Name: FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Öğrenin, fare deri fibroblastlarını FACS ile in vitro kültür olmadan izole etme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve yara iyileşmesinde fibroblast alt tiplerini belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma (HPL için) NIH hibe R01 GM087609, (MTL) (HPL için) Anthony Shu, NIH hibe U01 HL099776 onuruna Ingrid Lai ve Bill Shu bir Hediyesi, Hagey Laboratuvarı için bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Pediatrik Rejeneratif Tıp ve Meşe Vakfı (MTL, GCG ve HPL). GGW Tıp Stanford School, Stanford Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı tarafından desteklenen ve NIGMS eğitim bursu GM07365 oldu. ZNM Plastik Cerrahi Vakfı Araştırma Bursu Grant ve Hagey Aile Fonu tarafından desteklenmiştir. MSH California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) Klinik Fellow eğitim bursu TG2-01159, Çene Hastalıkları Cerrahlar American Society (ASMS) / Çene-Yüz Cerrahları Vakfı (MSF) Araştırma Bursu Ödülü ve Transplantasyon ve Doku Mühendisliği Bursu Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol Laboratuar Hayvanları Bakım Stanford Üniversitesi İdari Heyeti tarafından onaylanan yöntemler izler. Fare Dermisinde 1. Sindirim <ol><li> Ketamin 100 mg / kg + ksilazin 20 mg / kg asepromazin + 3 mg / kg karın içinden enjeksiyonu ile anestezi sonra servikal dislokasyon ile fareler öldürülür. Not: Çeşitli yaş ve arka kullanılabilir. </li><li> Tıraş ve dorsal cilt atmaktadır. Yaklaşık olarak 100,000 hücre sırt derisine bir parça x 100 mm, 60 mm izole edilebilir. </li><li> Kuruması için temiz, steril bir yüzey üzerinde% 70 etanol ve yerinde fareyi Batmak. </li><li> Hemen steril diseksiyon makas kullanarak dorsal fare cilt hasat. Dişi fareler içinde, meme dokusu da dahil olmak üzere kaçının. </li><li> Kuyruk tabanı başlayan çadır kadar cilt için forseps kullanabilir ve üstü fasiyal düzlemi boyunca diseksiyon önce enine kesim yapmak. </li><li> Dikkatle hasat sırasında herhangi deri altı yağ içeren kaçınmakcilt. Herhangi bir deri altı yağ için hasat cildi inceleyin ve dikkatli bir neşter künt kenarını kullanarak kazıyın. </li><li> Buz üzerinde PBS yıkar 5x ardından Betadin hasat cildi durulayın. Not: kirlenmesini önlemek için mümkün olduğunca steril yakın olarak cildi korumak önemlidir. </li><li> Jilet kullanarak ve örnek 2-3 mm&#39;lik parçalar ile düzgün bir tutarlılık kadar steril bir tabak içinde makas diseksiyon cilt kıyma. </li><li> DMEM içindeki 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, 50 ml, 20 ml kolajenaz IV ihtiva eden konik tüpler hazırlayın. Tüp başına beş farenin bazında tüplere dermis bölün. </li><li> Bir su banyosu ya da fırın ya 1 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe kuvvetli şekilde örnekleri çalkalayın. </li><li> Inkübatör örnekleri çıkarın ve steril bir muhafaza içinde bir iğne 3-5x olmayan bir 10 ml şırınga geçer. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübatör içinde numuneler ve 30 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> Steril bir başlık olarakBir 10 ml pipet kullanarak ve 3-5x aşağı örnekleri pipetle. Yeni 50 ml konik tüp içine 100 mikron filtre örneği pipetle. </li><li> Hücre verimi maksimize etmek ve 40 ml toplam hacmi getirmek için, aynı filtre boyunca% 10 FBS DMEM 20 ml geçirin. 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> İlk süpernatant kalan öncesinde üst yağ tabakasını kaldırmak için büyük bir özen, bir steril cam pipet kullanarak süpernatantı. Not: Bu adım adiposit kirlenmeyi azaltmak için çok önemlidir. </li><li> 20 ml% 10 FBS DMEM pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 70 mikron filtreden geçirilerek hücre / DMEM süspansiyonu geçirin. </li><li> 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 300 g&#39;de 10 mi,% 10 FBS DMEM ile filtre ve santrifüj filtre süspansiyonu çalkalayınız. </li><li> Yine ilk kalan yağ tabakası kaldırmak için özen, steril bir cam pipet kullanarak süpernatantı. </li><li> Önemli RBC kirlenme varsa (pelet gözle görülür kırmızı), pelet yeniden askıyave 20 ml ACK lizis tamponu içinde, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Aksi halde 24 adıma atlayın. </li><li> FACS tamponu (PBS,% 10 FBS,% 0.1 sodyum azid) içinde eşit bir hacmi (20 mi) ilave edilir, daha sonra karıştırılır ve bir boyanmamış bir kontrol olarak bir kenara 5 ml&#39;lik bir şişe tutun. 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 300 g&#39;da kalan santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve buz üzerinde pelet koydu. FACS zamanı mevcut değilse, bu noktada hücreler, aşağı dondurulabilir. </li></ol> FACS Fibroblast 2. izolasyonu <ol><li> Her pelet için soy antikor inkübasyon karışımı 500 ul olun. CD45 (1: 200), Tie2 (01:50), Ter: İlk bir tübe DNaz (10 ug / ml) ihtiva eden FACS tampon 475 ul ekleyerek ve daha sonra fluorofor-konjuge CD31 (100 1) ilave edilerek, bu fazlası -119 (1: 200) ve EpCAM (1: 100) antikorları her bir antikor için, ilgili seyreltme elde etmek. </li><li> Nesilli antikor inkübasyon karışımı 500 ul her bir pelet yeniden askıya ve 20 dakika boyunca buz üzerinde, bu süspansiyon inkübe edilir. </li><li> 5 ekleyinörnek DNaz (10 ug / ml) ihtiva eden ve hafifçe karıştırın mi FACS tamponu. 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve adım 26&#39;daki gibi 5 ml FACS DNaz ihtiva eden tampon (10 ug / ml) ve aynı koşullar kullanılarak santrifüj ile hücre pelletini yıkayın. </li><li> DNase (10 ug / ml) ihtiva eden 500 ul FACS tampon maddesi içinde pelletini ve canlılığı boya kontrol olarak bir kenara 50 ul tablet koydu. </li><li> Seçilen boya için belirtilen konsantrasyonda kalan örnek seçim canlılığı boya ekleyin. </li><li> FACS analizi 31 gerçekleştirin ve Canlılık Dye- / CD31 / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- hücreleri (Şekil 2A) için sıralama. Sıralama doğrudan FACS tampon içine. </li></ol>

<ol><li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+diverse+population+at+the+center+of+it+all%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a diverse population at the center of it all.</a> International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts.+I.+Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease.</a> The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).</li>
<li>Wilson, M. S., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+fibrosis%3A+pathogenesis%2C+etiology+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation.</a> Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).</li>
<li>Hinz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblast%3A+one+function%2C+multiple+origins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The myofibroblast: one function, multiple origins.</a> The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).</li>
<li>Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts+in+wound+healing%3A+force+generation+and+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Viability%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement.</a> J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).</li>
<li>Wong, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+oral+mucosa+results+in+reduced+scar+formation+as+compared+with+skin%3A+evidence+from+the+red+Duroc+pig+model+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+regeneration+%3A+official+publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans.</a> Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).</li>
<li>Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+injury+responses+in+oral+mucosal+and+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds.</a> Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).</li>
<li>Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+fetal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Adult and fetal wound healing.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).</li>
<li>Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+skin+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fetal skin wound healing.</a> Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors%3A+wounds+that+do+not+heal.+Similarities+between+tumor+stroma+generation+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing.</a> The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).</li>
<li>Dumont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+fibroblasts+modulate+early+dissemination%2C+tumorigenesis%2C+and+metastasis+through+alteration+of+extracellular+matrix+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics.</a> Neoplasia. 15, 249-262 (2013).</li>
<li>Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sentinel+cells+to+inflammatory+culprits%3A+cancer-associated+fibroblasts+in+tumour-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation.</a> The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+cancer-stroma+interaction%3A+a+potential+approach+for+pancreatic+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+pharmaceutical+design%22%5BJournal%5D)">Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment.</a> Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).</li>
<li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity%3A+more+than+skin+deep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity: more than skin deep.</a> Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).</li>
<li>Cormack, D. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCormack%2C+DH+%22Ham%27s+Histology%22">Ham's Histology</a>. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).</li>
<li>Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal-epidermal+interactions.+Adult+follicle-derived+cell+populations+and+hair+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+clinics%22%5BJournal%5D)">Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth.</a> Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).</li>
<li>Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+dermal+sheath+cells%3A+unsung+participants+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing.</a> Lancet. 358, 1445-1448 (2001).</li>
<li>Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+bilayered+dermal+equivalent+containing+human+papillary+and+reticular+dermal+fibroblasts%3A+use+of+fluorescent+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes.</a> Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).</li>
<li>Harper, R. A., Grove, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+fibroblasts+derived+from+papillary+and+reticular+dermis%3A+differences+in+growth+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro.</a> Science. 204, 526-527 (1979).</li>
<li>Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+observation+of+fibroblasts+derived+from+the+papillary+and+reticular+dermis+of+infants+and+adults%3A+growth+kinetics%2C+packing+density+at+confluence+and+surface+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology.</a> Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).</li>
<li>Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-matched+papillary+and+reticular+human+dermal+fibroblasts+differ+in+their+release+of+specific+growth+factors%2Fcytokines+and+in+their+interaction+with+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes.</a> Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425(2013).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
<li>Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+a+Dermal+Lineage+with+Intrinsic+Fibrogenic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature protocols. 3, 799-810 (2008).</li>
<li>Klein, M., Fitzgerald, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+separation+of+intact+epidermal+sheets+from+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin.</a> The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).</li>
<li>Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((yThree+blocks+are+not+enough+-+Blocking+of+the+murine+IgG+receptor+FcgammaRIV+is+crucial+for+proper+characterization+of+cells+by+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis.</a> European journal of immunology. , (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yazıda tarif edilen protokol, bir alt seçmek ya da daha sonraki analizler yapılmadan önce, hücre kültüründe bir zaman gerektiren ya mevcut yöntemlere kıyasla, FACS-bazlı sıralama ile fibroblastlar izole etmek için bir araç sunmaktadır. Fibroblast sıralama için cildin hasat gerekli süre yaklaşık 6 saattir; Bununla birlikte, hasat kullanılan farelerin sayısı, bu tahmin etkileyecektir. Protokolde birkaç nokta özellikle dikkat gerektirir. İlk izolasyon prosesi esnasında sindirimi ve santrifüj...

Fibroblastlar sık ​​plastik yüzeylerde uygun iğ biçimli hücreler olarak morfolojik tanımlanır. Fibroblastlar sentezlenmesi ve embriyonik ve yetişkin organlarının 1 hücre dışı matriks remodeling sorumlu ilke hücre tipi vardır. Fibroblastlar memeli gelişme dolayısıyla kritik ve her doku ve organda mevcut hücre tipleri komşu davranışını etkileyen hücre dışı ortamın önemli ölçüde katkıda bulunur. Fibroblastlar de muazzam bir klinik yükünü neden tıbbi koşullar çeşitli bir kümesi arkasında asıl hücre tipi vardır. Patolojik fibroblast aktivitesinin normal doku işlevini bozar ve deri yara iyileşmesi, ateroskleroz, sistemik skleroz, ve damar yaralanması 2-5 sonra aterom plaklarının oluşumuna aşağıdaki doku ve (örneğin akciğer ve karaciğer gibi), organ fibrozis, skar içerir. Özellikle yara iyileşmesi, hem akut ve kronik, d içerirnormal doku gibi ne benzeyen, ne de işlevleri çevreleyen ve çeşitli patolojik devletler arasında önemli morbidite neden skar dokusunun eposition. Travmalarından sonra, daha sonra, yapısal ECM bileşenleri salgılar hücre tiplerini komşu parakrin etkilere neden ve skar dokusu 6 yatırma mekanik istikrarı sağlamak miyofibroblastlar fibroblastların bir geçiş vardır. Deri dokularda gelişimsel süre boyunca yara onarım kalitesi ve anatomik siteler arasında önemli varyasyon mevcuttur. Yaşamın ilk iki trimesterde fetüs iz bırakmadan iyileşir; Ancak, üzerinde ve yetişkinlik boyunca üçüncü trimesterde, bir yara ile iyileşir insanlarda. Mevkiye-özgü yaşa özgü ek olarak, yara iyileşmesi farklılıklar vardır. Deri yaraların içinde skar dokusu biriktirme 9 önemli ise ağız boşluğunda yaralar, minimal skar oluşumu 7,8 ile pişmanlık. Münakaşa c devamyaş ve konum 10,11 hem açısından yara iyileşmesi sonucu yerel fibroblast içsel özelliklerinin karşı çevrenin göreceli etkisini oncerning. Deri dermis ve önceki embriyonik (E15) karşı sözlü fare iyileşmesinde önemli farklılıklar göz önüne alındığında vs sonra embriyonik (E18) dermiş, bazı gelişimsel yaşta ve çeşitli anatomik siteler arasında fibroblastların popülasyonlarında içsel farklılıklar var olasıdır . 1986 yılında, Harold F. Dvorak tümörler 12 iyileşmeyen yaralar vardır oturtulması. Dvorak tümörler vücutta yaralar gibi davranırlar ve konağın yanıtını yaranın iyileşme aktive ederek stroma neden olduğu sonucuna varıldı. Çeşitli çalışmalar beri karsinom 13-15 ilerlemesine fibroblastların katkısını araştırdık, ama yara iyileşmesi, kimlik ve deri ca stromal bölmesine katkıda fibroblast embriyonik kökenli olduğu gibircinomas yeterince tanımlanmamıştır. Bu sorunun cevabı, anti-kanser terapisi 16 için potansiyel olarak etkin hedef olarak tümörle ilişkili fibroblast açığa son çalışmalar verilen tıbbi alaka taşımaktadır. Belirlenmesi ve ileriye dönük in vivo fibrojenik potansiyeli sahip fibroblast soy izole etkin bir akut ve kronik hastalık durumları geniş bir yelpazesinde yaralanma kendi tepkisini manipüle yönelik önemli bir adımdır. 1987 yılında, Cormack papiller ve retiküler dermis 17,18 içinde biri içinde ikamet eden fibroblast iki alt popülasyonlarını bir gösterdi. Üçüncü ICSI&#39;nin follikül 19,20 Dermal papilla bölgedeki saç köklerinin ile ilişkili bulunmuştur. Ne zaman kültür, büyüme potansiyeli, morfoloji ve büyüme faktörü / sitokin bu fibroblast alt tiplerinin sergi farkları 21-24 profilleri. Bugüne kadar, fibroblast inceleyen çalışmaların oterogeneity ölçüde yeterli in vivo fibroblastlar arasında gelişimsel ve fonksiyonel çeşitlilik karakterize etmek başarısız oldu. Bu, kısmen, kültürlenmiş fibroblast popülasyonları bir güven ve tüm fibroblastlar 25 ile ifade edilen bir kendi kendine yüzey reseptörüne göre hücre kültüründen ya da pozitif bir seçim homojenize etkisinin bir sonucu olduğu. Laboratuarımızda yapılan yeni bir çalışma, derin bir yüzey işaretleyici ve bu yazıda 26 sunulan FACS-bazlı izolasyon metodolojisi ile izole vs kültürlü kültürsüz fibroblast transkripsiyonel vardiya gösterdi. Daha sonra, kemirgen dorsal dermiş içinde belirli bir fibroblast soy tanımlanmış ve Engrailed-1 embriyonik ekspresyonu ile tanımlanan, bu soy, dorsal, derideki bağ dokusu birikimi için temel olarak sorumlu olduğu tespit edilmiştir. Yara iyileşmesi, kanser stroma oluşumu da dahil olmak üzere fibrozis, akut ve kronik biçimleri boyunca da soy fonksiyonlarıRadyasyon fibrozis 27 uyarılan. Farklı fibroblast soy karakterizasyonu fibrojenik davranışlarını modüle amaçlayan tedaviler için kritik etkileri vardır. Aksine, hücre izolasyonu 28,29 ulaşmak için in vitro manipülasyon güvenmek mevcut protokolleri kullanarak daha burada ayrıntılı hasat protokolü (Şekil 1) daha doğru in vivo fenotip ve davranışlarını yakalamak fibroblast verimi bilgilendirici analizlerini yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Cerrahi Forseps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>Mikro makas</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>Povidone İyot Hazırlama Solüsyonu</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair (tüy dökücü krem)</td><td>Church ve Dwight Co.</td><td></td><td></td>22600267058</tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Elastaz</td><td>Abcam</td><td>ab95133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) parçalama tamponu</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 & mu; m filtreler</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtreler</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtreler</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>propidyum iyodür (PI canlılık lekesi)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

facs ile murin dermal fibroblast İzolasyonu

 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblastlar hücre dışı matriks salgılayan sorumlu ilke hücre tipi ve birçok organ ve dokuların kritik bir bileşenidir. Fibroblast fizyolojisi ve patolojisi birden organlarda fibrozların, hipertrofik skar aşağıdaki yanıklar, iskemi sonrası kardiyak fonksiyon kaybı ve kanser stroma oluşumu da dahil olmak üzere klinik kuruluşların, bir spektrum altında yatan. Ancak, fibroblastlar büyük ölçüde kendi içsel heterojenite, hücrenin kötü karakterize tip kalır. Fibroblastlar izolasyonu için mevcut yöntemler derinden hücre fenotipi ve davranışlarını etkileyen hücre kültüründe zaman gerektirir. Sonuç olarak, fibroblast biyoloji araştıran birçok çalışma, in vitro manipülasyon güvenmek ve doğru bir in vivo fibroblast davranışı yakalamak değil. Bu problemin üstesinden gelmek için, preservi böylece, hücre kültürü gerektirmez, yetişkin farelerin dorsal deri fibroblast izolasyonu için bir FACS tabanlı bir protokol geliştirilmiştirfizyolojik transkripsiyonel ve her hücrenin proteomik profili ng. Bizim stratejimiz soy negatif kapısı yoluyla olmayan mezenkimal soy dışlama sağlar (Lin -) oldukça spesifik yüzey belirteçleri ifade fibroblastlar bir alt ön seçim veya zenginleştirme önlemek ve bu heterojen genelinde mümkün olduğunca kapsayıcı olması için pozitif bir seçim stratejisi daha hücre tipi.

Bu yaklaşım (Şekil 1) geçerlilik son yayın 27 ayrıntılı incelenebilir şekilde, bir dizi doğrulanmıştır. Bunlar sıralanmış hücreler ve kitle hücre ve taze sıralanmış hücrelerin tek bir hücre transkripsiyonel analizi immünsitokimya içerir. Fibroblastlar Sıralama doğrudan ziyade daha doğru kültürüne dayanarak in vivo fenotip yakalar. Yerine olumlu bir seçim yaklaşımı daha soy negatif tüketme yaklaşımı (Şekil 2A) kullanılarak belirli alt popülasyonlar için ön seçerek önler. Bu yaklaşımın değ...

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Bu prosedürün genel amacı, FACS kullanarak fibroblastları izole etmek ve böylece bu hücrelerde fenotipik değişikliğe neden olduğu gösterilen in vitro kültür aşamasını atlamaktır. Bu yöntem, skar oluşumu ve fibrozis ile ilişkili fibroblast alt tiplerinin nasıl tanımlanacağı gibi gelişimsel biyoloji ve yara iyileşmesi konularındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fibroblast fenotipine benzer olan plastiğe yapışma özelliği nedeniyle in vitro deneylerin önlendiğidir.Bu yöntem sadece dermal fibroblastlar hakkında bilgiler sağlamakla kalmaz, aynı zamanda peritoneal fibroblastlar ve abdominal yapışıklıklar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İlgili farenin sırt derisini tıraş ederek ve epilasyon uygulayarak başlayın. Ardından, tüyleri temizlenmiş fareyi %70 ethanol içine daldırın ve hayvanı kuruması için temiz, steril bir yüzeye yerleştirin.Ardından, kuyruk kökünden başlayarak, pensle deriyi yukarı kaldırın ve diseksiyon makasıyla transvers bir kesi yapın. Sonra, dorsal dokuyu toplamak için suprafasiyal plan boyunca diseksiyon gerçekleştirin. 60 by 100 milimetre boyutunda bir deri parçası çıkarıldığında, herhangi bir subkutan yağ dokusunu dikkatlice temizlemek için bir skalpelin küt ucunu kullanın.Ardından, hasat edilen deriyi betadine ile durulayın ve ardından buz üzerinde beş kez PBS ile yıkayın. Jiletler ve disseksiyon makasları kullanarak, deri parçalarını steril bir kapta örnekler yaklaşık iki ila üç milimetre boyutunda homojen hale gelene kadar ince kıyın. Daha sonra, beş fareye kadar olan doku fragmanlarını, içinde 20 mililitre dmem içinde kollajenaz 4 bulunan uygun sayıda ayrı 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Numuneleri 37 °C'de kuvvetlice çalkalayın. Bir saat sonra, tüpleri steril bir kabine aktarın ve doku parçalarını iğnesiz 10 mL'lik bir şırınga ile üç ila beş kez geçirin. Numuneleri 30 dakika daha çalkalayıcıya geri yerleştirin ve ardından 10 mL'lik bir şırınga ile üç ila beş kez daha pipetleme işlemi uygulayın.Ardından, örnekleri 100 mikronluk bir süzgeç aracılığıyla yeni bir 50 mililitrelik tüpe süzün ve toplam hacmi 40 mililitreye tamamlamak için FBS ile desteklenmiş 20 mililitre dmem ile süzgeci yıkayın. Sonra, hücreleri santrifüjleyin ve üstteki yağ tabakasını aspire etmek için steril bir cam pipet kullanın. Kontamine yağ bölgeleri uzaklaştırıldığında, süpernatan tın geri kalanını almak için yeni bir cam pipet kullanın ve peletleri 20 mililitre dmem artı FBS içinde yeniden süspanse edin.Şimdi, hücreleri 75 mikronluk bir süzgeçten filtreleyin ve gözenekli yapıyı 10 milliliters dmem artı FBS ile durulayın. Ardından, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve az önce gösterildiği gibi yağ tabakasını ve süpernatantı uzaklaştırın. Pelletini 20 milliliters FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve boyanmamış kontrol için beş milliliterslik bir alikotu ayırın.Ardından, kalan numuneyi santrifüjle çöktürün, süpernatantı atın ve peleti buza yerleştirin. Fibroblastları FACS ile izole etmek için, peletleri buz üzerinde 500 microliters lineage antikor inkübasyon karışımında yeniden süspande edin. 20 dakika sonra, DNase ile desteklenmiş beş milliliters FACS tamponunu hücrelerle nazikçe karıştırın ve hücreleri santrifüjle çöktürün.Peleti beş mililitrelik ikinci bir DNase hacmi ile yıkayın. Ardından, canlılık boyası kontrolü için 50 mikrolitrelik bir hücre alikotunu ayırarak, hücreleri 500 mikrolitre FACS tamponu ve DNase içinde yeniden süspande edin. Son olarak, kalan örneğe canlılık boyası ekleyin ve hücreleri şemaya göre sıralayın.Pozitif seçim yaklaşımı yerine soy hattı negatif tüketme yaklaşımının kullanılması, belirli alt popülasyonların önceden seçilmesini önler. Transkriptom mikroarray analizi, canlı hasat ve doku eksplant metodolojileri ile izole edilen kültürlenmiş fibroblastların, 0,92'lik bir Pearson çarpım-moment korelasyon katsayısı ile transkriptom genelinde yüksek derecede benzerliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Buna karşılık, kültürlenmiş fibroblastlar, canlı hasat edilmiş kültürlenmemiş bir fibroblasttan önemli ölçüde farklılık göstermiş; bu da canlı hasat edilen fibroblastların analiz edilmesinin, kültürlenmiş fibroblastlara kıyasla önemini ortaya koymuştur.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, gelişimsel biyoloji ve yara iyileşmesi alanındaki araştırmacıların fibroblast heterojenliğini doğrulamalarına ve skar oluşumu ile diğer fibrozis türlerinden sorumlu alt popülasyonları belirlemelerine olanak sağlamıştır.

murine-dermal-fibroblast-isolation-by-facs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kanser İlişkili Fibroblastlar (cafs) proliferasyon, anjiyogenez ve inflamasyon teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyüme ve ilerlemesini hızlandırabilir. Burada bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak hücre sıralama ile taze fare ve insan dokularında normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Bu videoda, doğum sonrası fare yavrusunun derisinden melanositleri ve fibroblastı aynı anda izole etmek ve kültürlemek için hızlı yöntem açıklanmaktadır. Bu hücreler, cilt hücresi biyolojisini, yara iyileşmesini ve melanomu incelemek için in vitro olarak korunabilir ve manipüle edilebilir.

Primer Murin Melanositlerinin ve Fibroblastlarının Hızlı Kültürlenmesi: Tüm Murin Deri Örneğinden Melanositlerin ve Fibroblastların İzole Edilmesi

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Bu yazıda insan derisinden papiller ve retiküler fibroblastların yalıtımına yönelik FACS tabanlı bir protokol açıklanmaktadır. Eksplant kültürler aracılığıyla yaygın olarak kullanılan izolasyon protokolüyle kaçınılmaz olan in vitro kültürünü bozur. Yayılımlı fibroblast alt setleri işlevsel olarak farklıdır ve dermis içinde diferansiyel gen ifadesi ve lokalizasyonu görüntüler.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Bu protokol, 0-4 gün eski farelerin derisinden melanosit ve fibroblast kültürlerini eşzamanlı olarak oluşturmak için hızlı bir yöntem özetliyor. Bu primer kültürler, cilt hücresi biyolojisi, pigmentasyon, yara iyileşmesi ve melanom dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili süreçlerin çeşitli çalışma için muhafaza ve manipüle edilebilir.

Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Bu yazıda birincil, hastaya özgü insan aort düz kas hücrelerinin ve dermal fibroblastların izolasyonu ve kültürlenmesi için eksplant kültürüne dayalı bir yöntem anlatılmaktadır. Ayrıca, hücre kasılmasını ölçmek ve daha sonra bu hücrelerdeki hastaya özgü farklılıkları incelemek için kullanılabilecek yeni bir yöntem sunulmaktadır.

Primer Hastaya Özgü Aort Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Yarı Kantitatif Gerçek Zamanlı Kasılma Ölçümleri In Vitro

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Bu protokol, yaşlı fare gözyaşı bezlerinin ayrıştırılmasında optimize edilmiş bir yöntem tanımlayarak tek hücreli RNA dizileme için canlı tek hücreler elde edilir. Ardışık enzimatik sindirim ve nazik kullanım, hücre bütünlüğünü korur ve hücre tipine özgü izolasyon ve yaşlanmaya bağlı değişikliklerin lakrimal bez popülasyonlarındaki transkriptomik analizi için uygun yüksek kaliteli süspansiyonlar sağlar.

Yaşlanmış gözyaşı ve tükürük bezlerinden miyoepitel hücreleri ve fibroblastların tek hücre ayrımı, RNA dizileme ve izolyasyonu protokolü

Öğrenin, fare deri fibroblastlarını FACS ile in vitro kültür olmadan izole etme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve yara iyileşmesinde fibroblast alt tiplerini belirlemeye yardımcı olur.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Daha fazla video keşfet