Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

Bu prosedürün genel amacı, mezcal kanalları işlevsel olarak bir damlacık arayüzüne, çift katmanlı sisteme yeniden oluşturmak ve bu mekano-duyarlı kanalların harmonik mekanik uyaranlara tepkisini incelemektir. Bu yöntem, V 23 T mescal mutantının, katman sistemi ile bir damlacık arayüzüne yeniden yapılandırıldıktan sonra harmonik mekanik uyarıma yanıt olarak mekanik elektriksel aktivitesinin incelenmesini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, hem yama kelepçesi tekniğinin hem de damlacık arayüzünün teknik avantajlarını, minyatürleştirilebilme kabiliyetinin yanı sıra zarın her iki tarafının kimyasal bileşimini kontrol etme kabiliyeti ile katman yoluyla

Lipozomları formüle etmek için, liyofilize toz olarak satın alınan 20 miligram D-P-H-P-C sentetik lipidlere 10 mililitre potasyum klorür tamponu ekleyerek mililitre lipid çözeltisi başına iki miligram 10 mililitre hazırlayın. Hem lipit araçlarının hem de tampon çözeltisinin iyice karıştırıldığından emin olun. Her şey çözüldüğünde karışım homojen ve puslu görünmelidir.

Karışımı eksi 20 santigrat derecede dondurun, şimdi yeni lipit karışımını tamamen çözün ve karışımın ısıtılmış bir ortamda değil, oda sıcaklığında çözülmesine izin verin. Toplam altı donma çözülme döngüsünden sonra, tüm lipid süspansiyonunu önce 0,4 mikronluk bir polikarbonat membran filtreden ve ardından altı kez 0,1 mikronluk bir membran filtreden geçirerek lipitleri ekstrüde etmek için ticari olarak temin edilebilen bir ekstrüder kullanın. Bu işlem, 100 nanometreye yakın çaplara sahip parçacıklar verir.

Yağ rezervuarını üretmek için, iki inç çapında, 1,5 santimetre uzunluğunda akrilik silindirin duvarından karşılıklı iki delik açın. Delikler bir milimetre çapında ve alttan bir santimetre uzakta olmalıdır. Ardından, daha önce delinmiş bir milimetrelik deliklere eş merkezli iki adet dört milimetre delik açın.

Deliklerin derinlikleri her biri bir milimetre olmalıdır. Onları tamamen delmemeye dikkat edin. Bu delikler lastik contalara uyacak şekilde yapılmıştır.

Yağın sızmasını önlemek için daha büyük deliklere bir milimetre iç çapa sahip iki lastik conta yerleştirin ve yapıştırın. Daha sonra, deney gününde herhangi bir çok amaçlı epoksi kullanarak makineyi 10 santimetreye 10 santimetre inceliğinde bir akrilik levhaya silindire yapıştırın, yedi santimetre uzunluğunda 2 250 mikron çapında gümüş teller kesin ve ardından uçlarını iki saat boyunca çamaşır suyuna batırın. Bir gümüş klorür kaplama oluşturmak için gri bir renk, bir gümüş klorür kaplamanın oluştuğunu gösterir.

Bir cam kesici kullanarak, bir milimetre dış çapa sahip 10 santimetre uzunluğunda ödünç alınan silikat cam kılcal damarı ve 58 milimetre iç çapı iki beş santimetre kılcal damara bölün. 18 gauge künt uçlu iğneli bir mililitrelik şırınga kullanarak, hidratlı hidrojelin kılcal damardan şişmesini önlemek için kılcal damarları P-E-G-D-M-A hidrojel ile doldurun. Uçlarda üç milimetre boşluk bırakın ve kılcal damarlarda hava kabarcığı olmadığından emin olun.

Gümüş, gümüş klorür elektrotlarını hidrojel dolu kılcal damarlara yerleştirin. Bir ultraviyole nokta kullanarak bir watt'ta iki dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz kaldıktan sonra serbest radikal fotopolimerizasyonu yoluyla P-E-G-D-M-A hidrojelini sertleştirin, deney, yama üzerindeki bir toprak bağlantısına topraklanmış bir faraday kafesi altında kurulur. Mikro pipetlerden birini, erkek konektörü olan düz bir mikro elektrot tutucusuna takın.

Ardından mikro elektrot tutucuyu yama amplifikatörünün baş aşamasına bağlayın. Kafa aşamasını toprağa bağlamak için, 18 gauge yalıtımlı bir bakır kabloyu baş aşaması için uygun bir konektöre lehimleyin, önce kafa aşaması montaj plakasını mikro manipülatöre takarak kafa aşamasını üç eksenli bir manuel mikro manipülatöre monte edin ve ardından kafa aşamasını montaj plakasına bağlayın. Uygun vidaları kullanarak, ikinci mikro pipeti laboratuvar yapımı bir konektör aracılığıyla doğrusal aktüatöre takın ve ardından her ikisini de ikinci bir mikrom manipülatöre monte edin.

Mikro pipetler birbirine karşı, hizalı ve yatay olarak hizalanmış olmalıdır. Daha sonra bir cam şişede 0.1 mililitre D-P-H-P-C lipozomlarını 0.01 mililitre V 23 T mescal protea lipozom çözeltisi ile karıştırın. 34 gauge mikro doldurma iğnesi kullanarak, her iki mikro pipetin uçlarını bir proteozom solüsyonu ile doldurun.

Rezervuarı dik bir mikroskobun üstüne yerleştirin ve mikro pipetleri karşılıklı bir milimetrelik deliklerden besleyin. Ardından, mikropipetlerin ucunda küresel damlacıkları oluşturmak için rezervuarı yüzeye kadar hexa dekan ile doldurun. Seyreltilmiş V 23 T mescal protea lipozom solüsyonunu mikro pipetlerin uçlarına dağıtmak ve damlacıkları oluşturmak için üçüncü bir mikrom manipülatöre monte edilmiş 10 mikron çapında üçüncü bir bo silikat cam mikro pipet kullanın.

Hacmi istediğiniz gibi azaltarak veya artırarak damlacıkların boyutunu kontrol edin ve tek tabakaların tamamen oluşması için 10 dakika dinlendirin. Ardından damlacıkları katman katman temas ettirin. Oluşum bir ila iki dakika içinde gerçekleşecektir.

Yazılımı ve ekipmanı metin protokolünde açıklandığı gibi kurduktan sonra, bir dalga biçimi üretecinin çıkışını harici komut girişi ön anahtarına bağlamak için bir BNC kablosu kullanın. Baş aşamasına 10 hertz, 500 milivoltluk bir tepe tepesi üçgen dalga formu gönderin. Mikrom manipülatörünü kullanma.

Damlacıkları hafifçe temas edene kadar temas ettirmek için cam mikro pipetleri yatay olarak hareket ettirin ve iki katmanlı incelmenin gerçekleşmesini bekleyin. İki tabaka oluşum sürecinin ilerlemesi mikroskop aracılığıyla görsel olarak görülebilir ve akım ölçümü ile izlenebilir. Manipülatör kullanılarak aktüatör üzerine monte edilen damlacığın konumunu kontrol ederek iki katman boyutunu yaklaşık 250 mikron çapa ayarlayın, iki katman boyutu mikroskop aracılığıyla görsel olarak tahmin edilebilir.

Çift tabaka oluştuktan ve stabil hale geldikten sonra, çift tabakaya dahil olan meskal proteinini uyarmak için bir fonksiyon üreteci kullanarak sinüzoidal bir sinyal göndererek damlacıkları uyarın. Pieto elektrik sunucu denetleyicisine 175 mikron tepeden tepeye genlik, 0.2 hertz frekansı ve %50 görev döngüsüne sahip sinüzoidal bir dalga formu gönderin. Alışılmadık gerçek zamanlı akım kaydı burada gösterilir.

Çift tabakanın ölçülen kapasitansı aniden artar, bu da sabit bir duruma ulaşmadan önce iki katmanlı incelme ve oluşumu gösterir. Çift katman, zar boyunca sabit bir DC potansiyeli korunurken DIB mekanik olarak uyarıldığında damlacıkların konumu değiştirilerek kontrol edilebilir. Mezcal'ın V 23 T mutantı, esas olarak alt iletken durumlar ve bazen tam açılış olayları dahil olmak üzere güvenilir aktiviteler üretir.

Geçitleme, esas olarak tepe sıkıştırmada meydana gelir, bu da kutupsal çizimde gösterildiği gibi iki tabaka gerilimindeki bir artışla ilişkili olduğunu gösterir. Burada, bu tekniğin diğer biyomolekül türlerini test etmek için kullanılma yeteneği burada vurgulanmaktadır. Voltaj kapılı bir iyon kanalı olan ethin, bir DC transmembran potansiyeli One master'ın uygulanması üzerine membran geçirgenliğini arttırır.

Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulanırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, cam kılcal damarları veya başka bir şekilde kazara kırmamayı unutmamak önemlidir. Kurulumu yeniden başlatmanız ve geliştirildikten sonra tüm kabloların bağlı olduğundan emin olmanız gerekir.

Bu teknik, gerdirme ile aktive edilmiş kanallar alanındaki araştırmacıların, dış kuvvetlerin DİB gömülü mekanizmasına duyarlı kanalların kapısına iletilebileceği yeni yöntemleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, katmanlar halinde damlacık arayüzünün nasıl oluşturulacağını, yapay zarlara mekano-duyarlı kanalların nasıl dahil edileceğini ve bu kanalların mekanik olarak nasıl uyarılacağını iyi anlamış olmalısınız.