NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

Bu deneyin genel amacı, dinamik nükleer polarizasyonla güçlendirilmiş nükleer manyetik rezonans kullanarak enzimatik süreçleri gerçek zamanlı olarak takip etmektir. Dinamik nükleer polarizasyon (DNP) ile güçlendirilmiş sıvı haldeki manyetik rezonans, kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: örneğin, hücre içindeki veya in vivo ortamdaki bir molekül çiftinin enzimatik dönüşüm hızlarının, bu molekül çiftine herhangi bir şekilde müdahale etmeden nasıl belirleneceği gibi. Çözünme DNP ekipmanlarımızın laboratuvarımıza kurulması ve Lozan'daki Arnaud Comment Laboratuvarı'nda doktora derecesini almış olan Dr. Riccardo Balzan'ın aramıza katılması, araştırmalarımız için büyük bir adımdır.

DNP, 500 megahertz NMR spektrometrelerimizde gerçekleştirebileceğimiz deneylerin hassasiyetini önemli ölçüde artırır. Bu DNP ekipmanı Fransa'da kurulan ilk ekipmandır ve bu ekipmanın işlevsel hale getirilmesinde NMR ekibimizin tüm üyelerinin yer aldığını belirtmek isterim; özellikle araştırma mühendisimiz Gildas Bertho ve maitre de conferences'imiz Fatiha Kateb'e teşekkür ederim. Bu tekniğin temel avantajı, substratın ve onun endojen türevlerinin saniyeler düzeyinde zaman çözünürlüğü ile doğrudan ve gerçek zamanlı olarak kantifikasyonuna olanak tanımasıdır.

Polarizasyon çözeltisi için, karbon 13 gözlemleri amacıyla, iki bir hacim döteryumlanmış su ile bir bir hacim döteryumlanmış etanol karışımı içerisinde, 33 milimolar TEMPO radikali katkılı, 1,12 molar, karbon 13 işaretli sodyum pirüvat çözeltisinden iki mililitre hazırlayın. Kriyostat yazılım arayüzündeki soğutma düğmesine tıklayarak soğutma prosedürünü gerçekleştirin ve dinamik nükleer polarizasyon veya DNP kriyostat sıcaklığını düşürün. Doldurma prosedürünü kullanarak DNP kriyostatında sıvı helyum toplayın.

Kriyostat yazılım arayüzündeki doldurma düğmesine tıklayın. Ardından, DNP polarizörü ile birlikte verilen numune kabına 300 µL optimize edilmiş polarizasyon çözeltisi yerleştirin. İçinde numune bulunan numune kabını, nazikçe sıvı azot banyosuna daldırarak dondurun.

Dondurma işleminden sonra numune kabında bulunabilecek sıvı azotu, numune kabını sıvı azot banyosundan çıkarıp ters çevirerek uzaklaştırın. Ardından, önce numune kabını numune tutucuya yerleştirerek numuneyi kriyostata yerleştirin. Daha sonra, mikrodalga dalga kılavuzunu numune tutucuya yerleştirmeden önce numune tutucuyu ana kriyostat ekine yerleştirin.

Bir Kelvin soğutma prosedürünü başlatarak kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzündeki bir Kelvin soğutma butonuna tıklayın. Mikrodalga kaynağını açın ve kriyostat yazılım arayüzündeki mikrodalgalar açık butonuna tıklayarak numuneye ışınım uygulayın.

NMR konsol deteksiyon kanalının koaksiyel kablosunu, konnektörü 90 derece saat yönünün tersine döndürüp çekerek spektrometre bobininden ayırın. Deteksiyon kanalının koaksiyel kablosunu, kriyostat NMR bobininin koaksiyel konnektörüne takın. Ardından, yönlendirme pinine dikkat ederek, NMR konsol kablosunun erkek konnektörünü kriyostat NMR bobininin dişi konnektörüne yerleştirin.

Konnektörü sıkıca itin ve saat yönünde 90 derece döndürün. Kalibre edilmemiş, düşük çevirme açılı darbelerin t eşittir beş dakika aralıklarla tekrarlandığı basit bir darbe-toplama dizisi kullanarak, kriyostat bölgesinde katı haldeki NMR termal sinyalini ölçün. Ölçüm kurulumunu tamamladıktan sonra, yazılımın komut satırına zg yazın ve klavyeden enter tuşuna basın.

Polarizasyon prosedürünü başlattıktan sonra, termal sinyal ölçümü için kullanılan prosedür ve koşullarla aynı şekilde katı haldeki DNP ile güçlendirilmiş NMR sinyalini ölçün. NMR konsolu dedeksiyon kanalı koaksiyel kablosunu, konnektörü saat yönünün tersine 90 derece döndürüp çekerek kriyostat NMR bobininden ayırın. Ardından, dedeksiyon kanalının koaksiyel kablosunu spektrometre bobininin koaksiyel konnektörüne takın.

NMR konsol kablosunun erkek konnektörünü, yönlendirme pinine dikkat ederek spektrometre bobininin dişi konnektörüne takın. Sıkıca itin ve konnektörü saat yönünde 90 derece döndürün. 20 µg/mL sığır serum albümini içeren reaksiyon tamponunda, mililitre başına bir ünite olacak şekilde taze tavşan kas LDH çözeltisi hazırlayın.

Ardından, spektrometre alanının stabilizasyonunu veya kilitlemesini sağlamak için 478 microliter reaksiyon tamponu, 2 microliter LDH çözeltisi ve 20 microliter döteryumlanmış suyu karıştırın. Daha sonra, 500 microliter çözelti hacmini 5 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. Transfer tüpünü, hiperpolarize çözeltiyi transfer için kullanılan helyum gazından ayıran otomatik, özel yapım bir enjeksiyon cihazına bağlayın.

Cihaz, numune tüpüne otomatik olarak 500 µL hiperpolarize çözelti iletir. Çözünmeden önce, 500 µL numune içeren beş milimetrelik NMR tüpünü 11.74 tesla NMR spektrometresinin izosantrine yerleştirin. Çözünme insert ısıtıcısına 5 mL döteryumlanmış su ekleyin.

Kriyostat yazılım arayüzündeki ısıtıcıyı hazırla düğmesine tıklayarak, yaklaşık 180 ila 200 degrees Celsius sıcaklığa ulaşana kadar döteryumlanmış suyu dirençli tel aracılığıyla basınçlandırın ve ısıtın. Kriyostat yazılım arayüzündeki SS Operasyonları düğmesine tıklayın. Ardından, mikrodalga kılavuzunu çözme ekinden çıkarın.

Çözünme ekini numune tutucusunun içine doğru kaydırın. Çözünme eki, numune tutucusunun tabanına ulaşmalı ve döteryumlanmış suyun kriyostatın içine sızmasını önlemek için numune kabı ile sızdırmaz bir bağlantı kuracak şekilde sıkıca itilmelidir. Pnömatik valf işlemlerinden oluşan önceden belirlenmiş zamanlı bir dizi olan çözünme sekansını başlatmak için donanım tetikleyicisine basın.

Çözünme işleminin hemen ardından, enjeksiyon cihazı 500 microliters hiperpolarize çözeltiyi NMR spektrometresine yerleştirilen numune ile karıştırır. Çözünmeden sonra, substrat ve ürünün mıknatıslanma ilerlemesini takip etmek için spektrometredeki numuneden, 1.5 saniye aralıklı bir dizi 10 derece, flip angle pulse-acquire sekansları ile NMR hiperpolarize sinyalini ölçün. Ölçümü ayarladıktan sonra, yazılımın komut satırına zg yazın ve enter tuşuna basın.

Manyetizasyon tamamen gevşediğinde, yaklaşık 3T1'e karşılık gelen, yaklaşık üç dakika aralıklı bir dizi 90 derecelik çevirme açısı pulse-acquire dizileri ile NMR termal sinyalini ölçün. Ölçümü ayarladıktan sonra, yazılımın komut satırına zg yazın ve enter tuşuna basın. Burada, tekrarlanan 10 derecelik çevirme açısı pulslarından elde edilen spektrumların zaman seyri, tekniğin hassasiyetini ve zaman çözünürlüğünü göstermektedir.

Piruvat substratının ve laktat ürününün pik tanımlamalarının ardından, metabolitlerin sinyal entegrasyonu yoluyla kantifikasyon gerçekleştirilir. Enzimatik aktivite, ürün sinyal zaman seyri doğrusal bir modelle fit edilerek belirlenir. Ölçümü doğrulamak için aynı miktar, ürün ve substrat sinyallerinin oranından elde edilen başlangıç reaksiyon hızıyla değerlendirilir.

Yöntem kavrandıktan sonra, düzgün bir şekilde uygulandığında enzim aktivitesinin tam ölçümü yaklaşık iki saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, NMR için yüksek derecede polarize edilmiş bir substratın nasıl üretileceği, bunun enzim içeren bir çözeltiye nasıl enjekte edileceği ve enzim aktivitesinin DNP ile geliştirilmiş NMR kullanılarak nasıl takip edileceği konusunda bilgi sahibi olmalısınız. Bu prosedür uygulanırken, enzim çözeltisinin taze enzim ve ko-substratlar ile dikkatlice hazırlanması ve numune tüpünde hava kabarcığı oluşmamasına özen gösterilmesi önemlidir.

Sıvı fazda DNP ile geliştirilmiş manyetik rezonansın gelişmesiyle birlikte araştırmacılar, ürün oluşum hızını ölçerek çeşitli hücre tiplerinde substrat alımını ve bunun enzimatik dönüşümünü artık inceleyebilmektedir. Kriyojenik ekipman ve yüksek manyetik alanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu ölçümler gerçekleştirilirken, kriyojenlere karşı kişisel koruyucu ekipman kullanmak ve manyetik nesnelerin bulunmadığını doğrulamak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Klasik NMR'den farklı olarak, çözünme DNP tabanlı NMR, substrata ve yaşam süresinin mevcut durumuna bağlı olarak en fazla birkaç dakikalık bir deneysel zaman penceresi ile sınırlıdır. Bu durum, tek boyutlu spektroskopinin ötesine geçilmesinin önünde bir engel teşkil etmektedir. Çözünme DNP NMR'ın, klasik çok boyutlu NMR'ın çok yönlülük düzeyine ulaştırılması için geliştirilmeye ihtiyacı vardır.