Baş-sabit Farelerde bıyık-sinyalini eyeblink Klasik Koşullanma

Bu protokolün genel amacı, öğrenme ve hafızayı incelemek için çevrilebilir bir paradigma olan göz kırpma koşullandırmasının nörobiyolojik temelini araştırmak için farelerdeki genetik ilerlemeleri ve bıyık sistemi hakkındaki anlayışımızı kullanmaktır. Bu yöntem, genetik olarak manipüle edilmiş farelerde kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyoloji kullanarak öğrenme ve hafızadaki mekanik soruları yanıtlamaya yardımcı olurken, koşullandırma sırasında belirli bıyıkları uyarabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farelerin silindirik bir koşu bandı üzerinde kendi hızlarında yürümelerine izin vererek, stresi en aza indirirken farelerin kafalarını sabitleme yeteneğidir.

Bu tekniğin etkileri, normal yaşlanma ve Alzheimer hastalığı ile ilişkili olanlar da dahil olmak üzere hafıza bozuklukları için potansiyel tedavilere kadar uzanır. Silindirin hazırlanması ve bıyık stimülasyon sisteminin her biri metin protokolünde ele alınmıştır. Bu bölüm başlığın hazırlanmasını kapsar.

Başlık şeridi, artık ticari olarak üretilmeyen Amphenol 221 serisi naylon şeritten modellenen 3D baskılı yedi delikli bir şerittir. 3D baskılı parçadan, şeritteki ilk deliğe 0-80 inç makine vidası ile hafifçe vurun ve ilk delikten sonra bir deliği boş bırakın. Ardından, bir mengene kullanarak, kalan beş deliğe beş altın kaplama pim yerleştirin.

Pimleri plastikteki daha dar deliklerden itin. Daha sonra, bir termal sıyırıcı kullanarak, yarım santimetre poliimid kaplamayı soyun. Ardından, soyulmuş ucu, pimin bir açıklığı olan pimlerden birine lehimleyin.

Lehimli teli altı ila yedi milimetre arasında kesin ve telin yaklaşık iki milimetresini soyun. Şimdi, beş pime toplam dört kablo bağlamak için bu işlemi tekrarlayın. İlk iki tel göz kapağı EMG yanıtlarını kaydederken, ikinci ikisi periorbital bölgeye elektriksel stimülasyon sağlayacaktır.

Beşinci pime, elektrik topraklaması görevi görmesi için yalıtımsız beş santimetre paslanmaz çelik bir tel lehimleyin. Tüm bağlantıları yaptıktan sonra, elektriksel sürekliliklerini sağlamak için her birini bir multimetre ile kontrol edin. Bir ayak parmağı tutamıyla onaylanan tamamen anestezi uygulanmış bir hayvanla başlayın.

Analjezik olarak bir doz buprenorfin hidroklorür enjekte edin. Daha sonra kornealara az miktarda oftalmik merhem sürün ve hayvanın başının üst kısmını tıraş edin. Daha sonra, hayvanın kafasını stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin ve kafa derisini üç alternatif povidon iyot ve alkol fırçası ile dezenfekte edin.

10 veya 15 numaralı neşter bıçağıyla, kafa derisinin orta hattı boyunca bir kesi yapın ve kafatasını gözlerin önünden interparietal kemiği geçecek şekilde açığa çıkarın. Derinin kanatlarını altı mikroklipsle geri çekin, yanlar ve sırt da dahil olmak üzere kafatasının mümkün olduğunca çoğunu açığa çıkarın. Ardından, kafatasındaki periostium'u kazımak için neşteri kullanın.

Ardından kafatasının üst kısmını üç kez% 3 hidrojen peroksit ile temizleyin. Kafatası kuruduktan sonra, beyne zarar vermemeye dikkat ederek 34 numara ters koni frezi ile iki delik açın. Bir deliği bregmanın önüne yerleştirin ve diğer deliği lambdanın önüne, sağ gözü şartlandırırken orta hattın soluna yerleştirin veya tam tersi.

Bu delikler vidaların oturması için dikkatli bir şekilde açılmalı ve beyne zarar vermemek için büyük çaba sarf edilmelidir. Deliklere, elektrik bağlantıları için vidaları yerleştirin. Her tam dönüş vidayı 0,28 milimetre alçaltacaktır, bu nedenle iki tam tur yeterlidir.

Daha sonra, çimentonun yüzey alanını artırmak için kafatası üzerinde birkaç küçük divit oluşturun. Tamamlanan başlıktan, topraklama kablosunu iki vidanın etrafına sekiz şeklinde bir konfigürasyonda sarın. Başlığın düzgün bir şekilde yerleştirilebilmesi için topraklama kablosunda biraz gevşeklik bırakın.

Şimdi, soğuk yapıştırma çimentosu uygulayın. Kafatasını ve vidaları bolca kaplayın ve çimentonun kurumasını bekleyin. Çimento kuruduktan sonra, başlığı, pimler kafatasının üzerinde duracak şekilde dikey olarak konumlandırın.

Başlığı, çerçeveden bir kola takılı bir tutucu ile sabitleyin. Tutucunun, başlığın pimlerini kabul edebilmesi için beş adet altın kaplama sokete sahip olması gerekir. İki EMG telini göz yuvasının üzerindeki muscularis orbicularis oculi üzerine yerleştirin.

Ardından, iki uyarıcı kabloyu konumlandırın. Soyulmuş uçları derinin altına, iki ila dört milimetre doğrudan göze kaudal olarak yerleştirin. Uçlarının birbirine değmesine izin vermeyin.

Teller hayvanın gözünü çizebilecek kadar uzunsa, onları geriye doğru kesin veya geriye doğru bükün. Bazı çıplak teller açıkta kalmalıdır. Şimdi, tellerin tabanını kafatasına biraz daha yapıştırma çimentosu ile yapıştırın ve kurumasını bekleyin.

Daha önce kullanılan hacmin yaklaşık yarısını kullanın. Devam etmek için mikroklipsleri çıkarın ve cildi yeniden konumlandırın. Göz kapağını bozacak, göz kırpmayı engelleyecek ve böylece deneyi mahvedecek cilt üzerindeki gerginliği önlemek için cildin doğal olarak yerleşmesine izin verin.

Cilt yerleştikten sonra, başlık tutucusunu çıkarın ve açıkta kalan alanı diş çimentosu ile kapatın. Gözlere veya başlığın pimlerine çimento damlatmaktan kaçının. Ardından, kısmen kürlenmiş çimentoyu gerektiği gibi düzleştirmek ve manipüle etmek için diş çimentosu çözücüsü ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanın.

Çimento tamamen kuruduktan sonra, hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve ev kafesine geri koymadan önce ılık bir yüzeyde iyileşmesine izin verin. En az beş günlük iyileşme süresi geçirdikten sonra fareleri alışkanlık haline getirmeye başlayın. Fareyi sabitlemek için, omuzlarının arkasına sıkıştırmak için kuyruğundan kısa bir süre tutun.

Ardından fareyi karın ve gövdenin altından kaldırın. Ardından, başlığa bir konektör takın ve kilitleme vidasını çevirin. Ardından, fareyi yavaşça silindirin üzerine yerleştirin ve konektörü silindirin üzerindeki çubuklara sabitlemek için iki vida kullanırken sabit tutun.

Ardından fareyi bırakın. İlk iki seansta, farenin bir kondisyon seansı ile aynı süre boyunca silindire alışmasına izin verin. Alışkanlık sırasında, spontan göz kırpma oranını kaydedin.

Ayrıca, elektrik stimülasyonu uygulamadan fareleri bıyık titreşim uyarıcısına önceden maruz bırakın. Piezo sistemi şartlandırılmış tarafa yakınken, tarağın dişlerini tek tek bıyıkların üzerinden geçirin. Her seans için aynı bıyıkları seçin.

Daha sonra metinde sunulduğu gibi klasik kondisyon eğitimine devam edin. Sekiz ila on haftalık erkek C57 Black 6J fareler, başa sabitlenmiş silindirik koşu bandında iz göz kırpma koşullandırması ile eğitildi. Her çalışmanın EMG kayıtları alındı.

EMG'ler rektifiye edildi ve 10 milisaniyelik bir zaman sabiti ile entegre edildi, daha sonra tüm denemelerde ortalaması alındı. 10 eğitim seansı boyunca koşullu tekrarların evrimi, yanıtın kademeli olarak genlik olarak büyüdüğünü ve yanıt gecikmesinin kısaldığını göstermektedir. Bu evrim, uyaranların rastgele sırayla sunulduğu psuedoconditional farelerden gelen yanıtlarda görülmez.

İyi zamanlanmış ve dolayısıyla iyi öğrenilmiş koşullu yanıtların evrimi, CS başlangıcını takiben yanıtın zirvesine kadar geçen sürenin histogramlarında da görülebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kafaya sabit göz kırpma koşullandırması için başlığı nasıl hazırlayacağınızı, başlığı bir fareye cerrahi olarak nasıl implante edeceğinizi ve fareyi silindirik koşu bandına nasıl yerleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Fareleriniz, kondisyonu edinirken günler boyunca iyi bir öğrenme eğrisi sergilemelidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hayvanlardan kaynaklanan herhangi bir sıkıntıyı gözlemlemek için tetikte olmayı unutmamak önemlidir. Hayvanların stresini en aza indirmek için uygun adımlar atılmalıdır.