Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Bu tekniğin genel amacı, standart ışık mikroskobu kullanarak karakteristik hücre substrat etkileşimlerinden gelen kuvvetleri görselleştirerek izole edilmiş tek hücrelerden mekanik biyolojik olarak ilgili özellikleri toplamaktır. Sunulan yöntem, mekanobiyoloji için bir platform teknolojisidir. Kanser hücresi metastazında hücre kasılmasının rolü gibi kanser araştırmalarındaki temel soruların araştırılmasına yardımcı olabilir.

Tekniğin en büyük avantajları, çok az kullanıcı eğitimi ile nörobiyolojik bilgileri sağlam bir şekilde çıkarmasıdır. Standart ışık mikroskobu ile uyumludur ve yüksek verime yöneliktir. Üçüncüsü, bu yöntem insan kemik kanseri hücrelerinin mekanik biyolojik özellikleri hakkında bilgi sağlar.

Düz kas hücreleri veya kardiyomiyositler gibi oto hücre tiplerine de uygulanabilir. Cam alt tabakayı, mikro direk dizisi 12 Kuyulu bir plakanın kuyusuna bakacak şekilde yerleştirerek başlayın, böylece alt tabaka kaplanacak şekilde kuyuya dolaylı olarak bir mililitre% 99 etanol ekleyin. Herhangi bir sıvı işleme adımı sırasında kabarcık oluşumu olmadığından ve mikro direk dizisinin her zaman ince bir sıvı tabakası ile kaplandığından emin olun.

Daha sonra, kuyu kenarına bir mililitre steril deiyonize su eklemeden önce diziyi oda sıcaklığında 20 ila 30 saniye inkübe edin. Etanol ile karıştıktan sonra, kuyudan yaklaşık bir mililitre etanol çözeltisi aspire edin ve bir mililitre daha deiyonize su ekleyin. Numuneyi ıslatmak için bu işlemi en az üç kez tekrarlayın.

Daha sonra, kuyudaki deiyonize suyu, üç tekrar için bir seferde yaklaşık bir mililitre ekleyerek ve ardından aspire ederek aynı şekilde PBS ile değiştirin. Ardından, PBS'yi orta ile değiştirmek için aynı işlemi kullanın. Artık dizi yaklaşık bir mililitre orta pipet ile kaplandığına göre, 25.000 ilgili hücreyi bir mililitre ortamda hazırlanmış bir mikro direk dizisi ile kuyuya pipetleyin.

Daha sonra çok kuyulu plakayı kapatın ve 37 derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre aktarın. Hücrelerin altı ila yedi saat boyunca mikro direklerin üzerine yapışmasına ve büyümesine izin verin ve yapışma sürecini inceleyin. Bazen bir ışık mikroskobu kullanarak, ortamı kuyudan aspire edin ve ardından hücreleri bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

İnkübasyon sırasında mikro post dizisi üzerinde biriken hücre kalıntılarını temizlemek ve ölü hücreleri ayırmak için PBS ile yıkarken hafif kuvvet uyguladığınızdan emin olun. Daha sonra, hücreleri sabitlemek için beş dakika boyunca 0,5 mililitre %3,7 tamponlu formaldehit çözeltisi ekleyin. Daha sonra formaldehit çözeltisini çıkarın ve mikro direk dizisini bir mililitre steril deiyonize su kullanarak iki kez yıkayın.

Her yıkama için, sabit hücreleri yaklaşık 90 saniye boyunca% 50 su,% 40 etanol ve% 10 asetik asit içinde% 0.05 kumasi parlak mavi boya ile kaplayın, fazla boyama solüsyonunu bir mililitre steril deiyonize suda iki durulama ile yıkayın. Daha sonra mikro post dizisine bir mililitre deiyonize su ekleyin ve boyama sonucunu ışık mikroskobu altında kontrol edin. Bir cımbız kullanarak ince cam tabanlı bir Petri kabına iki mililitre deiyonize su ekleyerek başlayın, mikro direk dizisini 12 oyuklu plakadan bir mikro direk yukarı bakacak şekilde görüntüleme kabına aktarın.

Ardından görüntüleme Petri kabını bir ışık mikroskobunun hareketli tablasına yerleştirin. Mikroskop optiği sonsuz düzeltmeli değilse, görüntüleme için kullanılan merceğin dengeleme halkasını, ölçekteki sayı optik yol boyunca tüm malzemelerin toplam kalınlığını temsil edene kadar çevirin. Ardından, normal parlak alan modunu etkinleştirmek için optik yoldaki tüm yüz kontrast halkalarını çıkarın ve ardından aydınlatma tarafındaki irisi %50'ye kadar azaltın Petri kabını, dizinin mikro direkleri gözlem alanı boyunca yatay veya dikey bir çizgi oluşturacak şekilde hizalayın.

Sol üstte bir başlangıç noktası tanımlayın ve Petri kabını sahne alanı boyunca adım adım hareket ettirin. 20 x veya 40 x objektif ile çok sayıda yüksek çözünürlüklü görüntü çekerken mikro direk dizisini tarama. Her yeni konumda her görüntünün merkezinde tek bir hücre olmasını hedefleyin.

Uç odakta olana kadar ZX'ler boyunca mikro direk altından mikro direk ucuna doğru süpürün. Mikroskoptan ince ayar çarkını kullanma. Ardından odak düzlemini mikro direk tabanına doğru iki ila üç mikron indirin.

Yazılım mec'ini, profil oluşturucuyu yükleyerek ve aç'a tıklayıp görüntüleri seçerek analiz edilmesi gereken bir dizi görüntüyü yükleyerek başlayın. Ardından, ayar bölümüne gidin ve yazılım kılavuzunda belirtildiği gibi parametreleri girin. Ardından görüntüleri tek tek analiz edin.

Kırpma düğmesini seçerek başlayın ve ardından ilgilenilen alanın etrafında dikdörtgen bir anahat oluşturmak için tıklayıp sürükleyin. Bitirdiğinizde, eylemi bitirmek için çizilen dikdörtgenin içine çift tıklayın. Ardından, hücre taslağı çiz'i seçin ve görüntüdeki görünür hücre tarafından kapsanan tüm mikro gönderilerin etrafına bir anahat çizmek için artı imlecini kullanın.

Gönderileri atmak için üzerine tıklayarak istenmeyen mikro gönderileri atın ve çizim için artı imlecini kullanın. Ardından, görüntü bölümünün dışındaki bir hücreye ait olan veya başka herhangi bir nedenle saptırılan, ancak ilgilenilen hücre tarafından saptırılmayan tüm mikro gönderileri içine alın. Ardından, yazılım alt yordamını başlatmak için OID'leri Bul'a tıklayın.

OID'leri bul düğmesinin hemen yanındaki filtre ayarını, ortalarında bir Kızıl Haç ile görünür hale getirilen tüm mikro gönderiler kaydedilene kadar ayarlayın. Birden fazla veya kaçırılmış mikro gönderi konumu varsa, manuel düzenlemeye tıklayarak manuel düzenleme işlevini kullanın ve söz konusu mikro gönderiyi seçmek için farenin artı işaretini kullanın. Dikdörtgenin içine çift tıklayın ve büyütülmüş görüntü bölümüne otomatik olarak kapanan tek bir kırmızı işaretçi yerleştirin.

Bir fare tıklamasıyla ızgara oluşturma işlevini etkinleştirerek ideal mikro direk ızgarasını bulun. Konumun, çizilen hücre anahat çizgisinin içinde mavi bir halka ile gösterilen gerçek mikro direk kafasına karşılık geldiğinden emin olun. Ardından, gerektiğinde hücre alanı içinde yanlış yerleştirilmiş ızgara işaretçilerini düzeltin.

Bir fare tıklamasıyla ilgili manuel düzenleme işlevini kullanarak, mikro gönderme sorusunu tıklayıp sürükleyerek seçmek için artı işaretini kullanın. Görünen dikdörtgenin içine çift tıklayın ve düzeltilmiş mavi işaretçiyi otomatik olarak kapanan büyütülmüş görüntü bölümüne yerleştirin. Ardından, görüntü bölümündeki bir mikro direk konumu ile oluşturulan ideal ızgara arasındaki farka dayalı olarak hesaplanan sapma değerlerinin histogramını almak için sapmaları hesapla'ya tıklayın.

Son olarak, değer tabloları da dahil olmak üzere analizin tamamını kaydedin. Başka bir görüntü bölümünü analiz etmek için görünümü sıfırla'ya tıklayarak veya bir sonraki görüntü gösterisine tıklayarak görüntü analizine devam edin. Gösterilen. Burada, düşük metastatik potansiyele sahip iki kemik kanseri hücre hattı Q oh dokuz hücre ve yüksek metastatik M 132 hücrelerinin aynı üretim partisinden bir yükseltme üzerine oturtulmasına bir meno profili verilmiştir.

Sonuç, kuvvet değerlerini kategorize ederek, Q oh dokuz hücresinin, yüksek metastatik hücrelere göre bağlanma noktalarında daha fazla kuvvet uygulama eğiliminde olduğunu göstermektedir. Hücre alanı ile ilgili olarak, hücre başına ortalama kuvvetin M 132'ye kıyasla huo dokuz hücre için daha yüksek olduğu bulunur. Ayrıca, mikro direk başına ortalama kuvvet, post başına ortalama kuvvet daha kararlı bir değere ulaşana kadar hücreler yayıldıkça artar.

Morfolojik varyanslardaki farklılıkların yanı sıra ilginç sonuçlarla da ölçülebilir. Örneğin, daha az mikro post işgal etme eğiliminde olan yüksek metastatik M 132 hücrelerinin aksine, HU oh dokuz hücreleri, mikro post kapsamı açısından daha heterojen bir profil sunar. Kısacası, ebeveyn hücre hattı HU oh nine için Meno profili, tipik olarak daha fazla alanı kapladıklarını ve mikro direklere biraz daha fazla kuvvet uyguladıklarını ortaya koymaktadır.

Metastatik hücre hattı M 132 ve agresif hücre tipi ise karakteristik olarak daha az mikro direği kaplar ve mikro direk başına daha az kuvvet uygular. Bu prosedürü gerçekleştirirken, çok dikkatli bir şekilde borulamayı ve asla doğrudan mikro direk dizisine geçirmemeyi unutmamak önemlidir. Mikro direklerin çökmesine neden oldukları için herhangi bir baloncuk oluşturmaktan kaçının.

Bu videoyu izledikten sonra, ağ profilimiz veya yazılımımızla birlikte mikro post Aries kullanarak izole edilmiş tek hücrelerden meno biyolojik bilgilerinin nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız. Sonuçlarınızın tadını çıkarın.