Name: NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Keşfedin çözünme dinamik nükleer polarizasyon (DNP) ile NMR'de enzimatik süreçleri gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, molekülleri değiştirmeden enzim dönüşüm hızlarını belirlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar yararlı tartışmalar için Dr. F. Kateb ve Dr G. Bertho yanı sıra, ekipman seçimi ve montaj yardım için Dr JJ van der Klink teşekkür ederim. AC İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (PPOOP2_157547 hibe) tarafından desteklenmiştir. Biz Paris Sorbonne Cité (NMR Com, DIM Analytics, Ville de Paris, Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708) ve Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK finansman kabul. Ekibimiz Equipex programlarının Paris-en-rezonans parçasıdır ve CACSICE.

Not: Bütün veriler analiz ticari yazılımı kullanılarak yapıldı. 1. Polarize Çözüm hazırlayın <ol><li> Bir 1.12 M, 13C-etiketli sodyum piruvat 2 mi hazırlama (Na + [CH3-CO- 13 COO-] -, alt-tabaka) çözeltisi kökü TEMPOL 33 mM katkılı (4-hidroksi-2,2,6,6- tetrametilpiperidin-1-oksil, polarize madde) 4, 2: 1 D 2 O / D 13 C gözlemler için 6 -etanol. DİKKAT: Kullanım önlemleri nedeniyle d6 -etanol yanıcı doğası alınmalıdır. </li><li> Radikal konsantrasyon elde kutuplaşma açısından en uygun olduğundan emin olun. <ol><li> (30 mM veya 35 mM için, örneğin) biraz noktasında 1.1 çözeltinin radikal konsantrasyonunu değiştirin. </li><li> iteratif solid-state geliştirme belirleme (Adım 3) ve maksimum arttırılmasına neden radikal konsantrasyonunu bulmak. </li></ol></li></ol> 2. Polarizatiyon <ol><li> bekleme süresi usulü ile DNP kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;Cooldown&#39; butonuna tıklayın. </li><li> doldurma usulü ile DNP kriyostat sıvı helyum toplayın. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;Dolum&#39; butonuna tıklayın. </li><li> DNP polarize ile sağlanan örnek kapta Adım 1.1 optimize kutuplaştırıcı çözeltisi 300 ul yerleştirin. yumuşak bir sıvı azot banyosu içine daldırılmasıyla içindeki numune ile numune muhafazası dondurun. </li><li> su azot banyosunda örnek kabın açılan ve ters çevirerek dondurma prosedürü (adım 2.3) sonra örnek kap içinde mevcut olabilir, sıvı azot ortadan kaldırır. NOT: Bu adım, örnek tam bir çözünme elde etmek için çok önemli olan (adım 5). </li><li> kriyostat içine örnek yerleştirin. NOT: Bu StEP aşağıdaki alt adımı oluşan (yani, en az 10-20 sn) erime numunenin önlemek için hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. <ol><li> numune tutucu örnek kabı yerleştirin. Ana Kriyostat insert örnek tutucu yerleştirin. numune tutucuya mikrodalga dalga kılavuzu yerleştirin. </li></ol></li><li> 1 K soğutma işlemini başlatarak kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;1K Soğutma&#39; düğmesini tıklayın. </li><li> mikrodalga kaynağını açın ve örnek ışın tedavisi. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;MW-ON &quot;butonuna tıklayın. </li></ol> 3. Solid-state NMR Ölçümleri <ol><li> 90 ° Konnektörü saat yönünün tersine döner ve çekerek spektrometre bobininden NMR konsol algılama kanalı koaksiyel kablosunu çıkarın. kriyostat koaksiyel bağlantı algılama kanalının koaksiyel kablo takınNMR bobin. oryantasyon pin dikkat, kriyostat NMR bobin dişi konnektör NMR konsol kablosunun erkek konnektörü takın; sıkıca bastırın ve 90 ° konektör saat yönünde çevirin. </li><li> T = 5 dakika aralıklarla tekrarlanan un kalibre düşük çevirme açısı darbeleri ile basit bir darbe Edinme sekansı kullanılarak kriyostat yerinde katı halde NMR ısı sinyali ölçer. ölçüm kurduktan sonra, yazılım &#39;ig&#39; komut satırında yazmak ve &#39;Enter&#39; klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. </li><li> DNP geliştirilmiş NMR sinyali ölçün. Bölüm 2&#39;de açıklandığı gibi DNP süreci başlatıldıktan sonra adım 3.2 tekrarlayın işlemleri. </li><li> 90 ° Konnektörü saat yönünün tersine döner ve çekerek kriyostat NMR bobininden NMR konsol algılama kanalı koaksiyel kablosunu çıkarın. deterjanları koaksiyel kablo takınspektrometre bobin koaksiyel konnektörüne ction kanalı. oryantasyon pin dikkat, spektrometre bobin dişi konnektör NMR konsol kablosunun erkek konnektörü takın; sıkıca bastırın ve 90 ° konektör saat yönünde çevirin. </li></ol> 4. Ana Mıknatıs Field ( &#39;terazi ayarına&#39;) &#39;in Homojenliğinde optimize <ol><li> Spektrometresi önceki deneyler (örneğin, Aşama 6.2) sonra üretilen karışımın 500 ul ihtiva eden bir tüp yerleştirin. </li><li> maksimum arama layneri degrade bobinler akım değiştirerek NMR spektrometre shimming gerçekleştirmek döteryum sinyali &#39;kilit&#39;. NMR konsolunda gelen düğmeye basarak ilgili layneri bobini seçin. <ol><li> Kilit sinyalini artırır dönüş yönünü belirlemek için NMR konsolda düğmeyi çevirin. Sinyal maksimum ulaşana kadar dönmeye devam eder. Başka layneri bobini seçin ve maksimizasyonu un tekrartüm shimming bobinler için yerel maksimum til bulunur. Daha fazla bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. Sonunda, kilitleme için kullanılan numuneyi çıkar. </li></ol></li></ol> 5. Fesih <ol><li> Çözünme insert kazandaki D 2 O 5 ml ekleyin. Basınç ile T ≈ 180-200 ° C ulaşana kadar dirençli tel ile D 2 O ısıtın. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;Isıtıcı hazırlayın&#39; butonuna tıklayın. </li><li> Örnek polarizasyon işlemin tamamlanmasından sonra, (örneğin, 3 T DNP sonra), oda basıncının biraz üzerinde Kriyostat basınç. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;SS operasyonların&#39; düğmesini tıklayın. çözünme insert mikrodalga kılavuzunu çıkarın. </li><li> Numune tutucu içine çözünme insert (Şekil 3B) kaydırın (Şekil 3A-c). Erime uç numune tutucusunun alt ulaşmak zorundadır ve kriyostat D 2 O sızmaması için, numune kabı ile sızdırmaz bir bağlantı kurmak için sıkı bir şekilde itilmesi gerekir. </li><li> Çözünme sekansı, pnömatik valflar işlemleri, önceden belirlenmiş bir zaman ayarlı dizisini başlatmak için donanım tetik (Şekil 3C-H) basın. </li></ol> 6. Enjeksiyon <ol><li> 500 ul örneği içeren çözülme yeri 5 mm NMR tüpü, (örneğin, D 2 O için önce <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> 11.74 T NMR spektrometresi İzomerkez Aşama 9 enzimatik aktivite ölçümleri için Adım 8&#39;den Adım 7 veya LDH çözelti), ölçüm (Adım 4) bakın. </li><li> Sadece çözündürme (aşama 5), ​​Adım 6.1 NMR spektrometresi yer numune ile hiperpolarize çözeltisi 500 ul karıştırın. <ol><li> Manuel Enjeksiyon: hiperpolarize toplamakNMR spektrometresi mıknatısa yakın yerleştirilmiş bir cam beher içinde, bir 2.5 m uzunluğunda bir transfer borusunun sonunda, çözelti. El ile özel yapılmış kılcal sistem içinden NMR tüpte hiperpolarize çözeltisi 500 ul enjekte edilir. </li><li> Otomatik enjeksiyon: çözünme işleminden önce, transfer için kullanılan helyum gazı hyperpolarized çözüm ayıran otomatik ölçüye enjeksiyon cihazına transfer tüpü bağlayın. cihaz otomatik deney tüpüne hiperpolarize çözeltisi 500 ul sağlar. </li></ol></li></ol> 7. Sıvı halde NMR Ölçümü <ol><li> dağılmasından sonra, alt-tabaka (A) manyetizasyon ilerlemesini ve (b) ürünü takip 1.5 sn aralanmış 10 ° dönüş açısı darbe Edinme dizileri bir dizi spektrometresinde numuneden NMR hiperpolarize sinyali ölçer. ölçüm kurduktan sonra, yazılım &#39;ig&#39; komut satırında yazma ve &amp; # tuşuna39; klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. </li><li> Mıknatıslanma, T = 3 T 1 ≈ 3 dakika aralıklı 90 ° dönüş açısı darbe elde dizileri bir dizi (T = 10 T 1, yani sonra), NMR ısı sinyali ölçüm tamamen rahat sonra. ölçüm kurduktan sonra, yazılım &#39;ig&#39; komut satırında yazmak ve &#39;Enter&#39; klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. </li></ol> (Piruvat-to-laktat Dönüşümü için spesifik) enzim içeren Örneklerinde 8. hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki reçete ile reaksiyon tamponu hazırlayın: 50 mM, 0.1 M fosfat tamponu içinde nikotinamid adenin dinükleotit (NADH), 1 mM etilen-diamintetraasetik asit (EDTA), 0.1 mM ditiotreitol (DTT), düşük pH =7.0. </li><li> bir tavşan kas LDH çözeltisi 20 ug / ml bovin serum albümini, BSA ile reaksiyon tamponu içinde taze hazırlanmış 1 U / ml hazırlayın. </li><li> 478 ul reaksiyon tamponu (8.1 Adım) karıştırın, 20 ul D 2 O spektrometre alan stabilizasyon ( &#39;kilit&#39;) ve 2 ul LDH solüsyonu (7.2 Adım) için izin vermek. </li><li> 5 mm NMR tüpü içine Adım 8.3 hazırlanan 500 ul çözüm hacmini yerleştirin ve 500 MHz NMR spektrometresi içine tüp yerleştirin. </li></ol> 9. Komple Enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümü Prosedürü <ol><li> polarizasyon örnek (Adım 1) hazırlayın ve onu (Adım 2) polarize. </li><li> spektrometre (Adım 4) üzerine shimming gerçekleştirin ve enzimatik örneği (Adım 8) hazırlar. </li><li> çözündürme (aşama 5) ve enjeksiyon (Aşama 6) uygulayın. </li><li> 1,5 sn (Adım 7) aralıklı 10 ° çevirme açısı bakliyat satın almalar ile hyperpolarized numuneden gelen sinyallerin bir dizi ölçün. Bu adım hiperpolarize ölçüm veriyorSinyal çürüme ve metabolitleri sinyal birikmesi. </li></ol> 10. Montaj <ol><li> Aşama 9.4&#39;te elde edilen her bir spektrum için, sırasıyla, (A) ve (b) ürünü, substrat ve entegre karşı gelen bir zirve tespit (tepe alanı belirlemek). Zirveleri integraller (denklem 2 bkz M (A, B) (t)) mıknatıslanma zamanı ders sinyallerini veriyor. </li><li> Denkleminin çözümünü (2) kullanarak, K = (RA + K eff değerini belirlemek ) Adım 10.1 entegre substrat sinyalinin basit üstel uyum gelen. </li><li> Değeri F = (R A + k eff kullanma ) Aşama 10.2 belirlenen, denklem entegre ederek elde edilen fonksiyonu ile ürün sinyal M B (t) bir uyum K eff ve Rb belirlenmesi (2). (Temsilcisi sonuçları bölümüne Enzymat bakınReaksiyon modelleme, montaj ve rf düzeltme ile ilgili ayrıntılar için ic faaliyet ve metabolik ölçümler). </li></ol>

<ol><li>Overhauser, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+Nuclei+in+Metals%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Polarization of Nuclei in Metals.</a> Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).</li>
<li>Abragam, A., Goldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+dynamic+nuclear+polarisation%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Principles of dynamic nuclear polarisation.</a> Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).</li>
<li>Wolber, J., Ellner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+highly+polarized+nuclear+spins+in+solution+using+dynamic+nuclear+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Inst.+Met.+Phys.+Res.+Sec.+A%22%5BJournal%5D)">Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization.</a> Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).</li>
<li>Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+35%25+liquid-state+13C+polarization+obtained+via+dissolution+dynamic+nuclear+polarization+at+7+T+and+1+K+using+ubiquitous+nitroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals.</a> PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).</li>
<li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%3E+10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR.</a> PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).</li>
<li>Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B2-13C%5D-Fructose%3A+A+Hemiketal+DNP+Substrate+for+In+Vivo+Metabolic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging.</a> JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Rate+Determination+by+Dynamic+Nuclear+Polarization+Enhanced+NMR+of+a+Diels%E2%88%92Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction.</a> An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).</li>
<li>Harrison, C., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kinetic+models+for+analysis+of+pyruvate-to-lactate+exchange+by+hyperpolarized+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR.</a> NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+visualization+of+betaine+aldehyde+synthesis+and+oxidation+using+hyperpolarized+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy.</a> Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).</li>
<li>Lerche, M. H., Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dynamic+nuclear+polarization-NMR+on+blood+plasma+for+assays+of+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism.</a> NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).</li>
<li>Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+of+Patients+with+Prostate+Cancer+Using+Hyperpolarized+%5B1-13C%5DPyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Trans.+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate.</a> Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108(2013).</li>
<li>Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cancer+Metabolism+by+Imaging+Hyperpolarized+Nuclei%3A+Prospects+for+Translation+to+Clinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research.</a> Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Magnetic+Resonance+as+a+Sensitive+Detector+of+Metabolic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function.</a> Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+T-1+limit%3A+Singlet+nuclear+spin+states+in+low+magnetic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22PRL%22%5BJournal%5D)">Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields.</a> PRL. 92 (15), 153003(2004).</li>
<li>Carravetta, M., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+long-lived+nuclear+spin+states+in+solution+nuclear+magnetic+resonance.+I.+Singlet+states+in+low+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field.</a> J. Chem. Phys. 122 (21), 214505(2005).</li>
<li>Vasos, P. R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+states+to+sustain+hyperpolarized+magnetization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization.</a> PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).</li>
<li>Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+long-lived+13C2+state+lifetimes+at+natural+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22JMR%22%5BJournal%5D)">Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance.</a> JMR. 239, 81-86 (2014).</li>
<li>Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-lived+nuclear+singlet+state+of+N-15-nitrous+oxide+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution.</a> JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).</li>
<li>Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nuclear+Singlet+Lifetime+of+More+than+One+Hour+in+Room-Temperature+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Ange.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution.</a> Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).</li>
<li>Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+Persistent+Singlet+State+of+N%282%29O+in+Blood+and+Other+Solvents-Potential+as+a+Magnetic+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22MRM%22%5BJournal%5D)">Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer.</a> MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Comment, A., van den Brandt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+a+DNP+prepolarizer+coupled+to+a+rodent+MRI+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner.</a> Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).</li>
<li>Balzan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Molecular+Magnetic+Resonance+Imaging+and+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+using+Hyperpolarized+Nuclei%22">Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei</a>. 5966, EPFL - EDPY. Available from:
 <a target="_blank" href="http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf">http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf</a> 1-140 (2013).</li>
<li>Bornet, A., Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+by+Cross+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JPC+Letters%22%5BJournal%5D)">Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization.</a> JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).</li>
<li>Bowen, S., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+injection+for+hyperpolarized+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy.</a> PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).</li>
<li>Cavadini, S., Vasos, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+states+open+the+way+to+longer+time-scales+in+the+measurement+of+diffusion+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy.</a> Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+States+in+Multiple-Spin+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-lived States in Multiple-Spin Systems.</a> Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+hyperpolarisation+preserved+in+long-lived+states%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states.</a> Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).</li>
<li>Sarkar, R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+of+15N-Choline+Metabolites+Enhanced+by+Dynamic+Nuclear+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization.</a> JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarları rakip olduğunu beyan

erime DNP NMR deneyinde kritik noktalar şunlardır: deneyler için gerekli olan en düşük ürün konsantrasyonu olarak gerçekleştirilir ve (ii) yaşam süreleri sinyalinin satın alma sayısını belirler: (i) alt-tabaka için elde polarizasyon seviyesi, manyetizasyon, kutuplaşma ve algılama siteleri arasında ve yüzey dönüşüm oranına transfer süresine göre. Burada tarif edilen çözünme DNP kurulum enjeksiyon sistemi kadar az 3-4 olarak sn numune transferi için izin verir. Transferi S. Bowen ve C. Hilty tarafından önerilen yöntemde g...

Dinamik nükleer polarizasyon (DNP), 1,2 yani nükleer spin polarizasyon, &#39;yukarı&#39; ve &#39;aşağı&#39; Spin popülasyonları (p = arasındaki dengesizliği geliştirmek için tasarlanmış bir tekniktir [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), ilk 1950 yılında tanıtıldı. Örneğin 13 ° C olarak nükleer spin tipik haliyle 1 K civarında bir ısıda ve biyolojik uygulamalarda bir atılım geldi 3.357 bir manyetik alan T. 3,4, uygun koşullarda, P = 10 -1 kadar polarize edilebilir bir faktör. düşük sıcaklıkta elde edilen yüksek nükleer polarizasyon seviyesini korurken süper ısıtılmış su içinde dondurulmuş polarize örnekleri çözündürülmesinden ibarettir erime DNP gelişimi 2000 erken 5 sıvı hal NMR sinyal geliştirilmiştir 10 3 -10 4 ile karşılaştırıldığında ortakRT NMR koşulları termal olarak polarize. Fesih DNP bu nedenle 1 sn veya daha az bir zamansal çözünürlüğe sahip NMR ile izleme dinamikleri izin gerçek zamanlı olarak yerinde non-invaziv önlem biyokimyasal reaksiyon oranları için bir yol sağlar 6 -. 10 O da çok düşük konsantrasyonlarda analitlerin tespit etmek mümkün olmuştur 11. non-invaziv moleküler görüntüleme yöntemlerinin arasında, hiperpolarize NMR aynı anda bir substrat ve gerçek zamanlı metabolik ürünlerini ölçmek sağlar tek tekniktir. Dağılma DNP metabolizması yerinde izlenmesi ile ilgili klinik MRG 12 ve en umut verici uygulamalara in vitro NMR arasında değişen çeşitli bilimsel alanlarda coşku ile karşılandı. 13,14 çözünme DNP ana sınırlama olduğunu, bu konuda bir süre sonra beş kez uzunlamasına gevşeme zamanı sabiti T 1 sırası, kutup gelişmişleştirilmesi kaybolur. Nispeten uzun bir T 1 sergileyen, nükleer spin taşıyan moleküller kullanımı gereklidir. Polarizasyon geliştirme zamana yayılma uzatmak için, uzun ömürlü devletler (LLS) olarak bilinen nükleer spin durumları, yavaş yavaş-rahatlatıcı, kullanılabilir 15 -. 17 LLS onların böylece, içi çift dipol-dipol etkileşimi duyarsız T LLS karakteristik gevşeme süresidir sabit. T 1 çok daha uzun dakika onlarca bir mıknatıslanma süresi 18 olabilir ve 1 saat kadar, bu nedenle elde edilebilir, 19,20 ve LLS manyetik rezonans spektroskopi hem de önerilmiştir (MRS) ve MR. 21 dikkatle hiperpolarize NMR ile enzimatik reaksiyon oranlarını incelemek için optimize edilmesi gereken başlıca noktalar şunlardır: (i) katı hal polarizasyon maksimize etmek ve (ii) den hyperpolarized çözümün transferi sırasında polarizasyon kaybını en aza indirmekNMR spektrometresi ile polarize. Bu makale enzimatik reaksiyonları incelemek için ısmarlama bir çözünme DNP cihaz ve enjeksiyon sisteminin adaptasyonu anlatır. Özellikleri ve kurulum performansı iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan hyperpolarized substrat [1- 13 C] pirüvat ile gösterilecektir. İkinci, birkaç dakika boyunca izleme reaksiyonları izin verir, ve onun merkezi rolü, bu seçim için başlıca nedenleri, ilk olarak, doğal olarak uzun 13C boyuna relaksasyon zamanı vardır (yüksek manyetik alanlar ve 293 K üzerindeki sıcaklıklarda T 1&gt; 50 sn) çözünme DNP NMR ve geliştirilmiş özel bir enjeksiyon sistemi, laktat dehidrogenaz (LDH) tarafından katalize piruvat oksidasyonunu kullanarak kanser metabolizması. 13,14 etiketsiz laktat 9,22 bir başlangıç ​​havuzu ya da eklenen herhangi bir etiketsiz laktat ile varlığında izlenebilir burada görüldüğü gibi. [1- 13C] laktat sinyal vi ölçülen gösterilmiştirhiperpolarize [1- 13C] piruvat enjeksiyonunun ardından (hücreler de dahil olmak üzere), VO bağlı pirüvat ve laktat arasındaki yerine laktat üretimine hızlı etiket değişimi esas olarak. 6 Biz burada LDH içeren bir NMR tüpü ama başlangıçta hiçbir laktat enjekte hiperpolarize [1- 13 C] piruvat gelen [1- 13 C] laktat gerçek zamanlı üretim sunuyoruz. Sistem açıklaması DNP polarize ve NMR spektrometresi: Bir çözünme DNP kurulumunda iki ana bölümden (Şekil 1) vardır. DNP polarize ana unsuru bir pompalanan helyum banyosunda yaklaşık 1 K numunenin soğutma Kriyostaz olduğunu. Kriyostat bir 3.35 T süper iletken mıknatıs yerleştirilmiş ve mıknatıs (Şekil 1) İzomerkez de polarize örnek olması için garanti bir geometriye sahiptir. kriyostat içinde, örnek, (a) bir polarizasyon B ölçmek için bir NMR bobini (B) ile çevrilidiruildup bir overmoded bir mikrodalga kavite (C) &#39;de ihtiva etmiştir. Bütün numune pompalanır helyum banyosuna (d) &#39;de, düşük sıcaklıkta tutulur ve dalga kılavuzu boyunca mikrodalgalar ile ışınlanır. Tüm sistem ısmarlama yazılımlar (Şekil 2B) tarafından yönetilmektedir. Donanım ve DNP gerçekleştirmek için gerekli kriyojenik ekipman ve sonraki çözünme hala teknolojik meydan okumadır. Yeni bir DNP kriyostat 23,24 geliştirilen ve kriyojenik performanslarını belirlemek için test ve ardından operasyon sırasında hızlı soğuma, helyum tutma zamanı ve genel asgari helyum tüketimi için optimize edilmiştir. kriyostat iki bölümden oluşmaktadır. Kriyostat ilk bölümü kuyruğu ya da örnek alanı (B) ve dış vakum odası (ovc), yüksek vakum ve yuva altında tutuldu: (a) yaklaşık olarak üst kısmında ayrılabilir yalıtım Dewar (Şekil 2A) olduğu radyasyon ekranlar (c). kriyostat ikinci bölümünde ana olduğunuSert (Şekil 2B), tüm içten akma düzenlemeleri yönetilir yalıtım dewar içine yerleştirilir. Transfer hattı (a) &#39;dan harici depolama Dewar gelen sıvı helyum, (b) ayırıcı içinde kondense birinci aşamasında, bir ara bölme kriyostat soğuk üst kısmı tutmak için ve buharlaştırılmıştır helyum çıkarmak için de kullanılmıştır nakil sırasında kullanılabilirler. Ayırıcı basıncı kriyostat üst kısmı etrafında sarılmış bir kılcal (c) ile pompalayarak indirilir; Bu kılcal soğuk helyum akış yalıtım Dewar (OVC) bölmeleri (d) ve radyasyon ekranları soğumasını kullanılır. Numune örnek uzayında yerleştirilir ve polarize edilir. Örnek alanı temel kriyostat ucun kuyruk sarılı bir kılcal (e) &#39;ayırıcı, bağlanır. Bu kılcal elle dışarıdan çalıştırılan bir iğne valf aracılığıyla açılabilir veya kapatılabilir. DNP pr sırasında kullanılan düşük sıcaklık elde etmek içinkapsayabilecektir, sıvı helyum kriyostat örnek uzayında toplanan gerekmektedir ve basınç mbar aralığında indirdi. Kriyostat çalışması için gerekli işlemler pompa, izlenmesi ve elektronik ve elektro-mekanik araçların (Şekil 2C) ile farklı noktalarda işletilen üç setleri ile oldukça karmaşık bir pompalama sistemi ile yapılmaktadır. Kriyostat ovc birinci pompalama sistemi ile yüksek vakum pompalanması gerekmektedir. Bu sistem, bir döner pompa (a) ile desteklenen bir turbo-moleküler pompa oluşmaktadır. sıvı helyum Kriyostat ayırıcı kriyostat transfer hattı girişi boyunca depolama Dewar (b) aktarılır. Ayırıcı ikinci pompalama grubu bağlı bir çıkış bulunur. Bu set, bir 35 m3 / saat membran pompası (c) oluşmaktadır. Bu hat Dewar gelen ve ayırıcı soğutma sırasında transferi sırasında haşlanmış helyum gazı çıkarmadan sağlar. ayırıcı toplanan sıvı helyum daha sonra kap ile örnek uzay aktarılabilirIllary borular, yukarıda tarif edilen. 65 m 3 / saat döner pompa (d) tarafından desteklenen pompa aralığı, 250 m 3 / saat Roots oluşan üçüncü bir pompalama sistemi mbar örnek alan ve daha sonra alt örneklem uzayı basıncına ayırıcıdan gelen sıvı helyum aktarmak için manuel kelebek vana (e) &#39;kriyostat bağlanır. Tüm vakum sistemi operasyonları kontrol ve bir elektro ısmarlama bir cihazın (f) tarafından düzenlenir. Bu cihaz, kriyostat ayırıcı (g) ve örnek alanı (h) çıkışları, ikinci / üçüncü pompa sistemleri (c, d), sıkıştırılmış bir helyum tankları (I) &#39;e ve dış arasındaki vakum hattı bağlantıları kontrol eder. (F) ve dış arasındaki iletişim, tek yönlü bir valf (j) geçer. elektro-pnömatik cihaz (f) yanı sıra tüm sistem parametreleri ve çözünme donanım ortak PC ile ısmarlama elektronik cihaz arayüz USB ile kontrol edilmekte ve işletilmektedir. Elektronik aracılığıyla nihayet bütün sistemi,Cihaz, ilgili işlemleri yazılım düğmelerini kullanarak bir arayüz üzerinden başlatılan ısmarlama bağımsız yazılım (Şekil 2B) tarafından yönetilmektedir. Örnek yönetmek ve ekler bir dizi kullanılır katı hal (Şekil 3A) NMR sinyali birikmesini ölçmek için. polarizasyon Kriyostat hazırlamak için kriyostat içine ana numune insert (a) yerleştirin. Ana Örnek insert bir overmoded altın kaplamalı mikrodalga boşluğunun içine yerleştirilmiş bir NMR bobini (B) temin edilmektedir. Ön dondurma çözeltisi içeren substrat uygun bir örnek kapta sıvı azot sıcaklığında (polarize çözüm) polarize ve fiberglas numune tutucu (c) uç alt kısmına yerleştirin edilecek. mıknatıs İzomerkez ulaşmak için ana numune içine doğru numune tutucu kaydırın. Numune tutucu altın kaplama dalga kılavuzu (d) takın. dalga kılavuzu harici mikrodalga kaynağından üretilen mikrodalga asgari kayıpları t yolculuk yapmasına olanak veriyorörnek o. Kriyostat yönetimi için ısmarlama yazılım, farklı işlemler bekleme süresi gibi, (kriyostat sıcaklığı sıvı helyum sıcaklığına yakın indirilir) kriyostat önceden belirlenmiş bir düzeye sıvı helyum ile doldurulur (dolum tekabül eden arayüz butonuna tıklayarak üzerine, otomatik olarak kolları ), (sıvı helyum banyosu mümkün olan en düşük sıcaklık elde etmek için pompalanır) T ≈ 1 K basınçlandırma soğutma ek bir adım (kriyostat 10-30 mbar riskleri olmaksızın kriyostat açılmasına izin verecek = P oda basıncının biraz üzerinde basınç uygulanır hava ile kriyostat kontaminasyon) ve çözünme (DNP örnek çözülür ve ölçüm sitesi, yani NMR spektrometre) elde edilen hyperpolarized çözüm aktarmak için otomatik prosedür. Polarizasyon polarize alan B 0 (94 GHz mikrodalga ile örnek ışınlanması yapılır </sub&gt; = 3.35 T). Bir örnek tamamen T DNP polarizasyon birikimi zamanıdır. T DNP belirli bir alanda ve sıcaklığında katı halde hedef çekirdeklerin boyuna relaksasyon zamanı aynı büyüklük düzenin 3 T DNP, sonra polarize sayılır. Tüm deneylerde numune fazla 5 T DNP için polarize edilmiştir. polarizasyon süresi sonunda, örnek enzimatik aktivite ölçümü için kullanılmak üzere bir RT çözeltisi içinde çözülmüş olması gerekir. Çözünme işlemi sırasında, çözünme insert (Şekil 3B) kazandan kızgın D 2 O 5 ml DNP geliştirilmiş örnek ulaşmak ve bunu eritmek için sıkıştırılmış helyum gazı (p = 6-8 bar) tarafından itilir. Elde edilen hyperpolarized çözüm çözünme eklemek çıkış ağzından, sıkıştırılmış helyum gazı ile çözünme ekleme dışarı itilir (Şekil 3C-b </strong&gt;), 2 mm iç çapı teflon transferi tüp. Çözünme süreci için gereken zaman. NMR spektrometre sitesine DNP polarize örnek transferi için gereken zaman 23 300 msn yaklaşık 3 sn. Çözünme süreci erime elemanını (Şekil 3B) kullanılarak gerçekleştirilir. çözünme insert bir elektronik-pnömatik montaj oluşur: (a), numune ile sızdırmaz bağlantıyı sağlayan pnömatik montaj kazan ve numune kabı soyunma (c) arasındaki bağlantı tüpleri içeren bir karbon fiber çubuk (b) konteyner ve geri prize dışarı. Elektro-pnömatik düzeneği (Şekil 3C) üretimi ve örnek kabına karbon fiber çubuk boyunca ısıtılmış D 2 O sürücü ve kriyostat gelen hiperpolarize çözeltinin özümlenmesi için kullanılır. elektro-pnömatik montaj co arasındaki bağlantıları kontrol pnömatik valfler (a) oluşmaktadırmpressed helyum (p = 6-8 bar) hattı (B), karbon fiber çubuk yoluyla D 2 O vana (d) &#39;enjekte edilir ısıtıcısı (c) ve çıkış (e) (f)&#39;. Sistem bir basınç G, bir termometre ve ısıtıcısı (c) &#39;de bir ısıtma direnç teli, bir tetikleyici (h) ve bir bağlantı kutusu (I)&#39; in elektronik yönetim cihazı ile, sistem arayüzü için kullanılan ile tamamlanmaktadır. DNP kriyostat ve NMR spektrometresi, bir transfer hattı, yani erime tetiklenir hiperpolarize çözelti, baskı altına alınan helyum ile itilir içindeki 2 mm, iç çapı (p = 6-8 bar) bir PTFE tüp ile bağlanmıştır. Çözünme sekansı aşağıdaki işlemlerden oluşmaktadır: ilk 300 msn&#39;de, süper ısıtılmış D 2 O hiperpolarize dondurulmuş çözelti eritilmesi ve eritmek için numune kabına doğru itilir. Daha sonra, hyperpolarized çözüm pres ortalamasından ile kriyostat elde edilirsurized (p = 6-8 bar) enjeksiyonu Aşama anlatılan prosedürlerin biri ile yapılır ölçüm sitesine helyum gazı ve 2 mm iç çap PTFE borusu içinden itilir (Şekil 3C-E) 6.2.1 veya 6.2 Adım 0,2. çözünme DNP NMR kurulum ikinci bileşeni NMR spektrometre olduğunu. Burada tarif edilen kurulumunda, NMR spektrometresi alan B 0 = 11.7 Tesla çalışır. 5 mm&#39;lik NMR prob çözünmesinden sonra hiperpolarize sinyalini ölçmek için kullanılır. NMR spektrometre solid-state ve sıvı-devlet hem de NMR ölçümleri için kullanılan, NMR konsolu aracılığıyla işletilen ve firma tarafından sağlanan yazılım XWINNMR edilmektedir. Tipik bir ölçüm düşük çevirme açısı sert darbe oluşan sinyal satın almalar takip (ya liquidstate veya un kalibre solid-state ölçümleri için, için, kalibre). katı hal termal polarizasyon sinyali ve DNP türevi si ölçümlerignal birikmesi NMR spektrometresi bağlanmış DNP polarize (Şekil 3Ab) yerinde ölçüye 13C bobini kullanılarak gerçekleştirilir. Bu özel durumda NMR spektrometre sinyal kilitleme yapmaz. Solid-state ölçümleri yapılırken, polarizasyon önemli tedirginlikler önlemek için, satın almalar arasındaki zaman gecikmesi kabaca uzun 0.5 T DNP daha uzun yeterli olmalıdır. solid-state geliştirme olarak tanımlanmaktadır <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation4.jpg" width="100" /> nerede <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" /> hyperpolarized sinyali (Aşama 3.3&#39;de elde edilmiş) ve <img alt="Equation6" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation6.jpg" width="23" /> (Kademe 3.2 pompalanan sıvı helyum sıcaklıkta, dengede elde edilmiş), katı durum sinyali (Şekil 4A) &#39;dir. Bu parametre dhyperpolarized çözümün transferi sırasında kaçınılmaz kayıplar öncesinde NMR deneyleri için kullanılabilir maksimum kutuplaşmayı, efines. Ölçüm un kalibre düşük çevirme açısı darbe kullanarak basit bir darbe acquire dizisi ile yapılır. Darbe kalibrasyonu yaygın katı hal ölçümler için atlanır. Benzer bir usul, sıvı halde hiperpolarize sinyal artışı belirlemek için kullanılabilir. Bu durumda, enjeksiyondan önce spektrometresi tüpüne yerleştirilmiştir örneği (Aşama 6.2), D 2 O 500 ul oluşmaktadır çözünme ve enjeksiyondan sonra izlemek için iki önemli parametre vardır. İlk, NMR spektrometresi yerinde hyperpolarized geliştirmesidir <img alt="Equation7" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation7.jpg" width="95" /> (Şekil 4B), <img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" /> Sinyal sadece hiper enjeksiyonundan sonra ise<html> (Adım 7.1 elde edilen) polarize çözüm ve <img alt="Equation9" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation9.jpg" width="20" /> Termal polarizasyon sinyali (Adım 7.2 elde edilen) &#39;dir. İkinci alt-tabaka ve (Kademe 7.1 &#39;de elde edilen üstel bağlantı sinyalleri ile elde edilir), her metabolik bir ürünü ile bağlantılı boyuna gevşeme süresi, T 1 (Şekil 4B, ek) vardır. Bu iki parametre, yeterli bir sinyal-gürültü oranı (SNR), ve metabolik dönüşümler ölçülmesi için uygun bir zaman penceresini elde etmek için gerekli en az alt-tabaka konsantrasyonu tanımlamaktadır. solid-state kutuplaşma arasındaki oran <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> ve liquidstate kutuplaşma <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> hyperpolarized çözüm transferi sırasında nedeniyle gevşeme polarizasyon zararların tahminini verir. Bir değeration12 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt; gevşeme kayıpları yokluğunda dikkat edilmelidir.

<table><tbody><tr><td>DNP polarizör</td><td>Vanderklink s.a.r.l (İsviçre)</td><td></td><td>Numune polarizasyonu için kriyostat ve elektronik ekipman</td></tr><tr><td>Vakum sistemi bileşenleri</td><td>Edwards vakum (Fransa)</td><td>Çeşitli</td><td> - turbomoleküler pompalama kurulumu - membran pompalama kurulumu - yüksek kapasiteli kök pompalama sistemi - vakum bağlantı parçaları ve bileşenleri </td></tr><tr><td>DNP 3.35T Magnet</td><td>Bruker (Fransa)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 MHz NMR Spektrometresi</td><td>Bruker (Fransa)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (US)</td><td></td><td>Veri analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SODIUM Pyruvate-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETHANOL-D6, SUSUZ, 99.5 ATOM % D</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 4-Hidroksi-TEMPO %97</td> <td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>Döteryum oksit</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etilen-diamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponu, pH&nbsp;=&nbsp; 7.0</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDH enzimi&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini, BSA</td><td>Sigma Aldrich (Fransa)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nmr ile gerçek zamanlı enzimatik reaksiyon hızı Ölçümleri için çözünme dinamik nükleer polarizasyon aletler

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

NMR tabanlı araştırmaların ana sınırlama düşük hassasiyettir. Bu nedenle metabolik dönüşümlerin gerçek zamanlı NMR ölçümleri önlenmesi, uzun satın alma süreleri için ister. çözünme DNP aracılığıyla hiperpolarizasyon duyarlılığı parçası elektron-to-çekirdeğe dönüş polarizasyon transferi kaynaklanan büyük out-of-denge nükleer manyetizasyon sayesinde sorunları circumvents. elde edilen yüksek NMR sinyali, gerçek zamanlı olarak kimyasal reaksiyonların izlenmesi için de kullanılabilir. Hiperpolarize NMR olumsuz ilişkili gevşeme zamanı sabiti sipariş üzerine olumlu durumlarda, nükleer spin uzunlamasına gevşeme zamanı sabiti, T 1, ya da sipariş üzerine genellikle sinyal alımı için mevcut olan sınırlı zaman penceresi içinde bulunduğu birleştiğinde çekirdeklerin tekli-devlet, T LLS. endojen moleküller ve metabolik oranları hücresel alımı tümör gelişiminde ve ilaç cevabına gerekli bilgi sağlayabilir. Nuyanında bir çok önceki hiperpolarize NMR çalışmaları, in vivo enzimatik aktivitesini izlemek için bir metabolik alt-tabaka olarak piruvat alaka göstermiştir. Bu çalışma, özellikle hyperpolarized NMR laktat dehidrogenaz (LDH) varlığında piruvat-to-laktat dönüşüm oranı, enzimatik reaksiyonların çalışması için gerekli olan deney düzeneği ve yöntemleri ayrıntılı bir açıklama sağlar.

çözünme DNP kullanarak NMR sinyali kazançlar DNP etkisi numunenin mikrodalga ışıması altında, genellikle istikrarlı radikal moleküller, NMR aktif çekirdeklere eşleşmemiş elektron spin yüksek kutuplaşma transferi oluşur. En sık kullanılan serbest radikallerin TAM (OXO63) ve TEMPOL vardır. 4 Polarizasyon prosedürleri TEMPOL kullanarak &#39;çapraz polarizasyon&#39; ile optimize edilebilir. 25 katı hal...

Çözünme dinamik nükleer polarizasyonu (DNP) tarafından sağlanan duyarlılık artışı, metabolik süreçlerin NMR ve MRI ile gerçek zamanlı olarak takip edilmesini sağlar. Enzimatik reaksiyonları incelemek için tasarlanmış özel bir çözünme DNP kurulumunun özellikleri ve performansları tartışılmaktadır.

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Bu deneyin genel amacı, dinamik nükleer polarizasyonla güçlendirilmiş nükleer manyetik rezonans kullanarak enzimatik süreçleri gerçek zamanlı olarak takip etmektir. Dinamik nükleer polarizasyon (DNP) ile güçlendirilmiş sıvı haldeki manyetik rezonans, kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: örneğin, hücre içindeki veya in vivo ortamdaki bir molekül çiftinin enzimatik dönüşüm hızlarının, bu molekül çiftine herhangi bir şekilde müdahale etmeden nasıl belirleneceği gibi. Çözünme DNP ekipmanlarımızın laboratuvarımıza kurulması ve Lozan'daki Arnaud Comment Laboratuvarı'nda doktora derecesini almış olan Dr. Riccardo Balzan'ın aramıza katılması, araştırmalarımız için büyük bir adımdır.DNP, 500 megahertz NMR spektrometrelerimizde gerçekleştirebileceğimiz deneylerin hassasiyetini önemli ölçüde artırır. Bu DNP ekipmanı Fransa'da kurulan ilk ekipmandır ve bu ekipmanın işlevsel hale getirilmesinde NMR ekibimizin tüm üyelerinin yer aldığını belirtmek isterim; özellikle araştırma mühendisimiz Gildas Bertho ve maitre de conferences'imiz Fatiha Kateb'e teşekkür ederim. Bu tekniğin temel avantajı, substratın ve onun endojen türevlerinin saniyeler düzeyinde zaman çözünürlüğü ile doğrudan ve gerçek zamanlı olarak kantifikasyonuna olanak tanımasıdır.Polarizasyon çözeltisi için, karbon 13 gözlemleri amacıyla, iki bir hacim döteryumlanmış su ile bir bir hacim döteryumlanmış etanol karışımı içerisinde, 33 milimolar TEMPO radikali katkılı, 1,12 molar, karbon 13 işaretli sodyum pirüvat çözeltisinden iki mililitre hazırlayın. Kriyostat yazılım arayüzündeki soğutma düğmesine tıklayarak soğutma prosedürünü gerçekleştirin ve dinamik nükleer polarizasyon veya DNP kriyostat sıcaklığını düşürün. Doldurma prosedürünü kullanarak DNP kriyostatında sıvı helyum toplayın.Kriyostat yazılım arayüzündeki doldurma düğmesine tıklayın. Ardından, DNP polarizörü ile birlikte verilen numune kabına 300 µL optimize edilmiş polarizasyon çözeltisi yerleştirin. İçinde numune bulunan numune kabını, nazikçe sıvı azot banyosuna daldırarak dondurun.Dondurma işleminden sonra numune kabında bulunabilecek sıvı azotu, numune kabını sıvı azot banyosundan çıkarıp ters çevirerek uzaklaştırın. Ardından, önce numune kabını numune tutucuya yerleştirerek numuneyi kriyostata yerleştirin. Daha sonra, mikrodalga dalga kılavuzunu numune tutucuya yerleştirmeden önce numune tutucuyu ana kriyostat ekine yerleştirin.Bir Kelvin soğutma prosedürünü başlatarak kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzündeki bir Kelvin soğutma butonuna tıklayın. Mikrodalga kaynağını açın ve kriyostat yazılım arayüzündeki mikrodalgalar açık butonuna tıklayarak numuneye ışınım uygulayın.NMR konsol deteksiyon kanalının koaksiyel kablosunu, konnektörü 90 derece saat yönünün tersine döndürüp çekerek spektrometre bobininden ayırın. Deteksiyon kanalının koaksiyel kablosunu, kriyostat NMR bobininin koaksiyel konnektörüne takın. Ardından, yönlendirme pinine dikkat ederek, NMR konsol kablosunun erkek konnektörünü kriyostat NMR bobininin dişi konnektörüne yerleştirin.Konnektörü sıkıca itin ve saat yönünde 90 derece döndürün. Kalibre edilmemiş, düşük çevirme açılı darbelerin t eşittir beş dakika aralıklarla tekrarlandığı basit bir darbe-toplama dizisi kullanarak, kriyostat bölgesinde katı haldeki NMR termal sinyalini ölçün. Ölçüm kurulumunu tamamladıktan sonra, yazılımın komut satırına zg yazın ve klavyeden enter tuşuna basın.Polarizasyon prosedürünü başlattıktan sonra, termal sinyal ölçümü için kullanılan prosedür ve koşullarla aynı şekilde katı haldeki DNP ile güçlendirilmiş NMR sinyalini ölçün. NMR konsolu dedeksiyon kanalı koaksiyel kablosunu, konnektörü saat yönünün tersine 90 derece döndürüp çekerek kriyostat NMR bobininden ayırın. Ardından, dedeksiyon kanalının koaksiyel kablosunu spektrometre bobininin koaksiyel konnektörüne takın.NMR konsol kablosunun erkek konnektörünü, yönlendirme pinine dikkat ederek spektrometre bobininin dişi konnektörüne takın. Sıkıca itin ve konnektörü saat yönünde 90 derece döndürün. 20 µg/mL sığır serum albümini içeren reaksiyon tamponunda, mililitre başına bir ünite olacak şekilde taze tavşan kas LDH çözeltisi hazırlayın.Ardından, spektrometre alanının stabilizasyonunu veya kilitlemesini sağlamak için 478 microliter reaksiyon tamponu, 2 microliter LDH çözeltisi ve 20 microliter döteryumlanmış suyu karıştırın. Daha sonra, 500 microliter çözelti hacmini 5 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. Transfer tüpünü, hiperpolarize çözeltiyi transfer için kullanılan helyum gazından ayıran otomatik, özel yapım bir enjeksiyon cihazına bağlayın.Cihaz, numune tüpüne otomatik olarak 500 µL hiperpolarize çözelti iletir. Çözünmeden önce, 500 µL numune içeren beş milimetrelik NMR tüpünü 11.74 tesla NMR spektrometresinin izosantrine yerleştirin. Çözünme insert ısıtıcısına 5 mL döteryumlanmış su ekleyin.Kriyostat yazılım arayüzündeki ısıtıcıyı hazırla düğmesine tıklayarak, yaklaşık 180 ila 200 degrees Celsius sıcaklığa ulaşana kadar döteryumlanmış suyu dirençli tel aracılığıyla basınçlandırın ve ısıtın. Kriyostat yazılım arayüzündeki SS Operasyonları düğmesine tıklayın. Ardından, mikrodalga kılavuzunu çözme ekinden çıkarın.Çözünme ekini numune tutucusunun içine doğru kaydırın. Çözünme eki, numune tutucusunun tabanına ulaşmalı ve döteryumlanmış suyun kriyostatın içine sızmasını önlemek için numune kabı ile sızdırmaz bir bağlantı kuracak şekilde sıkıca itilmelidir. Pnömatik valf işlemlerinden oluşan önceden belirlenmiş zamanlı bir dizi olan çözünme sekansını başlatmak için donanım tetikleyicisine basın.Çözünme işleminin hemen ardından, enjeksiyon cihazı 500 microliters hiperpolarize çözeltiyi NMR spektrometresine yerleştirilen numune ile karıştırır. Çözünmeden sonra, substrat ve ürünün mıknatıslanma ilerlemesini takip etmek için spektrometredeki numuneden, 1.5 saniye aralıklı bir dizi 10 derece, flip angle pulse-acquire sekansları ile NMR hiperpolarize sinyalini ölçün. Ölçümü ayarladıktan sonra, yazılımın komut satırına zg yazın ve enter tuşuna basın.Manyetizasyon tamamen gevşediğinde, yaklaşık 3T1'e karşılık gelen, yaklaşık üç dakika aralıklı bir dizi 90 derecelik çevirme açısı pulse-acquire dizileri ile NMR termal sinyalini ölçün. Ölçümü ayarladıktan sonra, yazılımın komut satırına zg yazın ve enter tuşuna basın. Burada, tekrarlanan 10 derecelik çevirme açısı pulslarından elde edilen spektrumların zaman seyri, tekniğin hassasiyetini ve zaman çözünürlüğünü göstermektedir.Piruvat substratının ve laktat ürününün pik tanımlamalarının ardından, metabolitlerin sinyal entegrasyonu yoluyla kantifikasyon gerçekleştirilir. Enzimatik aktivite, ürün sinyal zaman seyri doğrusal bir modelle fit edilerek belirlenir. Ölçümü doğrulamak için aynı miktar, ürün ve substrat sinyallerinin oranından elde edilen başlangıç reaksiyon hızıyla değerlendirilir.Yöntem kavrandıktan sonra, düzgün bir şekilde uygulandığında enzim aktivitesinin tam ölçümü yaklaşık iki saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, NMR için yüksek derecede polarize edilmiş bir substratın nasıl üretileceği, bunun enzim içeren bir çözeltiye nasıl enjekte edileceği ve enzim aktivitesinin DNP ile geliştirilmiş NMR kullanılarak nasıl takip edileceği konusunda bilgi sahibi olmalısınız. Bu prosedür uygulanırken, enzim çözeltisinin taze enzim ve ko-substratlar ile dikkatlice hazırlanması ve numune tüpünde hava kabarcığı oluşmamasına özen gösterilmesi önemlidir.Sıvı fazda DNP ile geliştirilmiş manyetik rezonansın gelişmesiyle birlikte araştırmacılar, ürün oluşum hızını ölçerek çeşitli hücre tiplerinde substrat alımını ve bunun enzimatik dönüşümünü artık inceleyebilmektedir. Kriyojenik ekipman ve yüksek manyetik alanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu ölçümler gerçekleştirilirken, kriyojenlere karşı kişisel koruyucu ekipman kullanmak ve manyetik nesnelerin bulunmadığını doğrulamak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.Klasik NMR'den farklı olarak, çözünme DNP tabanlı NMR, substrata ve yaşam süresinin mevcut durumuna bağlı olarak en fazla birkaç dakikalık bir deneysel zaman penceresi ile sınırlıdır. Bu durum, tek boyutlu spektroskopinin ötesine geçilmesinin önünde bir engel teşkil etmektedir. Çözünme DNP NMR'ın, klasik çok boyutlu NMR'ın çok yönlülük düzeyine ulaştırılması için geliştirilmeye ihtiyacı vardır.

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Çok bölmeli dinamik fantom, hiperpolarize mıknatıs rezonans ajanları kullanılarak metabolik çalışmalar için ilgilenilen bazı biyolojiyi simüle etmek için kullanılır.

Hiperpolarize Manyetik Rezonans Ajanlar Araştırmaları bir Multi-bölmesi Dinamik Tek Enzim Phantom Kullanımı

Yeni bir elektron para-manyetik rezonanstır (EPR) yöntemi, hızlı tarama EPR (RS-EPR), geleneksel bir sürekli dalga (CW) teknikten üstün ve in vivo görüntüleme için yeni alanları açar 2B spektral mekansal görüntüleme için gösterilmiştir. Sonuçlar 250 MHz'de gösterilmiş, ancak teknik herhangi bir frekansta uygulanabilir.

Hızlı Tarama Elektron Paramagnetik Rezonans Görüntüleme Fizyolojik Önemli Parametreler için Yeni bulvarlar açar<em&gt; İn Vivo</em

Dinamik nükleer polarizasyon ve ardından numune çözünmesi, biyolojik sistemlerde gerçek zamanlı metabolizma çalışmalarını mümkün kılmıştır. Hiperpolarize [1-13C] piruvat, in vitro bir prostat karsinomu hücre hattında laktat dehidrojenaz aktivitesini incelemek için kullanıldı.

hyperpolarized 13 C Metabolik Manyetik Rezonans Spektroskopisi ve Görüntüleme

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Hızlı alan döngüsü netometrisi kullanarak, dinamik nükleer polarizasyon yoluyla hiperpolarize edilmiş 13C'lik zenginleştirilmiş bileşiklerin spin-kafes gevşeme süresinin manyetik alan bağımlılığını ölçmek için bir protokol sayılmaktadır. Özellikle, bunu[1-13C] pirüuvat ile gösterdik, ancak protokol diğer hiperpolarize substratlara genişletilebilir.

Hiperpolarize Spin-Kafes Gevşeme manyetik alan bağımlılığının ölçülmesi [1-13C]pirüuvat

Burada 15 Ngevşeme dispersiyon profillerinin çözelti NMR spektroskopisi ile edinilmesi ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokolün detaylı bir açıklaması sağlanmaktadır.

15 μs-ms Zaman Ölçeğinde Protein Konformasyonsal Dinamiklerinin Araştırılması için N CPMG Gevşeme Dağılımı

Nötron geri saçılma spektroskopisi, proteinlerin ps-ns dinamiklerine ve hidrasyon suyuna tahribatsız ve etiketsiz bir erişim sunar. İş akışı, amiloid proteinleri üzerine iki çalışma ile sunulmaktadır: agregasyon sırasında lizozimin zamanla çözülmüş dinamikleri ve tau'nun lif oluşumu üzerine hidrasyon suyu dinamikleri üzerine.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, yapısal protein dinamiklerini kalıntıya özgü bir şekilde karakterize edebilir. NMR 15N R1 ve R2 gevşeme ve {1H}-15N heteronükleer Overhauser etkisi (hetNOE) deneylerini kaydetmek için pikosaniye ila nanosaniye zaman ölçeğine duyarlı uygulamalı bir protokol sunuyoruz.

NMR 15N Proteinlerin Pikosaniye ve Nanosaniye Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Gevşeme Deneyleri

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Keşfedin çözünme dinamik nükleer polarizasyon (DNP) ile NMR'de enzimatik süreçleri gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, molekülleri değiştirmeden enzim dönüşüm hızlarını belirlemeyi sağlar.

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

Daha fazla video keşfet