Hareketliliği zamanmekansal Haritalama içinde Ex Vivo Hazırlıklar

Ex vivo bağırsakların kapsamlı bir uzay-zamansal haritasını oluşturmanın genel amacı, bağırsak duvarının tüm segment boyunca ayrıntılı hareketini gözlemleyerek luminal içeriğe verilen yanıtı incelemektir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı doku segmentinin farklı bölgelerindeki aktivitenin kaydedilebilmesi ve uzay ve zaman içinde karşılaştırılabilmesidir, bu da basit kasılma veya gevşeme yerine karmaşık motilite modellerinin tanımlanmasına izin verir. Bu yöntem normal bağırsak motilitesi hakkında fikir verebilse de, besinler veya motilite paternleri gibi çeşitli ilaçların ve intraluminal ajanların etkilerinin tanımlanmasında da uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü başlangıçta uzay-zamansal haritaların yorumlanması zor olabilir. Ancak zamanla, karmaşık kalıpları bir bakışta ayırt edebilirsiniz. Başlamak için, ötenazi yapılmış bir kobaydan kolonu veya bağırsağı çıkarın.

Ilık Krebs çözeltisine sabitleyin. Diseksiyon tepsisinde, Krebs tamponunu lümen boyunca hafifçe perfüze ederek tüm intraluminal içeriği çıkarın. Künt uçlu bir katetere sahip bir şırınga kullanın ve perfüzyon sırasında kolon segmentini aşırı şişirmekten kaçının.

Daha sonra, çapı üç milimetre olan iki adet ateşle parlatılmış cam tüp kateterine iki, üç milimetre uzunluğunda polietilen boru takıldı. Isıtılmış bir diseksiyon tepsisinde, doku preparatının oral ucuna bir kateter yerleştirin ve bir cerrah düğümü kullanarak kateteri çevreleyen küçük boru parçasının arkasına bir dikiş bağlayın. Düğümün tam oturduğundan emin olmak için kateteri nazikçe geri çekmeye çalışın.

Küçük polietilen boru parçası, sütürün kaymasını önler. Dokunun aboral ucundaki diğer kateteri kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra mezenteri doku preparatından çıkarın.

Her iki kateter de sabitlendikten sonra, preparasyonu diseksiyon tepsisinden GIMM organ banyolarından birine aktarın ve dokuyu ağız ucu kullanıcıdan uzağa bakacak şekilde konumlandırın. Daha sonra, cam tüpün ucunu banyonun yan tarafına takarak veya kateterleri kameraları sabitlemek için kullanılan banyonun üzerindeki direklere takmak için plastik klipsler kullanarak modelleyici kil kullanarak cam tüp kateterlerini organ banyosuna sabitleyin. Şimdi her kateterin açık ucuna beş santimetrelik bir boru parçası takın.

Oral kateter için, kısa boru parçasını bir luer kilit eki ile daha uzun bir boru parçasına bağlayın. Ardından beş mililitrelik şırıngayı luer kilit bağlantısına bağlayın. Bu, doku preparatına tampon enjekte etmek için kullanılacaktır.

Aboral kateter için, luminal çıkışı bir toplama kabına yönlendirmek için boruyu kullanın. Şimdi, ekli şırıngayı kullanarak, aboral kateterden çıkan sıvıda görüldüğü gibi iyi bir akış olduğundan emin olmak için dokuyu ısıtılmış Krebs tamponu ile yavaşça yıkayın. Doku 30 dakika boyunca dengelenene kadar video kayıt sistemini kalibre ederek devam edin.

GIMM yazılımını kullanarak kamera yüksekliği yerleşimini, parlaklık ve kontrast için video ayarlarını ve yatay mesafeyi kalibre edin. Kameranın kalibre edilmesi için deney sekmesine tıklayın. Ardından Dosya menüsünde Kalibre Et'i tıklayın.

Video, kalibrasyon iş istasyonu penceresinde göründüğünde, kamerayı, görüntünün kolon lümenine yerleştirilen kateterlerin uçlarını içerdiği bir yüksekliğe ayarlayın. Ardından, her banyoya yapıştırılan yarı saydam cetvel etiketini kullanarak ekrandaki görüntüde görüntülenen yatay mesafeyi kalibre edin. Aynı kalibrasyon iş istasyonu penceresinde, kırmızı dikey yönergeleri birbirinden 10 milimetre uzakta olacak şekilde ayarlayın.

Ardından bu mesafeyi mesafe imlecinin penceresine yazın ve Cal düğmesine tıklayın. Ardından, doku segmentinin açık renkli bir arka plan üzerinde koyu bir siluet olarak görünmesini sağlamak için kalibre iş istasyonu penceresindeki kazanç, parlaklık ve deklanşör kaydırıcılarını ayarlayın. Ardından, görüntüyü daha da iyileştirmek için kameranın üzerindeki odak ve diyafram düğmelerini ayarlayın.

Görüntü kalibrasyonunu tamamlamak için, Kaydet'e ve ardından açılır ekranda Evet'e tıklayın. Son olarak, Çıkış'ı tıklayın. Yarım saatlik dengeleme süresinden sonra deneye başlayın.

Deneysel denemeyi adlandırmakla başlayın. Daha sonra, aboral kateterden çıkıntı yapan tüpün lümenini plastik kelepçe ile kapatın. Daha sonra proksimal kolonik lümene yaklaşık 7 mililitre Krebs tamponu enjekte edin.

Amaç, itici kasılmaları başlatmak için yeterli distansiyonu sağlamaktır. Segment luminal sıvı ile şişirildiğinde, video kaydını başlatın. Yazılımda, deneysel kamera görünümünü açmak için adlandırılmış deneme sürümüne çift tıklayın ve ardından kamera alanını görüntülemek için geçiş anahtarını açık konuma tıklayın.

Önceden belirlenmiş uzunlukta video verileri toplayın. Bu ilk kontrollü distansiyon denemesinin sonunda, doku segmentinin şişen sıvıyı lümenden dışarı itmesine izin vermek için kelepçeyi gevşetin veya çıkarın. Dokunun 10 ila 20 dakika boyunca yeniden dengelenmesine izin verildi ve ardından tedaviyi kullanarak işlemi tekrarlayın.

Tek bir doku hazırlığı, testler arasındaki uygun dinlenme süreleri için beş, 10 dakikalık tedavilerden geçebilir. Dokunun bozulmasına işaret eden mukozal dökülmenin farkında olun. kaydı analiz etmek için, bir ST haritasının oluşturulması için analiz penceresini açmak üzere belirli bir denemenin adına çift tıklayın.

Video oynatma alanında, görüntüyü analize uygun hale getirmek için kontrast ve parlaklık kaydırıcılarını ayarlayın. Açık renkli bir arka plan üzerinde siyah bir doku silueti oluşturun. Ardından, analiz için doku bölgesini izole etmek ve artefaktlar içeren alanları kaldırmak için video görüntü penceresindeki yatay ve dikey kırmızı yönergeleri ayarlayın.

Ardından analiz için zamanı ayarlayın. Başlangıç noktasını seçmek için yeşil A düğmesine tıklayın ve zaman kaydırıcısı doğru konumlarda olduğunda durma noktası için sarı B düğmesine tıklayın. Ardından, ST harita penceresini açmak için Motor Analizi sekmesini seçin ve ardından kronometre düğmesine tıklayın.

Dokunun siyah siluetinin içindeki artı işareti imlecine tıklayarak ST haritası oluşturmaya başlayın. Harita oluşturma işleminin tamamlanması birkaç dakika sürebilir. ST haritası oluşturulduktan sonra, görüntüyü büyütmek için yakınlaştırma özelliğini seçin.

Ardından, görüntüyü gri tonlama yerine renkli görmek için renk seçeneğini belirleyin. Ardından, imlecin analiz edilecek pikseli seçmek için kullanılabilmesi için etkinleştir'i seçin. Seçilen piksellerle ilişkili doku için, luminal çap üzerindeki değişim fazla mesai analiz edilir ve ST haritasının sağında bir tane çapı izlemesi olarak görüntülenir.

Analizlerden sonra Çıkış'ı seçin. Şimdi Dosya'yı ve ardından Verileri Dışa Aktar'ı ve ardından Meta Dosya'yı seçerek ST haritasını başka amaçlar için dışa aktarın. Dosyayı adlandırın ve Kaydet'e tıklayarak bir emf dosyası olarak kaydedin.

Bu teknikle oluşturulan haritalar, dokunun lümen çapındaki değişiklikleri hem mesafe hem de zaman içinde gösterir. Yatay mesafe X ekseni üzerindedir ve zaman Y ekseni üzerindedir, başlangıç zamanı üstte ve bitiş zamanı alttadır. Sağ üst köşede, minimum ve maksimum luminal çapların yanı sıra hem X hem de Y eksenleri için ölçeklendirmeyi gösteren bir gösterge bulunur.

Bu nedenle, gri tonlamalı görüntüdeki farklı piksel tonları, farklı luminal çaplara karşılık gelir. Daha koyu pikseller daha geniş çaplara karşılık gelir ve daha açık pikseller daha küçük çaplara karşılık gelir. Dairesel kasın kasılma dalgaları, luminal çaptaki azalmaya bağlı olarak daha hafif pikselleşme bölgeleri olarak görünecektir.

Buna karşılık, dairesel kas gevşemesi veya büyük bir sıvı bolusu nedeniyle luminal distansiyon daha koyu piksellerle gösterilir. Yayılan bir kasılma dalgalarının yanı sıra, segmentasyon olarak bilinen karıştırma motilite modeli de görselleştirilebilir. Aynı anda farklı alanlarda küçük durağan kasılmalar meydana gelir.

Fazla mesai, bu küçük kasılmalar aboral anal uca doğru hareket eder. Doku üzerinde kalan mezenter, koyu dikey çizgiler olarak ortaya çıkan artefaktlara neden olabilir. Bu yapay dikey çizgilerin yatay hareketi, uzunlamasına kas hareketinin zamanlamasını belirlemek için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, video kaydı için bağırsak segmentlerinin nasıl hazırlanacağını ve bağırsak hareketliliğinin sonraki temsilinin uzay-zamansal haritalar olarak nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, sindirimi ve emilimi kolaylaştırmak için doğal bileşenlerin spesifik motilite modellerini nasıl indüklediğini belirlemek için luminal çözeltiye farklı besinler eklenebilir. Nöral humoral ajanlar için spesifik farmakolojik agonistlerin veya reseptör antagonistlerinin kullanılması, motilitenin başlatıldığı ve yayıldığı mekanizmaları belirlemek için kullanılabilir.

Bu teknik, motilite bozukluklarının tedavisi için yararlı bileşiklerin belirlenmesi için yararlı verilerin üretilmesine yardımcı olabilir.