Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bu prosedürün genel amacı, optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi yoluyla Arabidopsis diliana bağışıklık tepkisini kantitatif olarak karakterize etmektir. Bu, ilk olarak, bakterileri sada adı verilen doğal açıklıklardan yaprağa manuel olarak iletmek için şırınga sızması kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci adım, hastalık semptomlarının gelişmesinden sonra enfekte olmuş yaprak dokusunun disklerini elde etmektir.

Daha sonra, bakteriler yüksek verimli homojenizasyon yoluyla yaprak disklerinden ekstrakte edilir. Son adım, kolonileri numaralandırmak için bakteri sayma plakaları üzerine seri seyreltme ve lekelenmedir. Sonuç olarak, her bir yaprak dissi içindeki bakteri üremesi, bitki bağışıklık tepkisinin nispi gücü ile ilişkilendirilebilir.

Bu yöntem, biyotik strese karşı savunma tepkilerine katkıda bulunan genlerin belirlenmesi gibi bitki bağışıklığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin mevcut yönteme göre ana avantajı, enfekte olmuş bitki dokusundaki patojen büyümesinin kesin olarak ölçülmesine izin vermesi ve çeşitli gelişim durumlarına sahip yaprakların örneklenmesinin neden olduğu deneysel hataların önlenmesine yardımcı olmasıdır. Bu yöntem, virülan bir bakteriyel patojen ile bir enfeksiyona karşı bitki bağışıklık tepkisi hakkında bilgi sağlayabilir ve ayrıca salisilik asit veya mikropla ilişkili moleküler modeller gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bakterileri doku hasarı olmadan yaprağa vermekle mücadele edeceklerdir. Aşağıdaki prosedürü gösteren doktora sonrası bilim adamı Hindu ve yüksek lisans öğrencileri shalu ve yali olacaktır. Yakında laboratuvarımdan, gelişmiş hastalık duyarlılığı testi bu videoda gösterilecektir.

Deneyden önce, King'in B veya KB medya plakalarını hazırlayın, protokol metninde açıklandığı gibi bir litre KB katı ortam yapın ve manyetik bir karıştırma plakası üzerinde soğumaya bırakın. Ortam, ortama% 80 gliserol, bir molar magnezyum sülfat ve streptomisin ile temas edecek şekilde soğutulduğunda, iki farklı boyutta KB ortam plakası dökün. Daha küçük Petri kabı, birincil bakteri kültürü plakası olarak işlev görür ve daha büyük evcil hayvan Petri kabı, bakteri sayma plakası olarak işlev görür.

Plakaları tahlil çizgisinden iki gün önce dört santigrat derecede saklayın. PSM ES 43 26. Negatif 80 santigrat derece gliserolden gelen bakteriler bir KB streptokok bakteri kültürü plakasında stoklanır ve ertesi gün 24 ila 48 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edilir.

Sıvı kültürü, mililitre streptomisin başına 50 mikrogram içeren dört mililitre sıvı kb ortamı ile steril bir test tüpünde başlatın. Gece boyunca 28 santigrat derecede 250 RPM'yi sallayın. Deney için Arabidopsis bitkileri, sıvı bakteri kültürünün başlatıldığı gün protokol metninde ayrıntılı olarak açıklanan koşullar altında yetiştirilir.

Örnekleme sırasında enfekte dokunun kolay tanımlanması için beş ve altı numaralı yaprakların yapraklarını künt ve su geçirmez bir işaretleyici ile işaretleyin. STA'nın açılmasını arttırmak ve patojen çözeltisinin yaprak suyuna girişini kolaylaştırmak. Düzlüğü alttan 20 dakika ıslatarak bitkileri iyice temizler.

20 dakika sonra fazla suyu boşaltın. Arabidopsis bitkilerinin enfeksiyonu gerçekleştirilir. Sıvı kültürün başlamasından sonraki gün.

Bakteri kültürünü 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve iki dakika boyunca 9.600 Gs'de döndürün. Oda sıcaklığında, süpernatanı atın ve bakteri peletini bir mililitre steril 10 milimolar Magnezyum klorür ile yeniden süspanse edin, bakteri süspansiyonunu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde dokuz mililitre 10 milimolar magnezyum klorür ile seyreltin. Bakterilerin optik yoğunluğunu ölçtükten sonra, bakterileri 10 milimolar magnezyum klorür ile 0.0002'lik son OD 600'e seyreltin.

EDS enfeksiyon testi için. Sızma için yaygın olarak insülin şırıngası olarak bilinen bir mililitre künt uçlu iğnesiz şırınga kullanılır. Sızma işlemi sırasında çok daha iyi kontrol için şırıngayı 0,5 ila 0,6 mililitre seyreltilmiş bakteri çözeltisi ile doldurun, şırıngayı tam kapasitesine kadar doldurmayın.

Yaprağın alt yüzeyini işaret parmağının üst kısmında ortaya çıkarın ve ardından başparmağın yardımıyla yaprak konumunu nazikçe ayarlayın. Yaprak hasarını azaltmak için basıncın eşit dağılımını sağlamak için şırıngayı yaprak yüzeyine dikey olarak yerleştirin. Sızma sırasında orta bölgeden kaçınmaya çalışın.

Bakteriyel çözeltiye sızmak için pistonu yavaşça itin. Yaprak mezofiline sıvı girişi, daha koyu yaprak rengiyle gösterildiği gibi görselleştirilecek, birden fazla deneme gerektirse bile yaprağın tüm yüzeyine sızacaktır. Sızma tamamlandıktan sonra, ekstra patojen solüsyonunu çıkarmak için yaprağı emici doku ile nazikçe kurulayın.

Enfekte olmuş yaprak dokusunda hasar olup olmadığını görsel olarak inceleyin. Sızan bitkileri bir ila iki saat kurumaya bırakın, bitkileri orijinal büyüme koşullarına geri döndürün. Berrak bir kubbeye su püskürtün ve enfekte olmuş bitkileri iki saat boyunca örtün.

Ardından, iki ila üç inçlik bir açıklık oluşturmak için kubbeyi kırın ve genellikle üç gün olan enfeksiyon deneyinin geri kalanı boyunca açık bırakın. Patojen büyümesini ölçmeden bir gün önce. 150 milimetreye 15 milimetre KB ortam plakalarını önceden kurutun.

Plakaları yaklaşık 24 saat oda sıcaklığında tutarak kurutun. Enfekte olmuş dokuyu, duyarlı genotiplerde enfekte dokunun sararması ile gösterilen skleroz ortaya çıktıktan sonra, ancak nekrotik lezyonların gelişmesinden önce işleyin. Her genotip için altı öğütme tüpü hazırlayın.

Bir paslanmaz çelik öğütme bilyesi yerleştirin ve her tüpe 500 mikrolitre steril, 10 milimolar magnezyum klorür ekleyin. Daha sonra, enfekte olmuş yaprağı bitkiden ayırın ve rastgele forseps kullanarak tek delikli bir kağıt zımbası ile bir yaprak diski delin, iki farklı bitkiden iki yaprak diskini her bir öğütme tüpüne yerleştirin. Tüpleri kapatın, dokuyu yüksek verimli bir homojenizatör ile 10 dakika boyunca maksimum hızda homojenize edin.

Gerekirse bu işlemi, doku iyice homojenize olana ve beklerken enfekte olmuş yapraklardan klorofil salınımı nedeniyle çözeltiler yeşile dönene kadar tekrarlayın. Homojenizasyon için, 96 kuyulu bir kültür plakasının ilk altı sırasındaki her bir kuyucuğu 180 mikrolitre 10 milimolar magnezyum klorür ile doldurun. 20 mikrolitre öğütülmüş doku süspansiyonunu 96 oyuklu plakanın ilk sırasının her bir oyuğuna aktarın ve sıvıyı tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Küçük doku parçaları ucu tıkadıysa, plakanın üstündeki damlacık için yeterli alan sağlamak üzere çözeltinin doğru hacmini elde etmeye yardımcı olmak için iki ila üç milimetre kırpın, dokuyu alternatif sıralar halinde farklı genotiplerden ayırın. On kat seri seyreltme hazırlamak için, 20 mikrolitre doku süspansiyonunu ikinci sıraya aktarın ve altıncı seyreltmeye kadar bu işlemi tekrarlayın. Bölünmüş pipet uçlarını kullanarak, 96 duvar plakasından 20 mikrolitre çözeltiyi 150 milimetreye 15 milimetre KB plakaya aktarın.

En seyreltik süspansiyondan en konsantre olana kadar çalışın, bu nedenle seyreltme arasında pipet uçlarını değiştirmek gereksizdir. Plakayı, kapağı çatlamış olarak oda sıcaklığında kurutun. Plaka yüzeyinde daha fazla sıvı gözlenmediğinde, kapağı ters çevirin ve plakayı oda sıcaklığında inkübe edin.

Koloniler görünür hale gelene kadar plakaları 40 ila 60 saat inkübe edin. Plakalardaki bakterilerin öngörülebilir on katı yansıttığını onaylayın. Koloni oluşturan birimlerde düşüş.

Bakterileri aşırı büyümeden ve koloniler kaynaşmadan önce sayın. Örtüşen kolonilere sahip olmayan en düşük seyreltmedeki bakteri sayısını belirleyin. Genellikle sayılması tercih edilen seyreltme 10 ila 50 koloni içerecektir ve teknik kopyalar arasında farklılık gösterebilir.

Bakteri çoğalma seviyelerini hesaplamak için, R'nin sıra sayısı ve T'nin her bir teknik kopya içindeki bakteri sayısı olduğu bu formülü kullanarak yaprak diski başına koloni oluşturan birim sayısını belirleyin. Veriler daha sonra bir grafik oluşturmak için kullanılır. Her veri noktası, logaritmik bir ölçekte altı teknik kopyanın ortalaması olarak temsil edilir.

Aerobarlar, ortalama gelişmiş hastalığın %95 güven aralığını temsil eder. P-S-M-E-S 43 26'ya karşı duyarlılık, OD 600 0.0002 olan bir aşı ile enfeksiyon ile değerlendirildi. Sonuçlar, oldukça duyarlı NPR one dash one mutantlarının, vahşi tip Columbia zero bitkilerine kıyasla yaklaşık 2.5 log veya 300 kat daha fazla patojen büyümesine sahip olduğunu göstermektedir.

Şırınga infiltrasyon testi, farklı bağışıklık tepkisi katmanlarını değerlendirmek için modifiye edilebilir. Salisilik asit ile tetiklenen bağışıklığı değerlendirmek için, patojen büyümesi ile ölçülen bağışıklık tepkisini tetiklemek için harici sodyum salisilat uygulaması kullanılır. Salisilik asit reseptörü ve salisilik aside bağımlı hedef genlerin majör transkripsiyonel ko-regülasyonu olarak işlev gören NPR R one'ın kaybı, salisilik asit türevinin eksojen uygulamasına karşı duyarsızlığa yol açar.

Mikropla ilişkili moleküler patern ile tetiklenen bağışıklığı karakterize etmek için, bitkiler bilinen iki tetikleyici ile ön işleme tabi tutuldu. FLAG 22 ve L 18, FLAG 22 ile muamele edilen yabani tip Columbia sıfır bitkileri, bakteri popülasyonunda bir log veya 10 kat azalmayı desteklerken, FLS iki mutant bitki bakteri büyümesini kısıtlama etkisini tetikleyemedi. Benzer şekilde, EFR mutant bitkileri L 18 ön işlemine karşı duyarsızdı.

Bu videoyu izledikten sonra, şırınga sızma testi yoluyla Arapça opsys bağışıklık tepkisinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu işlemi denerken, korsis ortaya çıktıktan sonra hastalık gelişimini izlemeyi ve dokuyu örnek almayı unutmamak önemlidir. Pseudomona pather cul cola S phos 3, 2, 6 bir hemi atrofik patojendir.

Bu nedenle, örnekleme nörotrofik aşamaya geçişten önce yapılmalıdır. Bu prosedürü takiben, hangi belirli bağışıklık sinyal yolunun bozulduğu gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif gerçek zamanlı PCR ve Western kan analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Canlı bakterilerle çalıştığınızı unutmayın.

Pseudomona Senge insanlar üzerinde patojenik olmasa da, lütfen bu prosedürü gerçekleştirirken kontamine sarf malzemelerini ve enfekte olmuş bitkileri uygun şekilde atmayı unutmayın.