Name: Hareketliliği zamanmekansal Haritalama içinde Ex Vivo Hazırlıklar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Öğrenin, GIMM sistemi kullanarak ex vivo bağırsaklarda hareketliliği zamanmekansal haritalama yöntemiyle görselleştirin. Bu teknik, ilaç etkilerini ve bağırsak duvarı hareketlerini incelemek için güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DMK Virginia Commonwealth University NIGMS (K12GM093857) bir IRACDA hibe ile desteklenmiştir. Bu çalışma John R. Grider için NIDDKD hibe DK34153 tarafından desteklenmiştir.

Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Bu protokolde kullanılan tüm hayvan ve ötenazi prosedürleri onayladı. Çözümler 1. Hazırlık <ol><li> Krebs tamponu 4 L hazırlayın ([mM] oluşan: 118 NaCl, 4.75 KCl, 1.19 KH 2 PO 4, MgSO 4 1.2, 2.54 CaCl2, 25 NaHCO 3, 11 glukoz). Deiyonize su hacmine uygun koymak her katı kimyasal, uygun miktarlarda tartılır ve çözüm netleşene kadar bir vorteks kullanarak karıştırın. </li><li> Daha sonra, carboxygen (% 95 O2,% 5 CO2) 30 dakika süre ile ısıtılarak 37 ° C ile çözelti havalandırır. </li><li> HCI kullanılarak ve gerekirse 37 ° C (organ banyosunda aynı sıcaklık), pH 7.4 ayarlarken çözeltinin pH belirler. Deneyin uzunluğu boyunca Krebs tampon sürekli carboxygenated ve 37 ° C &#39;de muhafaza edin. </li><li> Koymakperistaltik pompa tampon rezervuar ve dönüş içine peristaltik pompalar giriş ve çıkış boruları boru ve organ banyosu sisteminde tampon perfüzyon başlayacak. Not: Tampon ilk perfüzyon tamponuna organ banyoları veya kimyasal madde içine ya da doku ilave kadar orijinal kabına geri pompalanabilir. Bu deney için gerekli olan tampon miktarını azaltır. Hava parası ve giden tamponlar karışmaz, böylece daha sonra giden tampon perfüzyon hatları boş bir kaba yerleştirin konulmalıdır. </li><li> Organ banyoları içinde arabellek olur ve deney süresince 37,0 ± 0,5 ° C kalacak şekilde su sirkülasyonu ısıtma sistemi sıcaklık kalibre edin. Onay ve gerekirse, en az bir kez daha adım 2.8 banyo doku segmentleri yerleştirmeden önce, Krebs tampon pH değiştirin. </li></ol> Dokuların 2. Hazırlık <ol><li> Euthanizekapalı bir odacık veya yerel hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış bir başka ötenazi yönteminde karbondioksit inhalasyon / boğulma kullanımı ile kobay. </li><li> Hayvanın ötenazi onayladıktan sonra, diseksiyon makas ile uzunlamasına karın duvarı açın ve bağırsakları yerini kesti. Çekum maruz yardımcı olmak için ince bağırsağa bağlı mezenter kesin. NOT: Bir hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış olarak ötanazi gibi iki taraflı torakotomi gibi ikincil yordamı gerçekleştirmek onaylamak için. </li><li> Çekum distal ucunu bulun ve çekum ile bağlantısı hemen distalinde proksimal kolon transect. Sonra proksimal kolonda ilk transection tekrar ~ 8 cm distalinde transect. </li><li> Daha fazla diseksiyon için (bölüm 1 anlatılmıştır) ısıtılmış ve carboxygenated Krebs çözeltisi içine kolon doku yerleştirin. Diseksiyon banyoya kolon Pin ve mümkün olduğunca mezenter ve yağ çıkarmak için makas küçük bir kümesi kullanın. </li><li> H iseeated diseksiyon tepsi (doku perforasyonu önlemeye yardımcı olmak için) bir kör uç katetere bağlanmış bir şırınga kullanılarak lümen boyunca Krebs tamponu hafifçe perfüzyon tüm lümen içi içerik kaldırmak. Bu perfüzyon işlemi sırasında parçanın aşırı distansiyonu kaçının. </li><li> İki yangın cilalı cam tüp kateterler (3 mm çapında) edinin ve doku lümen giren cam tüp kısmı etrafında polietilen boru kısa bir parça (~ 3 mm uzunluğunda ve ~ 3 mm çapında) yerleştirin. NOT: Bu dikiş güvenliğin sağlanması için, doku ve cam tüpün etrafına yerleştirilir ve hazırlama organ banyosu içine ve doku uzunluk değişimleri sırasında yerleştirilir olarak kayma kullanılmasını sağlar. </li><li> Doku hazırlık sözlü ucunu tek kateter takın ve bir cerrahın düğüm kullanarak kateteri çevreleyen borunun küçük bir parça etrafında bir dikiş kravat. Yavaşça düğüm rahat olduğundan emin olmak için tekrar dışarı kateteri çekmeye çalışmayın. Ardından, diğer kateter giren t aynı eylemi gerçekleştirmekO doku ucunu aboral. </li><li> Kateterler güvencesindedir sonra organ banyolarına birine diseksiyonu tepsiden tüm hazırlık (doku artı kateterler) hareket ettirin. Kullanıcıya uzak olan ağız ucu banyosuna hazırlık yerleştirin. </li><li> Sonraki iki önerilen yöntemlerden biri ile organ banyosuna cam tüp kateterlerini / montaj sabitleyin. NOT: Tüpler deneme sırasında uzunluğunu değiştirme veya banyosunda Krebs tampon yüzey seviyesinden gelen doku segmenti engellemek cam Güvenliğini. <ol><li> Seçenek A: kalıpçı kil veya plastik klibin kullanımı yoluyla plastik bir organ banyosunun tarafının üstüne cam tüp üst kısmını sabitleyin. </li><li> Seçenek B: plastik klipsler kullanılarak organ banyosu hazırlık yukarıdaki kameralar tutun metal direklere cam tüpler sabitleyin. </li></ol></li><li> Kateterler banyo tespit edildikten sonra, her bir kateterin açık ucuna bir boru 5 cm&#39;lik parça eklemek. Oral kediheter, proksimal kolon segmentinin lümeni içine tampon enjekte etmek için kullanılacak bir 10 ml şırınga, bu boru ekleyin. Aboral kateter için, boru bu parça lümen çıkış, bir toplama konteynerine (50 mi beher, hazne, vs.) içine yönlendirilir sağlayacaktır. </li><li> Oral ucuna bağlanmış bir şırınga kullanarak, yavaş çalkalama doku içinden akabileceği bir sıvı sağlamak için doku lümen yoluyla Krebs tampon ısıtıldı. Akış sıvı aboral kateter çıkan ile teyit edilir. Doku 30 dakika boyunca equilibrates ise video kayıt sistemi (protokol bölüm 3) kalibre. </li></ol> Video kayıt sistemi 3. Kalibrasyon <ol><li> Parlaklık ve kontrast ve yazılımı kullanarak yatay mesafe için kamera yüksekliği yerleştirme, video ayarlarını ayarlayın. NOT: intraluminal perfüzyon kurulumları için en iyi ayarları pelet sevk 13 hızını belirlemek için kullanılan ayarlardan daha farklıdır. </li><li> CliKamera için deney sekmesinde ck kalibre edilmesi. Ardından &#39;Dosya&#39; menüsünden &#39;Kalibre&#39; seçeneğini tıklayın. </li><li> Video &#39;iş istasyonu kalibre&#39; penceresinde göründüğünde, görüntü kolon lümen içine yerleştirilen kateter uçlarını içeren bir yükseklikte kamerayı ayarlayın. </li><li> Sonra, her banyo bağlı saydam cetvel sticker kullanılarak görüntüde inceledi yatay mesafeyi kalibre. NOT: Bu kalibrasyon lümen çapı ve kasılma dalgalarının hızı, daha sonra yazılım hesaplamalar için çok önemlidir. </li><li> Onlar kamera görüntüsünde cetvele göre 10 mm aralıklı böylece aynı &#39;kalibre iş istasyonu&#39; penceresinde, kırmızı dikey kurallar ayarlayın. Ardından, &#39;mesafe imleçleri&#39; penceresine uygun mesafeyi (10 mm) yazıp &#39;CAL&#39; düğmesine tıklayın. </li><li> Sonraki kazanç, parlaklığını ayarlayın ve böylece kamera görüntüsünü değiştirmek için &#39;iş istasyonu kalibre&#39; pencere içinde sürgü kepenkDoku segmenti hafif bir arka plan üzerinde koyu silueti olarak görünür. NOT: Şekil 4 bu kalibrasyon prosedürünün iyi ve kötü örnekleri gösterilmektedir. </li><li> Düzgün Görüntüyü ayarlamak için, aynı zamanda kameranın kendisi odak ve diyafram düğmeleri ayarlayın. </li><li> Kalibrasyon tamamlanmıştır. Ardından &#39;EXIT&#39; düğmesini tıklayın nihayet pop-up &#39;Tamam&#39; ı tıklatın ve &#39;Kaydet&#39; seçeneğini tıklayın. </li></ol> 4. Genel deney prosedürleri <ol><li> Kamera kalibrasyon prosedürleri ve doku dengeleme 30 dakika tamamlandıktan sonra, her bir deney protokolünde denemeler adlandırın. Deneme adları adı ve bileşik ve sıvı hacmi konsantrasyonu dayalı olabilir lümen deney bölümü sırasında doku parçasının içine perfüze edilir. </li><li> Daha sonra, boru kelepçesinin kullanımı ile aboral kateterden çıkan boru tıkamak. NOT: Bu fu sırasında aboral ucu çıkmadan lümen sıvı engellerrther deney, şişkinlik çeşitli düzeylerde kışkırtmak için lümen belirli birimlerin kullanımına izin veren (Şekil 1). </li><li> Kobay ex vivo hazırlık içinde itici kasılmalar başlatmak için yeterli distansiyonu sağlamak için proksimal kolon lümeninde yaklaşık 0.7 ml Krebs tampon enjekte edilir. NOT: Bu birim biraz farklı olabilir (0,1-0,2 ml) olduğu gibi segmentin toplam uzunluğu ve organ banyosu içinde segmente uygulanan germe miktarı ile ilgili olarak. </li><li> Bölüm luminal sıvı tarafından şişmiş sonra, fotoğraf makinesini açın ve sonra zaman önceden belirlenmiş bir süre (örneğin, 10 dakika) için motilite kaydedin. <ol><li> Özellikle, deneysel kamera görünümünü açmak ve daha sonra kamera alanını görüntülemek için &quot;ON&quot; konumuna geçiş anahtarı tıklatın uygun adlı deneme çift tıklatın. Bir (kamera kayıt ise kayıt tuşu kırmızı kalacaktır) Sonra, kayıt başlatmak için kayıt düğmesini tıklatınnd Kaydı durdurmak için tekrar kayıt düğmesine tıklayın. </li></ol></li><li> Bu ilk kontrolü şişme deneme sonunda, doku segmenti lümen dışında distending sıvıyı itmek için izin aboral kateterin kapatılmasıy kelepçeyi çıkarın / gevşetin. </li><li> Bir 10 dakika yeniden dengeleme döneminden sonra, kısmın (örneğin, kısa zincirli yağ asitleri veya dekanoik itici motilitesini değiştirmek için lümen sıvısı içindeki besin, biyolojik olarak aktif ajanlarla, ilaçlarla ya da agonist / antagonistleri, çeşitli herhangi biri ile bu işlemi tekrar edin asit) 10,18. <ol><li> Kabarcık ilerleme lümen Kolon yeni çözümün perfüzyon üzerine kullanıcı zaman deneysel sıvıyı bilmek sağlayacak, böylece yeni deneysel sıvı kolon segmenti girdiğinde göstergesi yardımcı olmak için, şırınga limanı yakınlarında bir hava kabarcığı bırakın lümen ulaşmıştır. </li><li> Kabarcık sayesinde tamamen itti kadar açık aboral kateter lümen içi perfüzyon devamlümen perfüzyon sistemi (perfüzat 2-3 ml gerektirebilir). Daha sonra, doku kademeli kadar 5 dakika boyunca açık aboral kateterden sıvı çıkarmak için izin verir. NOT: Bu işlemden sonra, lümen lümeni içine sıvının bilinen hacimde bir perfüzyon sağlayan sıvı ihmal edilebilir bir hacmi içerir. </li></ol></li><li> Yeniden tıkamak, bir boru kelepçesi kullanılarak aboral lümen kateter tüpü (adım 4.3 gibi) şırınga yoluyla kontrol koşulu olarak sıvıyı distending aynı hacimde enjekte. (Adım 4.5 gibi) kontrol Krebs durumuna daha sonra analiz ve karşılaştırma için deney süresince motilite desenleri kaydedin. </li><li> Tekrar bölümler 4.4 - Farklı lümen bileşikler veya aynı lümen bileşiğinin farklı konsantrasyonları ile protokol 4,7. </li></ol> Spatiotemporal Maps 5. İnşaatı (stmaps) <ol><li> Denemeyi Kayıt tamamlandıktan sonra, analiz rüzgar açmak için belirli bir davanın adını çift tıklatınow bir STmap inşası için. </li><li> Video oynatma alanı içinde, analiz için görüntü uygun hale getirmek için analiz penceresindeki kontrast ve parlaklık sürgü ayarlamak (Açık zemin üzerine siyah doku silüet; Şekil 4). NOT: Kamera kalibrasyon görüntüsü yalnızca bu noktada daha az bir ölçüde değiştirilebilir deney başlamadan önce uygun şekilde yapılmamışsa. </li><li> Görüntü düzgün tezat sonra, analiz için doku bölgesini izole etmek ve eserler içeren alanları kaldırmak için video görüntüsü penceresindeki yatay ve dikey kırmızı kurallar ayarlayın. Ayrıca, başlangıç ​​belirleyerek kayıt uygun zaman dilimini seçmek ve analiz için zaman noktaları durdurun. <ol><li> Özellikle, analiz yazılımı içinde yeşil &#39;A&#39; ve sarı &#39;B&#39; düğmelerini kullanarak video içinde başlangıç ​​ve bitiş noktalarını işaretleyin. Analiz etmek, video segmentinin başında ve zaman kaydırıcısını ayarlayınn yeşil &#39;A&#39; düğmesine tıklayın. Ardından, analiz ve sarı &#39;B&#39; düğmesine tıklayın segmentinin sonuna kadar kaydırıcıyı ayarlayın. </li></ol></li><li> Sonraki, STmap penceresini açın ve &#39;kronometre&#39; düğmesine tıklayın &#39;Motor analizi&#39; sekmesini tıklayın. Kronometre tıkladıktan sonra, bir sonraki nesil STmap başlamak için kaydedilen filmin içindeki doku siyah silueti içinde çapraz imleci tıklayın. </li><li> Doku silueti crosshair&#39;i tıkladıktan sonra yazılım üretir ve video o bölge için STmap görüntüler. NOT: Bu analiz için seçilen videonun uzunluğuna bağlı olarak birkaç dakika sürebilir. </li><li> Görüntüyü ayarlamak için STmap ve kontrollerin büyütülmüş görüntüsünü görüntülemek için &#39;zoom&#39; tıklayın. <ol><li> Renk yerine gri tonlamalı olarak STmap görüntülemek için yeni oluşturulan pencerede &#39;renk&#39; seçeneğini tıklayın. Ayrıca, harita ve v içinde belirli piksel bir imleci edebilmek için &#39;Enable&#39; seçeneğini tıklayınspesifik doku bölgesi için lümen çapı değişimin bir izleme iew. Bittiğinde &#39;Çık&#39; ı tıklatın. </li></ol></li><li> Gazetelerde veya sunumlarda kullanılmak üzere bir STmap ihraç veya ardından &#39;Meta Dosyası&#39; İhracat Verileri &#39;seçerek ve ardından&#39; Dosya &#39;menüsünden seçerek ImageJ daha analiz etmek. Sonra bir .emf dosyası olarak kaydedilir STmap, isim ve &#39;Kaydet&#39; düğmesine tıklayın. </li><li> Alternatif olarak, ekran yakalayarak STmap görüntüleri kaydedin. Bu STmap sözde renkli sürümlerini kaydetmek için gereklidir. </li></ol> Stmaps içinde Kontraktil Dalga Hızının 6. Analizi <ol><li> Kasılma yayılması veya kasılma süresinin hızı analiz etmek, öncelikle tiff, gif, jpg, ya da seçtiğiniz bir dosya dönüştürme programı aracılığıyla ImageJ kabul olan bmp formatları STmap .emf dosyasını dönüştürmek. NOT: ImageJ yazılım stmaps bir .emf biçimi çıkışını açmıyor. <ol><li> Alternatively, kullanım ekran yakalama yazılımı ekranda bir STmap bir resim çekmek ve uygun bir dosya biçiminde kaydedebilirsiniz. </li></ol></li><li> Sonra ImageJ yeniden biçimlendirilmiş STmap açın ve ardından &quot;Eklentiler &#39;menüsünü seçerek&#39; açılış GIMMProcessor tarafından GIMMProcessor eklentisi açmak GIMMProcessor &#39;ve&#39; Ölçümleri Tablo &#39;pencereleri&#39;. Bu, hem açılacaktır. &#39; </li><li> Tıklayıp STmap sağ üst köşesindeki ölçek çubuğu ve tüm alanı sürükleyerek anahat kullanın, sonra ImageJ pencere içinde &#39;dikdörtgen seçim aracını tıklayın ve. O bölge seçildikten sonra, eklenti &#39;set kalibrasyon&#39; düğmesine tıklayın. Son olarak, ölçek çubuğu üzerindeki değerlere göre kalibrasyon kutusu içine uygun mesafeyi (mm) ve zaman (sn) takın ve &#39;Bitti&#39; düğmesine tıklayın. </li><li> Sonra, ImageJ penceresindeki çizgi çizim aracını tıklatın. Th açı boyunca yayılan bir daralma merkezinden geçen STmap bir çizgi çizintıklayıp STmap resmin üzerine sürükleyerek e eğimi. Alternatif olarak, kasılma süresini belirlemek için non-yayılan kasılma bir grup ile dikey bir çizgi çizin. </li><li> Hat uygun çekildikten sonra (tek satır bir anda çekilmiş olabilir), hattın yatay mesafe, dikey mesafenin ve eğimi bir okuma-out üretmek için eklenti &#39;ölçü almak&#39; düğmesine tıklayın; sırasıyla uzunluk (mm), zaman (sn) ve hız (mm / sn) karşılık gelir. Bu veriler &#39;Ölçümleri Tablo&#39; penceresinde görüntülenir. </li><li> Çizgi çizme tekrarlayın ve analiz verilen STmap içinde birden çok kez birkaç adım ve bir .gmd dosyası olarak kaydedebilirsiniz. Eklenti &#39;Kaydet&#39; düğmesini tıklayın ve dosyayı adlandırın. İşlemi tamamlamak için yeniden &#39;Kaydet&#39; i tıklatın. Bu veriler daha sonra başka çalışma verilerine kıyasla veya STmap çizgiler çekme yeniden kullanılabilir. </li></ol>

GIMM sisteminin yaratıcısı Catamount Research and Development, Inc., bu makalenin yayın ücretlerini karşıladı.

Intestinal motilite inceledi ve kayıt altına parametrelerin niteliğine göre bakış açılarının bir dizi tarif edilmiştir. Video kayıt ve uzaysal haritalama segmenti boyunca belirli noktalarda gut uzun kesimleri üzerinde genel hareketi ve / veya sevk analizinin yanı sıra faaliyet analizine olanak değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Yaklaşım iki kat olabilir video kayıt ve uzaysal haritalama alınan ve incelenen bölge ve lümen içeriğinin doğası yansımasıdır. Içerikleri daha çok yarı-katıdırlar burada lümen içeriği daha fazla sıvı ve proksimal kolonda olduğu bağırsak bölümlerinde, etkinlik bolus veya enfüzyon yolu ile sıvının lümen içi giriş yolu ile indüklenir. Bu, video kayıtları elde edilen uzaysal harita yukarıda tarif edildiği gibi, tüm segment hareketini temsil etmek üzere tasarlanmıştır. Buna karşılık, içerik daha sağlam olan uzak kolona ortalarından, aktivitesi bir dışkı Pelle sokulması ile başlatılırt (epoksi, doğal ya da suni pelet pelet kaplı) ve uzaysal harita Hoffman ve ark., 13 JOVE makalesinde tarif edildiği gibi kolon üzerinden topak hareketi yansıtacak şekilde tasarlanmıştır. Böylece deney ve analiz kurulumu çok önemlidir ve çalışılan uyaran ve bölgenin türüne bağlıdır. Bu nedenle, üretim ve sıvı kaynaklı bağırsak motilite Spatiotemporal haritaların analizi için kritik adımlar şunlardır: disseke dokudan mezenter 1) uygun kaldırma; 2) Kayıt önce uygun görüntü kalibrasyonu; STmap üretimi ve analizi sırasında eserler 3) Doğru kaldırma; 4) Analiz sisteminin düzgün kurulum; ve 5) kateterize ve onlara zarar vermeden kesimleri dikilmeye el becerisi kazanıyor. Lümen çapı stmaps kullanımı bağırsağın bir bölge üzerinde tam motilite kalıplarını görselleştirmek ve analiz etme yeteneği gelişmiş olsa da ile birleştiğinde, tekniği en iyi şekilde kullanılırbasınç veya kas fonksiyonel ölçümleri 2,15,20 daralma. Bazı kas kasılmaları hafif lümen çapı değiştirmek ve bazı stmaps (yani, myojenik dalgaların) görünür olabilirken Örneğin, aslında bağırsak içeriği 25 herhangi bir tahrik ya da karıştırma neden olmayabilir. Bu diğer fonksiyonel ölçümlere Bu tekniğin kapling olmadan bilinemez. Aynı zamanda, (bir pompa sistemi ile, yani kapalı bir lümen sistemi veya sabit lümen perfüzyon) Bu tür bir sistemde bir çok doku preparatları doğası stmaps içindeki eserler yol açar. Böylece, kullanıcı nedeniyle dokusunun yetersizlik kendi spesifik organ hazırlama ve deney verileri ve önlemek veya bu veri analizinde eserler (örneğin, mezenter kaynaklı dikey çizgiler veya koyu pikselleşmeyi dışlamak için şekillerde eserler yol açabilir nasıl farkında olmalıdır ) kapalı bir luminal hazırlık sisteminden sıvı sınırdışı. Bir luminal perfüzyon için birden fazla yöntem vardırkapalı bir sistem dışında bağırsak segmenti başvurunuz. Bir yöntem, bunun yerine hazırlama 8-10,30 anal ucunda yükseltilmiş bir boru ve / veya tek yönlü bir valf aracılığıyla sabit bir lümen içi / arka basınç sağlar açık bir sistem kullanılmasıdır. Bu sıvı itici kasılmalar sırasında hazırlık dışına hareket etmesine olanak sağlar. Sistem kurulumu lümen çapı değişiklikleri algılamak için esas olduğundan, büyük ölçüde lümen çapı etkilemez bu kasılmalar veya motilite desenleri genellikle bu protokolü tarafından görselleştirmek için zordur. STmap içinde piksel gölgelendirme değişiklikler lümen çapı değişikliklere dayalı olduğundan güçlü kasılmalar aynı kayıt içinde varsa, çapı büyük değişikliklere neden olmaz motilite desenleri bu yöntemde iyi görsel olmayacaktır. Yakın t kayıt video analiz hatları ayarlama, görselleştirme ve dalga-tipi daralma analizi (Şekil 3) anlatıldığı gibio doku duvar bu sorunu ortadan olabilir. Sadece minimal doku çapını değiştirmek kasılmaları görülebilmesi Bu yöntem, STmap içinde görüntülenen maksimum çapı azaltır. Bu sorunu çözmek için bir başka seçenek daha küçük kasılmalar daha kolayca görülebilir, böylece büyük ölçüde lümen çapı etkileyen kasılmalar dışlamak için, analiz video segment süresini değişiyor. Bu minimal kasılmalar ölçüde lümen çapı değiştirildi ayrı STmap benzer görünümlü lümen çapı değiştirir hareketlilik potansiyel probleme yol açar. Haritası üzerinde beyaz piksel belirlenmesi, belirli bir video en küçük çapa dayalı olmasıdır. Video (az veya dairesel kasın kasılması hiçbir) Başka bir videodan peristaltik kasılmalar benzer bakabilirsiniz ölçüde hazırlık çapını değiştirmez çok küçük kasılmalar içinde çapı çok değişkenlik yoksa. Bu nedenle, şekil dikkate almak önemlidirHaritanın sağ üst köşesindeki efsane. Maksimum ve minimum çapları arasındaki fark küçük ise o STmap gösterildiği gibi piksel gölge değişikliği geçerliliğini belirlemek için oluşturulan video STmap karşılaştırmak için önemlidir. Bu durumda, fiili, kayıtla ilgili olarak ölçek çubuğu incelenmesi harita yorumlanmasını düzeltmek için kritik öneme sahiptir. , 19 - kobay, 33 5,6,8,13 - 30, sıçan 7,9,30 - Video kayıt bağırsak ve kolon bölümlerinin uzaysal eşleme zebra balığı 26 de dahil olmak üzere çeşitli türlerde fare 25,27 uygulanmıştır 24,30,32,34,35, brushtail opossum 12,36, tavşan 2,30,37,38, tavuk 39, domuz 40,41 ve insan 42. En çok çalışılan türler kobay olduğunu. Kobay sinir sistemi h enterik çünkü bu şaşırtıcı değildirçoğu tamamen karakterize edilmiş ve tarihsel olarak en bağırsak 43 itici motilite ile ilgili in vitro okudu hayvan olmuştur. Spatiotemporal haritalama çoğunlukla küçük hayvanlardan bağırsak tübüler kesimleri uygulanmıştır; Ancak, tavşan ve domuz kullanılarak modifiye sistemlerde çalışmalar büyük hayvanlara bu metodolojinin uygulanmasını göstermektedir. Tavşan durumunda, yaklaşımın geniş segmentleri ve organ banyoları 30 kullanılması dışında küçük hayvanlar ile özdeştir. Domuz kullanılan bir yaklaşım, bir organ banyosu içine parçalanmış doku parçasının anestezi altında domuz yerine daldırma bağırsağın batın döngü kullanmaktı. Ayrıca, stmaps çapraz korelasyon yerine çoğu çalışmada 40 kullanılan transillüminasyon yöntemi ile üretilmiştir. Video kayıt ve uzaysal haritalama için izole edilmiş perfüze vascularly köprüsü preparasyon ayrıca örneğin sıçan gibi daha küçük türlere uygulanmış <sup&gt; 33. Kuizenga ve arkadaşlarının yeni bir çalışma. Videonun stmaps ilk kullanımı, insan bağırsak 42 ex vivo bölümlerine motilite desenleri kaydedilmektedir; STmapping yaklaşımlar vivo 3,44 insanlarda manometrik (basınç) Kayıtların analizine uygulanmıştır rağmen. Insan dokusunda kaydedilen motilitesi desenleri benzer teknikler kullanılarak insan dokuları için bu yaklaşım uzantısı doğrulamak hayvan modellerinde kaydedilen benzerdir. Bu çalışmada kombine stmaps kuvvet dönüştürücüler tarafından kaydedilen kas kasılması ölçümü ile video kayıtları elde edilen dikkat çekicidir. Ex vivo kesimi içine sokulmuş bir fiber optik, manometrik kateter yoluyla lümen içi basınç ölçümü de luminal çapındaki değişikliklerden daha görselleştirmek için STmap kullanışlılığını gösteren bir STmap dönüştürülmüştür. Bu kombine yaklaşım ilişkilendirilmesi kas gerginliği, intraluminal basınç ve duvar hareketi veriyorVideo kaydından oluşan stmaps daha derinlemesine fonksiyonel analiz için. Duvar hareketleri ve (aynı zamanda Dmaps denir) lümen çapı değişikliklerden kaynaklanan stmaps çalışmalar gibi itici peristaltik dalgalar ve lokalize segmental kasılmaları olarak hareketlilik desen ayrıntılı açıklamalarını sağladı. Bu desenler önceki deneysel metotlarla tespit edilirken, şimdiki yaklaşım, dalgalar ve yeni anti-peristaltik kasılmalar 9,24,25,30,31,42 olarak lokalize kasılma hareketleri daha rafine bir tanım verir. Stmaps motilite desen değişikliklerin analizi yapım bağırsak ve kolon mide-bağırsak motilitesindeki önemli sorular uygulanmıştır. Bunlar: nörojenik ve miyojen kasılmaların farklılaşması ve interstisyel Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 hücrelerinin rolünü tanımlayan - 31,33,37 - 40,42, karmaşık anlamakÇeşitli motilite desenleri üzerinde intraluminal besin 10,18,19 etkileri inceleyerek dairesel ve uzunlamasına kas katmanları 2,7,8,11,12,32,39,40 arasındaki etkileşimler, mikrobiyal suşlar 34 ve viskoziteler 12,36, 7,9,10,13 - - nesil 17,28,35,40 ve motilite modifikasyonu ve çeşitli endojen nörohormonal ajanları ve 2,4 eksojen farmakolojik ajanların rolü anlamak. Bu tekniğin gelecekte basıncı, elektrofizyoloji ve gerginlik / kontraktilite dahil olmak üzere diğer ölçümleri ile bağlamaya dayanır. Son çalışmalar, genellikle ek bağıntılı ayrıntıları 2,42 sağlamak video kayıt ve uzaysal haritalama ile bağlantılı olarak, bu ölçümlerin bir veya daha fazla ihtiva ederler. Ayrıca, sistem, diğer boru şekilli olan ve olmayan boru şekilli organlarda hareketliliğini ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, denemeler kullanılarak gastrik motilitenin ölçülmesi yapılmıştırBöyle bir sistem ancak teknik ve yazılım iyi bir tüp şeklinde olmayan bir organ 45 hareketlilikten ölçmek için arıtma gerekir. Zamanmekansal haritalama teknikleri tek başına ve analiz daha geleneksel yöntemlerle birlikte kullanılmasının daha derinlemesine ve gelecekte gastrointestinal motilite kapsamlı bir anlayış yol açacağı kuşkusuzdur.

Kayıt ve bağırsak motilite analiz çeşitli yöntemler son 150 yıldır üzerinde 1 geliştirilmiştir. Bu ilk arasında değişmektedir in vivo ölçüm ve kas gerginliği, intraluminal basınç ve / veya potansiyel membran çoklu kayıt yorumlanması daha yeni yöntemlerle William Beaumont ve Walter Cannon gözlemleri ve tanımları (yani, kavşak potansiyeller) 2 - 6. Bu son yaklaşımlar genel motilite desenleri bir anlık sağlar, ancak kayıt sitelerin sayısı ve kayıt siteleri arasında yer alanlara veri enterpolasyon geçerliliği ile sınırlıdır. Video kayıt ve uzaysal haritalama (STmap) tekniklerinin son gelişmeler mümkün gözlemlemek ve kolon ve bağırsak ex vivo tüm segmentlerde karmaşık motilite kalıplarını analiz yaptık. İlk mide- için tarif edilen ilk yaklaşım,Video kaydını analiz etmek araştırmacı tasarlanmış bir yazılım bağlı 1990&#39;ların sonlarında 7,8 yılında intestinal segmentler; birkaç grup şimdi oluşturulan veya bu amaçla 2,8 yazılımı değiştirdiniz - 12. Birçok gruplar kendi yazılım paketleri ya da eklentileri meydana getirirken, hepsi bir doku parçasının çapları analiz ve gri tonlama temsil için bu değişik çaplarda dönüştürün. Bir piyasada mevcut kayıt ve analiz sistemi gastrointestinal motilite İzleme Sistemi (Gimm) kobay Distal kolon 13 yanı sıra itici ve karıştırma motilite desen analizi dışkı pelet hız tespiti yoluyla itici motilite hem analiz sağlayan bir anahtar teslimi yaklaşım sağlar denilen 19 - bozulmamış bağırsak segmentlerinde 4,5,14 bir sıvı uyaran. Bu yaklaşım stmaps üretilmesi ve analiz bağlıdır ve bu yazıda açıklanmıştır. Bu yöntemin amacı, t arttırmakO yetenek nitelik ve nicelik bağırsakta bulunan çeşitli motilite kalıplarını analiz etmek. Diğer gruplar kendi yazılım aracılığıyla motilite analizi için STmap kullanmış olsa da, bu stmaps nesil tarafından motilite kalıplarını analiz etmek Gimm nasıl kullanılacağı ilk açıklaması. Doku çapı değişiklikleri tespit etmek için yetenek, stmaps oluşturulmasını maksimize etmek video kayıt, video kayıt parametrelerinin doğru ayarı için bağırsak dokularının hazırlanması yanı sıra: Bu yazıda, biz ayrıntılı adım adım talimatları sağlamak yorumlanması ve Gimm sistemi ve ImageJ yazılımı kullanarak stmaps analizi. Burada açıklanan yöntem sıvıları veya intestinal motilite modelini etkileyebilir bileşikleri ihtiva eden yarı-katı luminal perfüzyon analizi özgüdür. Dışkı pellet tahrik analizi için bir yöntem olup Mawe ve arkadaşlarının 13 tarafından bir sayfa halinde tarif edilmektedir. Burada tarif edilen genel yöntem olabilirgibi diğer düz kas boru şekilli organlara Uygulanan kendi başına bu yöntem basınç veya kas gerginliği değişikliklere verileri sağlamaz, ancak vb ince bağırsak, kan damarları, üretra, üreter, bu, basınç kullanarak bağlanabilir; dönüştürücüler, kuvvet dönüştürücüler veya elektrofizyolojik ölçümler diğer bazı gruplar gibi motilite desen daha tam bir resim 2,15,20,21 göstermiştir sağlamak.

<table><tbody><tr><td>Krebs tamponu için</td> <td>Sodyum Klorür (NaCl)</td> <td>Fisher</td><td>BP358</td>.</tr><tr><td>Krebs tamponu için</td> <td>Potasyum Klorür (KCl)</td> <td>Fisher</td><td>BP366</td>.</tr><tr><td>Potasyum Fosfat (KH2PO4)</td> <td>Krebs tamponu için</td> <td>Fisher</td><td>P285</td>.</tr><tr><td>Krebs tamponu için</td> <td>Magnezyum Sülfat (MgSO4)</td> <td>Sigma</td><td>M2643</td>.</tr><tr><td>Krebs tamponu için</td> <td>Kalsiyum Klorür (CaCl2)</td> <td>Sigma</td><td>C7902</td>.</tr><tr><td>Krebs tamponu için Sodyum Bikarbonat (NaHCO< alt > 3 < / alt >)</td> <td>Fisher</td><td>BP328</td><td>.</td></tr><tr><td>Krebs tamponu için</td> <td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td>.</tr><tr><td>Karboksijen (%95 O2/%5 CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon pimleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon tepsileri/tabakları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dunkin Hartley Guinea Pigs</td><td>Charles River</td><td>Strain 051</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>Çevrimiçi olarak ücretsiz olarak mevcuttur.</td></tr><tr><td>GastroIntestinal Motilite Monitörü (GIMM)</td><td>Catamount Inc., St. Albans, Vermont</td><td></td><td>Aşağıda listelenen parçaları içerir.</td></tr><tr><td>Peristaltik Pompalar</td><td></td><td></td><td>GIMM ile Birlikte Verilir.</td></tr><tr><td>Banyo Kameraları</td><td></td><td></td><td>GIMM'ye dahildir.</td></tr><tr><td>Banyo TransLighting Arka Işıkları</td><td></td><td></td><td>GIMM ile Birlikte Verilir.</td></tr><tr><td>Organ Banyoları GIMM'ye</td><td></td><td></td><td>dahildir.</td></tr><tr><td>Arka Işık Yoğunluğu Kontrolleri</td><td></td><td></td><td>GIMM'ye dahildir.</td></tr><tr><td>GIMM İşlemci ImageJ Eklentisi</td><td></td><td></td><td>GIMM'ye dahildir.</td></tr><tr><td>Polietilen Boru</td><td></td><td></td><td>GIMM ile Birlikte Verilir.</td></tr><tr><td>GIMM ile Birlikte Verilen</td> <td>Boru Konnektörleri</td><td></td><td></td>.</tr><tr><td>Peristaltik Pompalar</td><td></td><td></td> için Masterflex boru <td>sistemi GIMM ile birlikte verilir.</td></tr><tr><td>Isıtma Banyosu / Su Sirkülatörü</td><td></td><td></td><td>GIMM ile Birlikte Verilir.</td></tr></tbody></table>

hareketliliği zamanmekansal haritalama içinde<em&gt; ex vivo</embağırsakların&gt; hazırlıklar

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Kayıt kas gerginliği değişiklikler, intraluminal basınç ve membran potansiyeli: Birden çok yaklaşımlar da dahil olmak üzere kayıt ve mide-bağırsak motilitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu yaklaşımların hepsi daha sonra genel motilite desen duygusu sağlamak için yorumlanır aynı anda bağırsak boyunca bir veya birden fazla noktada faaliyet ölçümü bağlıdır. Son zamanlarda, video kayıt ve uzaysal haritalama (STmap) tekniklerin geliştirilmesi mümkün gözlemlemek ve kolon ve bağırsak ex vivo tüm segmentlerde karmaşık desenleri analiz yaptık. Bir kez kaydedildi ve dijital video kayıt lümen çapı gri ya da dönüştürüldüğü stmaps dönüştürülebilir rengi [adı çapı haritaları (Dmaps)]. Stmaps motilite yönünde (yani, kırtasiye, peristaltik, antiperistaltik), hız, süresi, sıklığı ve kasılma motilite kalıplarının gücü verileri sağlayabilir. Bu yaklaşımın avantajları şunlardır: Analysietkileşim veya aynı segmentte farklı bölgelerinde farklı motilite desenleri eşzamanlı gelişme s, motilite desen görselleştirme zamanla değişir ve başka bir bölgede bir bölge etkiler aktivitede nasıl faaliyeti analizi. Ayrı stmaps ve motilite desenleri daha detaylı olarak analiz edilebilir, böylece Video kayıtları, farklı zaman çizelgeleri ve analiz parametreleri ile oynatılabiliyor. Bu protokol, özellikle motilite nesil etkileyen intraluminal sıvı distansiyonu ve intraluminal uyaranların etkisini ayrıntıları. Lümen reseptör agonistleri ve antagonistlerinin kullanımı, bir model bir desen dönüştürülebilir kadar belirli bir desen başlatılır ve ilgili mekanik bilgi sağlar. Bu teknik sadece intraluminal basınç değişiklikleri veya kas gerginliği verileri vermeden, lümen çapı değişikliklere sebep olur ve deney düzeneği dayalı eserler kuşak tarafından hareketliliğini ölçmek için yeteneği ile sınırlıdır; Her ne kadar, analizleri:s yöntemleri bu konularda sorumlu olabilir. Önceki tekniklere göre video kayıt ve STmap yaklaşımı gastrointestinal motilite daha kapsamlı bir anlayış sağlar zaman.

Anlamak Spatiotemporal Haritalar Çap Maps gibi (stmaps) (Dmaps) Bu teknik ile oluşturulan haritalar uzaysal olmakla birlikte, dokunun luminal çap değişimi, özellikle mesafe ve zaman hem de görsel bir parametredir. STmap altındaki üst ve bitiş zaman başlayan zaman (sn) y-ekseni üzerinde, yatay (mm olarak), x-ekseni üzerinde, doku bölmesi boyunca mesafeyi ve zamanı tasvir eder. Sağ üst köşede x ve y eksenleri (Şekil 1-4) hem de ölçekleme yanı sıra asgari ve azami lümen çapları görüntüleyen bir efsane vardır. Böylece, gri tonlu görüntü içinde farklı piksel tonları farklı lümen çapları karşılık gelir. Koyu piksel geniş çaplarda karşılık ve hafif piksel küçük çaplarda karşılık gelmektedir. Böylece, dairesel kasın kasılma dalgaları (nedeniyle lümen çapı azalmasına hafif pixelation bölgeleri olarak görünecektir <strong&gt; Şekil 1 siyah oklar). Bunun aksine, bağlı dairesel kas gevşeme veya sıvı büyük bolus luminal distansiyon STmap / DMAP (Şekil 1C, beyaz oklar) bir lümen çapı artışı ve koyu piksel neden olur. Stmaps oluşum ve anlam diğer bir tartışma Lammers grubunun 11 bir yazıda bulunabilir. Luminal Distansiyon Bağlı Çoğaltım Kasılmaları Şekil 1 &#39;de, kobay proksimal kolon, her birim, 5 dakika boyunca Krebs tamponu, 0.5, 1.0, 1.5, ve 2.0 ml şişmiş edildi. Yayma kasılmaları ≥1.0 tüm birimlerdeki tarafından ml ortaya ve STmap (Şekil 1) olarak ince beyaz şeritler görünür bulundu. Bağırsak lümen distansiyonu yayılan kasılmalar başlatılmasını neden olur. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, daha büyük bir lümen içi hacimli lümen çapı arttığında ve STmap pikselBu çapına tekabül genel bir koyu arkaplan oluştururken koyu olur. Gerilmenin belli bir düzeyde en peristaltik refleks aktive edilir; lümeninin çapını azaltmak ve parçanın Anal ucuna doğru hareket Oral ucunda daralma itici dalgaları başlatır (1.0 mi Şekil 1), (a, beyaz bantlar olarak gösterilen Şekiller 1 ve 4) &#39;de. Beyaz bant temsil daralma genellikle öncesinde peristaltik dalga (Şekil 1C beyaz oklar) aboral gevşeme temsil eden bir karanlık bant, önce gelmelidir. Bunlar beyaz ve koyu pikseller artan daralma ve sırasıyla 22,23 peristaltik refleksin inen gevşeme bileşenlerine karşılık gelir. Şekil 1 Panel A STmap içinde, 0.0 ml 0 itici dalgalar, 0.5 ml şişkinlik de 0 itici dalgalar, 1.0 ml şişkinlik 3 itici dalgalar, 1.5 ml şişkinlik 6 itici dalgalar ve 5 itici dalgalar vardırt 2.0 ml şişkinlik. Besin-Kaynaklı Sabit / Karıştırma Kasılmaları Kasılmayı yayma Dalgalar stmaps tarafından görüntülenmiştir olabilir tek hareketlilik desen değil. Böyle segmentasyon olarak motilite Karıştırma desenleri de stmaps ve ilgili görüntü (Şekil 2A) görülebilir. Bu model kasılmaları propaganda farklıdır. Birçok küçük, sabit kasılmalar aynı anda farklı alanlarda meydana gelen desenleri karıştırma sırasında (birden küçük beyaz aynı yatay çizgide kareler, ancak birbirlerine dokunmadan değil görüntülendi). Her segmental kasılma sabit ve propaganda kasılmaları için anlatıldığı gibi anal tarzda oral hareket etmese de, uzun süreler boyunca karmaşık kasılma desenleri göstermek için stmaps yeteneği (Şekil 2A anally zamanla kasılmaları yavaş ilerlemesi görselleştirme sağlar siyah ok). Süresiher bir daralma ImageJ ve ilgili eklentisi (Şekil 2A) ile beyaz bir daralma kare boyunca dikey bir çizgi çizerek belirlenir. (: 1.9 2.1 sn aralığında), kısa zincirli yağ asitlerinin içi kolon perfüzyon üretilen bu özel STmap, ortalama sabit kasılma süresi ~ 2 sn. Doku kesimi üzerinde kalan mezenter analizinde eserler neden olabilir, mezenter (Şekil 1B, 2B) tarafından oluşturulan dikey çizgi eserler uzunlamasına kas hareketlerini tespit etmek için kullanılabilir. Şekil 1B ve 2B siyah dikey çizginin yatay hareket kasılması uzunlamasına kasının gevşemesine kaynaklanmaktadır. Uzunlamasına kas bu yanal hareket yatay mezenter eserler tarafından oluşturulan dikey bantlar hareketleri (Şekil 1B, 2B) olarak stmaps görsel olabilir. ImageJ ve Plugin stmaps Analizi Hem yayılan bir dalga (Şekil 3) ve kasılma süresi (Şekil 2) hızı ImageJ ve GIMMProcessor eklentisi kullanarak belirlenebilir. (: 0.21 0.35 mm / sn aralığında) Şekil 3&#39;te, ortograd ve retrograd hem dalgaların yayılma hızı ~ 0.25 mm / sn idi. ST harita üzerindeki video görüntüsünde görüldüğü gibi, analiz hatları (video görüntüsü üzerinde bir kutu oluşturan kırmızı çizgi), doku bölümünün bir kenar çevresinde tamamı yerine segmentte tam olarak belirlenmiştir. Bu yazılımda rehberlerin önemli bir kullanımıdır. Bu kılavuzların hassas ayar olarak daha tartışma bölümünde analiz videonun düzgün analiz için çok önemlidir. Bu Miyojenik dalgalanma kasılmalar 24 görüntüler bir STmap üretimi sağlar. Bu kasılmalar kökenli miyojenik ve büyük lümen çapı değişmez. Aynı zamanda, farklı dirdalgaların için ortak yayılım ections (ortograd veya retrograd), bu tekniği (Şekil 3) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, daralma süresi doku parçasının farklı bölgelerinde değişiklik gösterebilir. Stmaps Uygun Analizi Stmaps oluşturulması ile potansiyel bir sorun nedeniyle deneysel metodoloji mümkün eser kuşaktır. Örneğin, doku dışında sol mezenter (2B, Şekil 1) STmap üzerinde dikey siyah çizgi oluşturarak doku bu segment için okuma çapını artacaktır. Mezenterde varlığı yapay ölçek kontrast ölçümleri küntleşmesi sonuçlanır geniş lümen ölçümü, artırarak gri tonlama haritayı genişletmektedir. Bu nedenle doku delinmeden kesimden mümkün olduğu kadar tamamen mezenterin kaldırmak için en iyisidir. Bir<html> Diğer olası STmap artefaktı bağlı siyah (Şekil 4B) tezat edilemez lümen sıvısı içindeki kabarcıkların bir beyaz dikey bir çizgidir. Bu kabarcıklar lümen çapı analiz yazılımı küçük görünmesi veya STmap içinde motilite desenleri beyaz / hafif bölgeleri bindirmek olabilir. Bu nedenle, analizden önce video kayıt doku segmenti ve uygun kontraslanmada kurulum stmaps (Şekil 4) inşa başarı açısından kritik öneme sahip. Uygun ve uygun olmayan zıt kurulumları Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Bu ön-deney makinesi kalibrasyonu ve sonrası deneyi analiz pencere yapacakları STmap üretimi ve analiz için çok önemlidir bu video ayar düğmeleri dikkat etmek önemlidir. Uygun olmayan görüntülü ayarlama gereksiz verilerin (Şekil 4A) stmaps yol açabilir. 700 &quot;/&gt; Şekil Proksimal Colon 1. Çoğaltım Dalgalar. (A) (kobay proksimal kolonda gerçekleştirilen) bir şişme-tepki eğrisi bu segmentte (beyaz yatay şeritler) dalgalar yayılan başlatmak için uygun intraluminal sıvı hacmini belirlemek için kullanılmıştır. Siyah oklar, tam uzunluktaki yayılan dalgaların örneklerini göstermektedir. Beyaz oklar eksik mezenterik kaldırılması nedeniyle hat artifakı. (B) Panel A benzer bir deneyden STmap nesil elde kasılmaları yayma yakından görünümü, ama kısa süreli bir video göstermektedir. Bu kasılmalar Anal yöne sözlü ilerleme unutmayın ve önümüzdeki beyaz şeridin Bu harita aynı zamanda mezenter eserler başka görünüm sağlar paneli A. kıyasla karanlık bir alan olarak temsil önceki aboral gevşeme tanımlamak daha kolaydır. Kırmızı kutu Panel C. (C) genişletilmiş Bu STmap bölgesi Bu panel daha yakın bir görünüm o göstermektedir tanımlarf aynı video ve yayılan dalga sıvı aboral tarafından distansiyonu lümen nedeniyle karanlık piksel &#39;Sıvı Distansiyon&#39; nokta etiketli paneli B. Beyaz oklar gibi harita. Bunlar dairesel kas gevşemesi dairesel kas kasılması için aboral meydana bölgelerdir. Yayılan kasılmalar nedeniyle haritanın uzun zaman ölçeği panel A&#39;da tamamen yatay çizgiler gibi bakmak unutmayın. Zaman panelleri B ve C ölçekler kasılma dalgası ölçülmüş ve dalga hareketinin hızı olarak rapor edilebilir bir eğim vardır. Bu nedenle giderek daha <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" target="_blank">kısa, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" width="700" /> STmap tarafından Daralma Süre 2. belirlenmesi Şekil. (A) Kobay proksimal kolon shkısa zincirli yağ asidi (bütirat) ve lümen içi perfüzyon yanıt olarak bir karıştırma / segmental motilite desen akımları. Dikey kırmızı çizgiler Görüntü J ve GIMMProcessor eklentisi kullanarak daralma süresini belirlemek için daralma dönemlerinde çizilmiştir. Siyah ok sabit kasılmaları yayılma aboral yönünü gösterir. (B) fare ileumda yayılan kasılmalar genellikle sürekli kasılma bölgeleri göstermektedir. Dikey oklar daha ağız bölgeleri daha uzun bir süre için sözleşmeli kaldı haritayı göstermek çizilmiş. Bu hazırlık, hazırlık anal ucu doku kasılmalar sırasında kapalı sistem bırakarak sıvı önlemek için kapatıldı. Panelin üst kısmındaki görüntü tüm anal ucu (STmap üzerinde siyah) akışkan tarafından tahrip edilirken dokusunun tüm ağız ucu, (STmap üzerine beyaz) sözleşmeli bir zaman gösterir. B Paneli STmap ortasında dikey siyah yatay / yanal hareket hareketini gösteriruzunlamasına kas tabakası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" width="400" /> Şekil 3. Çift Yönlü Motilite Desenleri. Yayılan dalgalar yönde (oral, anal) (anal, oral) ve retrograd hem de, dik taşıyabilirsiniz. Katı siyah oklar, normal ortograd yayılmasını göstermek ve kesik siyah oklar retrograd yayılmasını gösterir. Bu STmap hem de, dik yayılma ve retrograd kasılmaların hızı ImageJ analizi ile belirlenir ve 0.25 mm / sn olduğu bulundu. Görüntü analizi hatları (STmap yukarıdaki video görüntüsü üzerinde bir kutu oluşturan kırmızı çizgiler) sık sık, dik odaklı düşük genlikli olan miyojenik dalgalanma kasılmaları, sığ kasılmalar görselleştirmek yakın dokuda bir kenarına kuruldu, retrograde veya iki yönde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" width="700" /> STmap Nesil Uygun Görüntü Kontrast 4. Önemi Şekil. Panel B uygun bir şekilde tezat görüntü ve STmap gösterirken (A), uygun olmayan şekilde tezat görüntü ve STmap gösterir. (A) düzgün bir tezat görüntüde (B) elde edilen yatay beyaz şeritler olarak açık değildir ve yüzünden ilk görüntü gri tonlarında olmak üzere çok sayıda eserler (beyaz gölgeleme) vardır. Düzgün tezat görüntü (B) elde edilen STmap içinde gri tonlama beyaz gölgeleme eserler kaybolur ve yayılan dalgalar daha belirgindir. Ayrıca, siyah gölgeleme gevşeme ah temsilçoğaltım kasılma dalgasının ead kasılması her dalga ile STmap anal sonunda görülebilir. Panel B&#39;de beyaz oklar doğru tezat edilemeyen görüntüsünün bir bölgesi tarafından oluşturulan bir STmap objeyi göstermektedir. Dışlayıcı Bu tip bazen deneysel protokol sırasında hazırlanmasında meydana lümen baloncuklar çoğunlukla kaynaklanmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.</a>

Son zamanlarda mevcut olan video kaydı ve uzay-zamansal haritalama (STmap) teknikleri, bağırsak hareketliliğinin hem yayılma hem de karıştırma modellerini görselleştirmeyi ve ölçmeyi mümkün kılar. Bu protokolün amacı, GastroIntestinal Motilite İzleme (GIMM) sistemi kullanılarak STmap'lerin oluşturulmasını ve analizini açıklamaktır.

Hareketliliği zamanmekansal Haritalama içinde<em&gt; Ex Vivo</emBağırsakların&gt; Hazırlıklar

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Ex vivo bağırsakların kapsamlı bir spatiotemporal haritasının oluşturulmasındaki genel amaç, tüm bir segment boyunca bağırsak duvarının ayrıntılı hareketlerini gözlemleyerek luminal içeriğe verilen yanıtı incelemektir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı doku segmentinin farklı bölgelerindeki aktivitenin kaydedilebilmesi ve mekansal ve zamansal olarak karşılaştırılabilmesidir; bu da basit kasılma veya gevşemeden ziyade karmaşık motilite modellerinin tanımlanmasına olanak tanır. Bu yöntem normal bağırsak motilitesi hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, çeşitli ilaçların ve besinler veya motilite modelleri gibi intraluminal ajanların etkilerinin belirlenmesinde de uygulanabilir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler başlangıçta zorlanacaktır çünkü uzay-zamansal haritaları yorumlamak başlangıçta güç olabilir. Ancak zamanla, karmaşık modeller bir bakışta ayırt edilebilir. Başlamak için, ötanazi uygulanmış bir guinea pigden kolon veya bağırsağı çıkarın.Sıcak Krebs çözeltisi içerisinde sabitleyin. Diseksiyon tepsisinde, lümenden nazikçe Krebs tamponu perfüze ederek tüm intralüminal içeriği temizleyin. Küt uçlu kateterli bir şırınga kullanın ve perfüzyon sırasında kolon segmentinin aşırı genişlemesinden kaçının.Ardından, iki adet üç milimetre çapındaki alevle uçları düzeltilmiş cam tüp kateterine, ikişer üç milimetre uzunluğunda polietilen tüp parçaları takın. Isıtılmış bir diseksiyon tepsisinde, kateterlerden birini doku preparatının oral ucundan yerleştirin ve cerrah düğümü kullanarak kateteri çevreleyen küçük tüp parçasının arkasından bir sutyur bağlayın. Düğümün sıkı olduğundan emin olmak için kateteri nazikçe geri çekmeye çalışın.Küçük polietilen tüp parçası, sütürün kaymasını önler. Bu işlemi, dokunun aboral ucundaki diğer kateteri kullanarak tekrarlayın. Ardından, mezenteri doku preparasyonundan çıkarın.Her iki kateter de sabitlendikten sonra, preparatı diseksiyon tepsisinden GIMM organ banyolarından birine aktarın ve dokuyu oral uç kullanıcıya ters bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, cam tüp kateterleri, cam tüpün ucunu banyonun yan tarafına sabitleyerek modelleme kiliyle veya kameraları sabitlemek için kullanılan banyonun üzerindeki direklere plastik klipsler yardımıyla tutturarak organ banyosuna sabitleyin. Şimdi, her bir kateterin açık ucuna beş santimetrelik bir boru parçası takın.Oral kateter için, kısa tüp parçasını luer lock bağlantılı daha uzun bir tüp parçasına bağlayın. Ardından beş mililitrelik şırıngayı luer lock bağlantı aparatına bağlayın. Bu düzenek, doku hazırlığına tampon çözelti enjekte etmek için kullanılacaktır.Aboral kateter için, lüminal çıkışı bir toplama kabına yönlendirmek üzere boruyu kullanın. Şimdi, ekli şırıngayı kullanarak, sıvının aboral kateterden çıktığının gözlemlenmesiyle iyi bir akış olduğundan emin olmak için dokuyu ısıtılmış Krebs tamponu ile yavaşça yıkayın. Doku 30 dakika boyunca dengelenirken video kayıt sistemini kalibre ederek devam edin.GIMM yazılımını kullanarak kamera yükseklik yerleşimini, parlaklık ve kontrast için video ayarlarını ve yatay mesafeyi kalibre edin. Kalibre edilecek kameranın deney sekmesine tıklayın. Ardından Dosya menüsünde Kalibre Et'e tıklayın.Video, kalibrasyon istasyonu penceresinde göründüğünde, kamerayı görüntüye kolon lümenine yerleştirilen kateterlerin uçlarının da dahil olduğu bir yüksekliğe ayarlayın. Ardından, her banyoya yapıştırılmış olan yarı saydam cetvel etiketi yardımıyla ekrandaki görüntüde görülen yatay mesafeyi kalibre edin. Aynı kalibrasyon istasyonu penceresinde, kırmızı dikey kılavuz çizgileri araları 10 milimetre olacak şekilde ayarlayın.Ardından bu mesafeyi mesafe imlecinin penceresine yazın ve Cal düğmesine tıklayın. Sonrasında, doku segmentinin açık renkli bir arka plan üzerinde koyu bir silüet olarak görünmesini sağlamak için kalibrasyon istasyonu penceresindeki kazanç, parlaklık ve perde sürgülerinden ayar yapın. Daha sonra görüntüyü daha da iyileştirmek için kameranın üzerindeki odak ve diyafram düğmelerini ayarlayın.Görüntü kalibrasyonunu tamamlamak için Kaydet'e, ardından açılan ekranda Evet'e tıklayın. Son olarak, Çıkış'a tıklayın. Yarım saatlik dengeleme süresinin ardından deneye başlayın.Deney denemesini adlandırarak başlayın. Ardından, aboral kateterden çıkan tüpün lümenini plastik klemple kapatın. Daha sonra, proksimal kolon lümenine yaklaşık 7 milliliters Krebs tamponu enjekte edin.Amaç, propulsif kasılmaları başlatmak için yeterli genişlemeyi sağlamaktır. Segment lüminal sıvı ile genişletildiğinde video kaydını başlatın. Yazılımda, deneysel kamera görünümünü açmak için adlandırılmış denemeye çift tıklayın ve ardından kamera alanını görüntülemek için açma-kapama anahtarını açık konuma getirin.Önceden belirlenmiş uzunlukta video verisi toplayın. Bu ilk kontrollü genişletme denemesinin sonunda, doku segmentinin genişletici sıvıyı lümenden dışarı itmesine izin vermek için klempi gevşetin veya çıkarın. Dokunun 10 ila 20 dakika boyunca yeniden dengelenmesine izin verin ve ardından prosedürü tedavi kullanarak tekrarlayın.Tek bir doku hazırlığı, testler arasında uygun dinlenme süreleri verildiği takdirde, 10 dakikalık beş işleme kadar tabi tutulabilir. Dokunun degrade olduğunun sinyali olan mukozal dökülmelere karşı dikkatli olun. Kaydı analiz etmek için, bir ST haritası oluşturmak amacıyla analiz penceresini açmak üzere belirli bir denemenin adına çift tıklayın.Video oynatma alanında, görüntüyü analize uygun hale getirmek için kontrast ve parlaklık sürgülerini ayarlayın. Açık bir arka plan üzerinde siyah bir doku silueti oluşturun. Ardından, doku bölgesini analiz için izole etmek ve artefakt içeren alanları çıkarmak için video görüntü penceresindeki yatay ve dikey kırmızı kılavuz çizgilerini ayarlayın.Ardından analiz süresini ayarlayın. Zaman sürgüsü doğru konumlara geldiğinde, başlangıç noktasını seçmek için yeşil A düğmesine ve bitiş noktası için sarı B düğmesine tıklayın. Sonrasında, ST haritası penceresini açmak için Motor Analysis sekmesini seçin ve ardından kronometre düğmesine tıklayın.Dokunun siyah silüeti içindeki artı işaretli imlece tıklayarak ST haritası oluşturma işlemini başlatın. Harita oluşturma işleminin tamamlanması birkaç dakika sürebilir. ST haritası oluşturulduktan sonra, görüntüyü büyütmek için yakınlaştırma özelliğini seçin.Ardından, görüntüyü gri tonlamalı yerine renkli görmek için renk seçeneğini belirleyin. Sonra, imlecin analiz edilecek pikseli seçmek için kullanılabilmesi amacıyla etkinleştir seçeneğini belirleyin. Seçilen piksellerle ilişkili doku için lümen çapındaki zamanla meydana gelen değişim analiz edilir ve ST haritasının sağında bir taneçik çapı izlemi olarak görüntülenir.Analizlerin ardından Çıkış'ı (Exit) seçin. Şimdi, Dosya (File) ve ardından Veriyi Dışa Aktar'ı (Export Data) ve sonra Metafile'ı seçerek ST haritasını diğer amaçlar için dışa aktarın. Dosyayı adlandırın ve Kaydet'e (Save) tıklayarak bir emf dosyası olarak kaydedin.Bu teknikle oluşturulan haritalar, dokunun lüminal çapındaki değişimleri hem mesafe hem de zaman açısından göstermektedir. Yatay mesafe X ekseninde, zaman ise Y ekseninde yer alır; başlangıç zamanı üstte, bitiş zamanı ise altta bulunur. Sağ üst köşede minimum ve maksimum lüminal çapların yanı sıra hem X hem de Y eksenleri için ölçeklendirmenin yer aldığı bir lejant bulunmaktadır.Bu nedenle, gri tonlamalı görüntüdeki farklı piksel tonları farklı lümen çaplarına karşılık gelir. Daha koyu pikseller daha geniş çaplara, daha açık pikseller ise daha küçük çaplara karşılık gelir. Dairesel kasın kontraktil dalgaları, lümen çapındaki azalma nedeniyle daha açık pikselleşmiş bölgeler olarak görünecektir.Buna karşılık, sirküler kas gevşemesi veya büyük bir sıvı bolusu nedeniyle oluşan lüminal genişleme, daha koyu piksellerle gösterilmiştir. İlerleyici kasılma dalgalarının yanı sıra, segmentasyon olarak bilinen karıştırma motilite paterni de görselleştirilebilir. Aynı anda farklı bölgelerde küçük durağan kasılmalar meydana gelir.Zamanla, bu küçük kasılmalar aboral anal uca doğru ilerler. Dokuda kalan mezenterler, koyu dikey çizgiler şeklinde görünen artefaktlara neden olabilir. Bu artefakt kaynaklı dikey çizgilerin yatay hareketi, boylamsal kas hareketinin zamanlamasını belirlemek için kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, video kaydı için bağırsak segmentlerinin nasıl hazırlanacağı ve bağırsak motilitesinin spatiotemporal haritalar şeklinde nasıl temsil edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü takiben, doğal bileşenlerin sindirim ve emilimi kolaylaştırmak için spesifik motilite paternlerini nasıl indüklediğini belirlemek amacıyla luminal çözeltiye farklı besinler eklenebilir. Motilitenin nasıl başlatıldığını ve yayıldığını belirlemek için nöral humoral ajan reseptörlerinin spesifik farmakolojik agonistleri veya antagonistleri kullanılabilir.Bu teknik, motilite bozukluklarının tedavisi için yararlı bileşiklerin belirlenmesinde kullanılabilecek verilerin üretilmesine yardımcı olabilir.

spatiotemporal-mapping-motility-ex-vivo-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gastrointestinal Motilite izleyicisi ile kobay distal kolonda kolonik motilite değerlendirilmesi (Gimm), gastrointestinal sistem itici motilite kantitatif olarak değerlendirmek için öğrenmek için basit ve basit bir yaklaşımdır.

Gastrointestinal Motilite Monitör (Gimm)

Postoperatif ileus (POI) artmış morbidite ve uzamış hastanede kalış yol abdominal cerrahi bir komplikasyonudur. Profilaktik veya terapötik stratejiler yoğunlaştırılmış araştırma yokluğu nedeniyle gereklidir. Bu nedenle İÇN patofizyolojisi araştırmak ve olası tedavi seçenekleri incelemek için bir standart ve uygulanabilir fare modeli kurulmuştur.

Bağırsak Manipülasyon bir Standart Model Analizleri: Kemirgenler Barsak Motilite ve Gut Duvar İnflamasyon İşlevsel Değerlendirilmesi

Bu videoda, aktin-miyozin etkileşimlerini analiz etmek için bir in vitro motilite testi gerçekleştiriyoruz. Aktin filamentlerinin hareketsizleştirilmiş miyozin molekülleri üzerindeki kayma hareketi, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Ters Motilite Testi: İmmobilize Aktin Filamentleri Üzerinde Miyozin Hareketini Görselleştirmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Transgenik raportör fareler ve enjekte edilebilir floresan etiketler kullanarak, uzun süreli intravital eğirme diski konfokal mikroskobu, ApcMin/+ kolorektal kanser modelinde miyeloid hücre davranışının bağırsak adenomuna doğrudan görselleştirilmesini sağlar.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme Süm Min / + Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak duvarında bulunan ve bağırsak reflekslerini kontrol eden bir nöron ve glia ağıdır. Bu protokol, Ca2+ görüntüleme kullanılarak ENS'nin canlı preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini kaydetme yöntemlerini açıklar.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Bu makale, yetişkin farelerde kolonik motilitenin nöral regülasyonundaki değişiklikleri tanımlamak için bir video görüntüleme tekniği ve yüksek çözünürlüklü uzay-zamansal haritalamayı açıklamaktadır. Gastrointestinal (GI) fonksiyon üzerindeki ince etkiler, GI hastalığı hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için izole doku preparatlarında bu yaklaşım kullanılarak tespit edilebilir.

Video Görüntüleme ve Spatiotemporal Haritalar Fare Gastrointestinal Motilite Analiz

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca2 + görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca2 + sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller'de Ca sinyalleri2 + yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

İnce bağırsağın farklı boyutlardaki partikülleri nasıl işlediğini incelemek için, ince bağırsak geçişini belirlemek için yerleşik bir in vivo yöntemi değiştirdik.

Luminal Partiküllerin Murine İnce Bağırsak Mekanosenizasyonunun İncelenmesi

Öğrenin, GIMM sistemi kullanarak ex vivo bağırsaklarda hareketliliği zamanmekansal haritalama yöntemiyle görselleştirin. Bu teknik, ilaç etkilerini ve bağırsak duvarı hareketlerini incelemek için güçlü bir platform sunar.

Hareketliliği zamanmekansal Haritalama içinde

Daha fazla video keşfet