir ve bu da 18 günde en az 70 katlık bir genişleme ile sonuçlanır. Plaka ile bağlanmış, alfa-galaktosamin yüklü rekombinant fare CD1d ile aktive edilen daha fazla genişletilmiş iNKT hücreleri, stimülasyondan 48 saat sonra IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-alpha ve IL-6 üretir; bu durum, iNKT hücrelerinin genişletme sonrası Th1 ve Th2 sitokinleri üretme yeteneklerini koruduklarını göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, akış sitometrisi sırasında iNKT hücrelerini tanımlayabilmek için iNKT hücrelerinin alfa seramid yüklü cdre ile uygun şekilde boyanmasının esas olduğunu unutmamak önemlidir.