Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinde gen transkripsiyonunun düzenlenmesini incelemek için alele özgü CRISPR/Cas9 aracılı delesyonu kullanmaktır. Monoalelik delesyonları oluşturmak ve analiz etmek için hibrit bir genom kullanan bu tekniğin temel avantajı, canlı kalmayabilecek monoalelik gelişmiş delesyonları analiz etme gereksinimini ortadan kaldırmasıdır.

Bu yöntem, fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, belirli bir enhancer'ın hangi geni düzenlediği ve söz konusu genin aktivitesi için herhangi bir enhancer'a ne kadar bağımlı olduğu gibi. Bu yöntem kök hücre pluripotensine dair içgörüler sağlayabildiği gibi, diğer sistemlere de uygulanabilir.

Örneğin, kök hücrelerin nöronlara, kan hücrelerine veya kas dokusuna dönüşmek için kaderlerini nasıl değiştirdiklerini anlamamıza yardımcı olabilir. Kullanılacak olan kılavuz RNA'nın (gRNA) dizisini tasarlayıp oluşturduktan ve doğruladıktan sonra, endotoksin içermeyen plazmitleri ES hücrelerine transfekte etmeye hazırlanın. Bir santrifüj kullanarak, Mus musculus 129 ile Mus castaneus çaprazlanmasıyla elde edilen 1x10⁶ F1 embriyonik kök hücresini 1,5 mililitrelik bir tüpte 300 ×g'de beş dakika boyunca çöktürün.

Santrifüj sonrası süpernatantı atın ve kit üreticisi tarafından sağlanan resüspansiyon tamponundan 100 µL ekleyin. Hedef DNA bölgesinin delesyonu için, beşer µg P Cas9 GFP 5-prime ve 3-prime gRNA plazmidleri ekleyin. Bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın.

Herhangi bir hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Ardından, mikroporatörün elektronik pipet ucunu kullanarak, ucun içine hava girmemesine özen göstererek 100 µL elektroporasyon karışımını aspire edin. Daha sonra, pipeti transfeksiyon cihazına takın.

Uygun protokolü seçin ve başlat düğmesine basın. Elektroporasyon işlemi sürerken ucu gözlemleyin. Kurulum doğruysa, tüp elektrodundan küçük kabarcıklar çıkmalıdır.

Bir kıvılcım, hava kabarcığının varlığını gösterir ve transfeksiyona müdahale eder. Böyle bir durum oluşursa, elektroporasyon yeni bir hücre grubuyla tekrarlanmalıdır. Elektroporasyonun ardından, transfekte edilen hücreleri on mililitre ES hücre besiyeri içeren on santimetrelik jelatin kaplı bir kaba boşaltın.

Transfekte edilen hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. 48 saat sonra, GFP pozitif ES hücrelerini ayırmak ve izole etmek için bir akış sitometresi kullanın. Ardından, 10 mL ES hücresi medyumu içeren 10 cm'lik, jelatin kaplı bir kaba 1 ile 1,5 × 10⁴ arasında GFP pozitif hücre ekleyin.

Bu düşük yoğunlukta ekim yapmak, tekil ES hücre kolonilerinin seçilmesini kolaylaştıracaktır. Dört beş gün sonra, mikroskop kullanarak tekil, küre şeklinde, tekil ES hücre kolonilerini tanımlayın. Bir pipet yardımıyla her bir koloniyi, jelatinle ön işlem görmüş ve 30 µL tripsom içeren 96 kuyucuklu bir plağın bir kuyucuğuna aktarın.

Tüm koloniler seçilip besiyerine ayrıştırıldıktan sonra, hücreleri çoğu kuyucuk %70 konfluens düzeyini aşana kadar 37 °C'de karbondioksit inkübatöründe büyütün. Bu işlem genellikle yaklaşık iki gün sürer. Hücreler pasajlama için hazır olduğunda, besiyerini uzaklaştırın ve 30 µL tripsin ekleyin.

Hücreleri beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, tripsini nötralize etmek için her kuyucuğa 180 µL ES hücre besiyeri ekleyin. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için pipetle yukarı ve aşağı hareketler yapın.

Her kuyucuktan, her birinde 130 µL ES hücre ortamı içeren, jelatin kaplı üç adet 96 kuyucuklu plakanın her birine 70 µL transfer edin. 37 °C'de inkübe edin. Plakalar %70 ila %85 konfluense ulaştığında, sonraki bölümlerde açıklandığı şekilde her bir klonun genotipleme ve ekspresyon analizini gerçekleştirmek için kullanın.

Hücre stoklarını ekteki belgede açıklandığı şekilde dondurun. Burada, klonların istenen delesyon açısından taranması için dört set primer tasarlanacaktır. Bunlar; iç primerler, dış primerler ve her iki 5-prime ve 3-prime gRNA hedef bölgeleri için gRNA çevreleyici primerleri içerir.

129 ve Cas genotiplerine karşılık gelen tek nükleotid polimorfizmi (single nucleotide polymorphism) veya snip izini elde etmek için burada gösterilen web sitesini ziyaret ederek başlayın. Bu işlem sizi Mitchell Lab CRISPR web sayfasına yönlendirecektir. Orada, verilen bağlantıya tıklayın.

Site, MM-9 fare genom montajındaki 129 ve Cas genomları arasındaki snip'leri görüntüleyen izleği içeren UCSC genom tarayıcısına yönlendirecektir. Ardından, silinecek bölgenin koordinatlarını girin ve "go" butonuna tıklayın. İstenen silme işleminin ortasında, üçten fazla snip içeren yaklaşık 500 baz çiftlik bir bölgeye yakınlaşın.

SNP'ler seyrek olduğunda, alele özgü primer tasarımı karmaşık olabilir. Mutlak alele özgü primerler tasarlamak mümkün değilse, orta derecede alele özgü primerler kullanılabilir. Sadece qPCR sonuçlarının analizi sırasında, silinmiş ve silinmemiş klonlar arasındaki CT değerlerini karşılaştırmayı unutmayın.

Şimdi, üst paneldeki "View" (Görünüm) seçeneğine tıklayın. Açılır menüden "DNA"yı seçin. "Get DNA in Window" (Pencerede DNA'yı Al) sayfası görüntülenecektir.

Sıralama biçimlendirme seçeneklerinde, tüm harflerin büyük olması seçeneğini belirleyin ve ardından hedef diziyi tamamen büyük harflerle görüntülemek için "Get DNA" düğmesine tıklayın. Bu diziyi kopyalayıp bir Word belge dosyasına yapıştırın. Daha sonra, diziyi 129 cast snip iziyle karşılaştırın, snip pozisyonlarını vurgulayın ve 129 snip'i küçük harflerle işaretleyin.

129 dizisini tamamladığınızda, iki adet fast day formatlı dizi oluşturmak için diziyi kopyalayın. Biri 129 için, diğeri ise Cas için olsun. Cas dizisinde, her snip pozisyonuna doğru bazı yerleştirin ve snip'i küçük harfle işaretleyin.

Ardından, diziyi karşılık gelen genomla, 129 veya Cas ile etiketleyin. Daha sonra, tarayıcıya Primer3Plus adresini yazın. Uygun alana, nükleotid değişimi yapılmış 129 dizisini yapıştırın.

Primerleri tasarlamak için varsayılan ayarları kullanın. İç alele özgü primerleri tasarlamak için "Task" seçeneğinin sağındaki açılır menüye tıklayın ve "Primer List"i seçin, ardından "Pick Primers"a tıklayın. İleri ve geri primerlerin listelendiği yeni bir sayfa açılacaktır.

3-prime ucunda veya 3-prime ucunun dört baz uzağında küçük harfle işaretlenmiş bir snip içeren ileri veya geri primerini seçmek için seçim kutusunu kontrol edin. 3-prime ucunda snip bulunan primerlerin qPCR sırasında artan alel spesifikliği gösterdiğini unutmayın. Ekranın altındaki "Send to Primer3 Manager" düğmesine tıklayın.

Seçili primeri görüntüleyen yeni bir sayfa açılacaktır. İkinci primeri seçmek için primer listesi sayfasına dönün ve ana sayfaya dönmek için geri düğmesine tıklayın. Görev açılır menüsünden Tespit'i seçin.

Ana sayfa yenilenecek ve alt kısımda bir sol ve bir sağ primer dizi kutusu görünecektir. İlk primer dizisini uygun kutuya yapıştırın. Ardından, Ana sekmesinin yanında bulunan Genel Ayarlar sekmesine gidin ve ürün boyut aralığı ayarını 80 ila 200 baz çifti olarak değiştirin.

"Pick Primers" (Primerleri Seç) butonuna tıklayın. İlk primer dizisi için beş olası primer çiftinin görüntülendiği bir sayfa açılacaktır. Primerlerin solundaki kutucukları işaretleyerek primer çiftleri listesinden bir primer seti seçin ve ekranın altındaki "Send to Primer3 Manager" (Primer3 Yöneticisine Gönder) butonuna tıklayın. Bunlar 129 iç alele özgü primerler olacaktır.

Cast aleli için primerleri tasarlamak amacıyla bu adımları tekrarlayın. Ardından, bu tekniği dış alele özgü primerlerin ve alele özgü olmayan primerlerin tasarımına uygulayın. Son olarak, beraberindeki belgede açıklandığı şekilde qPCR kullanarak primerlerin alel özgüllüğünü test edin.

Daha önce hazırlanan 96 kuyucuklu plakadan genomik DNA'yı ekstrakte edin. Kuyucukların tabanında biriken yoğuşmaları çöktürmek için plağı kısa süreliğine santrifüjleyin. Bu DNA, delesyon taraması için kalıp olarak hizmet edecektir.

Ardından, 384 kuyucuklu bir plakta, her klon için qPCR gerçekleştirin ve işlemi tekrarlayın. Tespit aşamasını içeren, ardından eritme eğrisi analizi ile devam eden iki adımlı PCR kullanın. Çalışmanın ardından, öncelikle her allelin amplifikasyonunu iç allele özgü primerler ile kontrol edin.

Bir allelin amplifiye olmaması veya alleller arasında beş döngüden fazla CT değeri farkı olması, bu klonların heterozigot bir delesyon taşıdığını gösterir. Her iki allelin de amplifiye olmaması, homozigot bir delesyon taşıdıklarını gösterir. Ardından, her bir allelin amplifikasyonunu dış allele özgü primerler ile kontrol edin.

Hedef delesyon 1 KB'den daha büyükse, dış primerlerle amplifikasyon yalnızca bir delesyon mevcut olduğunda gerçekleşecektir. 22 ile 28 arasındaki bir CT değeri delesyonu doğrular. 1 KB'den küçük hedef delesyonlar için amplikon boyutunu elektroforez ile doğrulayın.

Delesyon klonlarının bulunduğu 96 kuyucuklu bir plaka, alele özgü iç primerler kullanılarak qPCR ile taranmıştır. Gri çubuklar Cas-özgü primerleri ve siyah çubuklar 129-özgü primerlerden gelen amplifikasyonu temsil etmektedir. İç primerlerle düşük bir CT değeri veya amplifikasyon olmaması, hedef delesyonu gösterir.

Bir veya her iki alelde delesyon bulunan klonlar daha sonra dış primerlerle taranır. Dış primerlerle yapılan amplifikasyon, delesyonu doğrular. Monoallelik delesyona sahip klonlar, silinmeyen aleldeki insersiyonların veya delesyonların (indel olarak adlandırılan) yokluğunu doğrulamak için gRNA hedef bölgelerinin yanındaki primerler kullanılarak taranır.

Sadece, silinmemiş aleldeki hedef bölgelerde büyük indel'ler bulunmayan monoallelik klonlar sonraki ekspresyon analizinde kullanılır. Burada 129 veya Cas SCR silinmiş klonlardan elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. SCR, ES hücrelerinde yakın zamanda tanımlanmış Sox2 spesifik bir enhancer'dır.

Kırmızı çubuklar Sox2 Cas alelinin ekspresyonunu, mavi çubuklar ise Sox2 129 alelinin amplifikasyonunu temsil etmektedir. Bu şekilde görülebileceği üzere, 129 veya Cas alelindeki SCR'nin silinmesi, CIS'deki Sox2 ekspresyonunu azaltmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, CRISPR teknolojisini kullanarak nasıl geniş bir silinme oluşturulacağı ve silinmiş klonlarınızın genotiplemesini yapmak için alele özgü primerlerin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.