Name: Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinde CRISPR/Cas9 ile monoallelik delesyon oluşturmayı. Bu yöntem gen transkripsiyon düzenlemesini ve artırıcı fonksiyonunu incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yararlı tartışmalar için Mitchell laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri, Kanada İnovasyon Vakfı ve Ontario Araştırma ve Yenilik Bakanlığı (JAM tarafından düzenlenen işletme ve altyapı hibeleri) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
<li>Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid-specific%2C+developmental-stage-independent+enhancer+far+upstream+of+the+human+%27beta-like+globin%27+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).</li>
<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
<li>Mlynarczyk-Evans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosomes+alternate+between+two+states+prior+to+random+X-inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation.</a> PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+base+mispairs+by+Taq+DNA+polymerase%3A+implications+for+single+nucleotide+discrimination+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).</li>
<li>Keane, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+variation+and+its+effect+on+phenotypes+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation.</a> Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).</li>
<li>Yalcin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-based+characterization+of+structural+variation+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome.</a> Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması Jüpiter politikalarını okumak ve ifşa çatışmaları hiçbir sahibiz.

CRISPR / Cas9 aracılı genom düzenleme teknolojisi genom değişiklik için, basit, hızlı ve ucuz bir yöntem sağlar. Fonksiyonel güçlendirici karakterizasyonu için monoallelik güçlendirici iptali gerçekleştirilebilir ve analiz etmek için burada açıklanan yöntem F1 fare hücrelerinde SNP yararlanır. Bu tip bir yaklaşımın avantajları şunlardır: 1) monoallelik güçlendirici silme kritik güçlendirici örneğin, her iki allellerinin ölümcül hücre gelen düzenlenmiş genin protein düzeylerinde büyük bir azalma silinmiş veya de...

Kopyalama düzenleyici elemanlar nedeniyle anormal gen ifadesinin 2 hastalığın neden olabilir, bu elemanların geliştirilmesi 1 ve modifikasyonu esnasında gen sentezlenmesinin yerleşim-zaman ince ayar için kritik öneme sahiptir. Genom ilişki çalışmaları ile tanımlanan birçok hastalıkla ilişkili bölgeler kodlayıcı olmayan bölgelerinde ve transkripsiyon arttırıcı 3-4 özelliklerine sahiptir. Güçlendiricileri belirlenmesi ve genellikle birkaç kilobazlık uzaklıkta da düzenleyen genler arasında yer almaktadır ve dokuya özel bir tarzda 5-6 aktive edilebilir karmaşık düzenleyen genler ile bulundu. Artırıcı tahminleri yaygın histon modifikasyonu işaretleri, arabulucu-kohezinin kompleksleri dayalı ve hücre tipine spesifik transkripsiyon bağlayıcı 7-10 faktörler vardır. Tahmin edilen arttırıcı validasyonu çoğunlukla arttırıcı bir raportör gen 11-12 ekspresyonunu aktive olan bir vektör bazlı deney yapılır. Bu veriler, v sağlarvarsayılan arttırıcı dizilerinin düzenleyici potansiyeli hakkında aluable bilgi ama onların endojen genomik bağlamda kendi işlevini açığa ya da düzenleyen genleri tanımlamak yok. Genom düzenleme kaybı fonksiyon-analizi ile kendi endojen bağlamda transkripsiyonel düzenleyici elemanlarının fonksiyonunu incelemek için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. genom düzenleme, yani CRISPR / Cas9 genom düzenleme sisteminde son gelişmeler, genom fonksiyonunun soruşturma kolaylaştırmak. CRISPR / Cas9 sistemi birçok biyolojik sistemler için kullanımı kolay ve uyarlanabilir. Cas9 proteini bir kılavuz RNA (gRNA) 13 tarafından genomunda belirli bir site hedeflenmektedir. SpCas9 / gRNA kompleksi protospacer bitişik motifi (PAM) dizisi, NGG 14-15 5 &#39;olmalıdır hedef genomik dizisi için genom tarar. hedefine gRNA, gRNA tamamlayıcı olan bir 20 nükleotid (nt) dizisi baz çiftleşmesi, doubl elde SpCas9 nükleaz aktivitesi aktivee iplikli sonu (DSB) PAM dizisinin yukarı 3 bp. Özgünlük gRNA tohum bölgede tam baz eşleşmesi ile elde edilir, 6-12 PAM bitişik nt; Bunun aksine, tohum, genellikle 16-17 tolere edilir &#39;5 uymuyordur. katılmadan homolog olmayan sonunda (NHEJ) DNA onarım veya homoloji yönettiği onarım (HDR) mechanisms.NHEJ DNA onarım sık sık bozabilir hedef bölgeye bir kaç bp ekleme / silme (indeller) oluşturur ya tanıttı DSB tamir edilebilir bir genin açık okuma çerçevesinin (ORF). Ilgili bölgeyi kuşatan genom iki gRNAs, daha büyük silme oluşturmak için 18-19 kullanılabilir. Bu yaklaşım, lokus kontrol bölgeleri ya da geleneksel arttırıcılar 9,18,20-22 daha büyük olan süper arttırıcı olarak kümelenmiş transkripsiyonel arttırıcılar çalışma için özellikle yararlıdır. Monoallelik silmeler transkripsiyon sis -Yönetmeliği çalışmak için değerli bir modeldir. gözlenen changBir artırıcı madde monoallelik silindikten sonra transkript düzeyinde e hem alel transkripsiyon hücresel uygunluğu etkileyen potansiyel etkilenir oluşabilir karıştırıcı etkileri olmadan gen regülasyonu bu güçlendirici rolü ilişkilidir. azaltılmış ifade değerlendirilmeden ancak vahşi tip allel silinmiş ayırt yeteneği olmadan zordur. Ayrıca, iki allel ayırt yeteneği olmadan her alel de silmeleri genotipleme özellikle PCR ile tüm yabani tip bölgeyi yükseltmek için zor olduğu 1 Mb 23&gt; 10 kb büyük delesyonlar için, zordur. Mus castaneus ile aradaki Mus musculus 129 tarafından üretilen F1 ES hücrelerinin kullanımı iki aleli alel-spesifik PCR 18,24 ayırt edilmesini sağlar. Bu hücrelerde melez genom alel spesifik silme tarama ve ifade analizi kolaylaştırır. Ortalama olarak bu iki genomları arasındaki her 125 bp bir SNP varİfade ve genotip için astar tasarım esnekliği sağlayan analiz eder. Bir SNP varlığı astar erime sıcaklığı (Tm) etkilemek ve iki allel 25 ayrımcılık sağlayan gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) amplifikasyon özgüllük hedefleyebilir. Ayrıca primerin 3 &#39;ucu olan bir uyumsuzluk büyük ölçüde istenmeyen bir alel hedef 26 amplifikasyonunu önleyici astar uzanacak şekilde DNA polimerazın yeteneğini etkiler. CRISPR / Cas9 genom düzenleme sistemi (Şekil 1) kullanılarak daha büyük 1 kb alel spesifik güçlendirici kromozom anormallikleri ve daha sonra ekspresyon analizi için F1 ES hücrelerinin kullanımı, aşağıdaki protokolde tarif edilmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> Sis -reg incelemek için CRISPR / Cas9 kullanarak Şekil 1. Artırıcı silmeGen ifadesinin ulation. Mus musculus 129 ve Mus castaneus arasında çapraz tarafından üretilen (A) F1 ES hücreleri alel spesifik silinmesi için izin vermek için kullanılır. (B) iki kılavuz RNA&#39;lar (gRNA) geliştirici bölgesinin büyük Cas9 aracılı silme indüklemek için kullanılır. (C) Primer setleri büyük mono- ve bi-alelik silme tanımlamak için kullanılır. Turuncu primerler içinde primerler olarak mor primerler dış primerleri ve yeşil primerler gRNA kuşatan primerlerdir bulunmaktadır. Gen ekspresyonunda (D) değişiklikleri alel spesifik qPCR kullanılarak izlenmektedir. RFU nispi floresan üniteleri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>gRNA montajında kullanılan yüksek kaliteli DNA polimeraz</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vektör</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>gRNA plazmidini oluşturmak için bu vektöre bir hedef dizi klonlanır</td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>Kodon için optimize edilmiş SpCas9 ve EGFP pCas9_GFP ortak ekspresyon plazmidi</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon Sistemi 100 & mikro; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Microporator transfeksiyon teknolojisi</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM PT10500</td><td></td><td>genomik DNA ekstraksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & PCR Temizleme</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Plazmid Mini Kiti</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Plazmid Kiti Endotoksin İçermez&nbsp;</td><td>CFX</td> Life Technologies için Geneaid <td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR seçim karışımı</td><td></td><td>4472942</td><td>qPCR reaktifi</td></tr><tr><td>iScript cDNA sentez kiti</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>Ters transkripsiyon reaktifi</td></tr><tr>EDTA <td>Life Technologies</td><td>ile %0.25 Tripsin</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td>Biyodükkan EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA fraksiyonu V (% 7,5)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Maksimum Verimlilik DH5 ve alfa; yetkin hücreler</td><td>İnvitrojen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES hücresi nitelikli</td><td></td><td>FBS, pluripotentlik için fare ES hücrelerinde önceden bir teste tabi tutulur</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Gerekli olmayan aminoasit</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Sızdırmazlık bandı</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405 alkolsüz</td><td>hücre dondurma kabı</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>F1 ES hücre kültürü için inhibitör</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>F1 ES hücre kültürü için</td><td>invivogen</td><td>inh-pd32</td> İnhibitörü</tr><tr><td>F1</td><td>ES hücre kültürü için LIF Chemicon ESG1107 İnhibitörü</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yaratma crispr / cas9 aracılığı monoallelik delesyonlar fare embriyonik kök hücreleri artırıcı fonksiyonu eğitim için

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Arttırıcılar, dokuya özgü gen ekspresyonunu pozisyon ve oryantasyondan bağımsız bir şekilde düzenleyerek hücre kimliğini kontrol eder. Bu güçlendiriciler genellikle intergenik bölgelerde veya hatta başka bir genin vücudu içinde düzenlenmiş genden distal olarak bulunur. Arttırıcı aktivitenin konumdan bağımsız doğası, arttırıcıları düzenledikleri genlerle eşleştirmeyi zorlaştırır. Bir arttırıcı bölgenin silinmesi, arttırıcı aktivite için doğrudan kanıt sağlar ve bir arttırıcının endojen gen transkripsiyonundaki rolünü ortaya çıkarmak için altın standarttır. Konvansiyonel homolog rekombinasyon tabanlı delesyon yöntemleri, çok sayıda model organizmanın genomlarında hızlı ve kesin olarak konumlandırılmış değişiklikleri mümkün kılan genom düzenleme teknolojisindeki son gelişmelerle aşılmıştır. CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme, Cas9'un ısmarlama bir ekspresyon plazmidinden bir kılavuz RNA tarafından genoma hedeflenebilme kolaylığı nedeniyle, birçok hücre tipinde ve organizmada genomu hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde manipüle etmek için kullanılabilir. Temel gen düzenleyici elementlerin homozigot silinmesi ölümcüllüğe yol açabilir veya hücresel fenotipi değiştirebilirken, transkripsiyonel arttırıcıların monoalelik silinmesi, bu kafa karıştırıcı sorun olmadan gen ekspresyonunun cis-regülasyonunun incelenmesine izin verir. Burada, F1 fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde (Mus musculus129 x Mus castaneus) CRISPR/Cas9 aracılı delesyon için bir protokol sunulmaktadır. Monoalelik delesyon, tarama ve ekspresyon analizi, bu hücrelerde ortalama olarak her 125 bp'de bir meydana gelen iki alel arasındaki tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) ile kolaylaştırılır.

Burada açıklanan protokol CRISPR / Cas9 genom düzenleme (Şekil 1) kullanılarak oluşturulan monoallelik güçlendirici silinen hücrelerin gen ekspresyonunun cis Ziraî çalışma F1 ES hücreleri kullanır. genotipleme ve gen ifadesi için gRNA ve alel-spesifik primer tasarımı bu yaklaşımda önemli faktörlerdir. Her alel-spesifik primer seti alel özgünlüğünü teyit etmek qPCR tarafından onaylanmalıdır. Sadece, ilgili genomik DNA hedef amplifiye alel-özgül primerler ...

Geliştirici aktivitenin deneysel doğrulamasına en iyi fonksiyon kaybı analizi ile yaklaşılır. Burada, hibrit bir genom (Mus musculus129 x Mus castaneus) içeren F1 ES hücrelerinde gen transkripsiyonunun alele özgü regülasyonunu incelemek için CRISPR/Cas9 aracılı delesyon kullanan etkili bir protokol sunulmaktadır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinde gen transkripsiyonunun düzenlenmesini incelemek için alele özgü CRISPR/Cas9 aracılı delesyonu kullanmaktır. Monoalelik delesyonları oluşturmak ve analiz etmek için hibrit bir genom kullanan bu tekniğin temel avantajı, canlı kalmayabilecek monoalelik gelişmiş delesyonları analiz etme gereksinimini ortadan kaldırmasıdır.Bu yöntem, fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, belirli bir enhancer'ın hangi geni düzenlediği ve söz konusu genin aktivitesi için herhangi bir enhancer'a ne kadar bağımlı olduğu gibi. Bu yöntem kök hücre pluripotensine dair içgörüler sağlayabildiği gibi, diğer sistemlere de uygulanabilir.Örneğin, kök hücrelerin nöronlara, kan hücrelerine veya kas dokusuna dönüşmek için kaderlerini nasıl değiştirdiklerini anlamamıza yardımcı olabilir. Kullanılacak olan kılavuz RNA'nın (gRNA) dizisini tasarlayıp oluşturduktan ve doğruladıktan sonra, endotoksin içermeyen plazmitleri ES hücrelerine transfekte etmeye hazırlanın. Bir santrifüj kullanarak, Mus musculus 129 ile Mus castaneus çaprazlanmasıyla elde edilen 1x10⁶ F1 embriyonik kök hücresini 1,5 mililitrelik bir tüpte 300 ×g'de beş dakika boyunca çöktürün.Santrifüj sonrası süpernatantı atın ve kit üreticisi tarafından sağlanan resüspansiyon tamponundan 100 µL ekleyin. Hedef DNA bölgesinin delesyonu için, beşer µg P Cas9 GFP 5-prime ve 3-prime gRNA plazmidleri ekleyin. Bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın.Herhangi bir hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Ardından, mikroporatörün elektronik pipet ucunu kullanarak, ucun içine hava girmemesine özen göstererek 100 µL elektroporasyon karışımını aspire edin. Daha sonra, pipeti transfeksiyon cihazına takın.Uygun protokolü seçin ve başlat düğmesine basın. Elektroporasyon işlemi sürerken ucu gözlemleyin. Kurulum doğruysa, tüp elektrodundan küçük kabarcıklar çıkmalıdır.Bir kıvılcım, hava kabarcığının varlığını gösterir ve transfeksiyona müdahale eder. Böyle bir durum oluşursa, elektroporasyon yeni bir hücre grubuyla tekrarlanmalıdır. Elektroporasyonun ardından, transfekte edilen hücreleri on mililitre ES hücre besiyeri içeren on santimetrelik jelatin kaplı bir kaba boşaltın.Transfekte edilen hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. 48 saat sonra, GFP pozitif ES hücrelerini ayırmak ve izole etmek için bir akış sitometresi kullanın. Ardından, 10 mL ES hücresi medyumu içeren 10 cm'lik, jelatin kaplı bir kaba 1 ile 1,5 × 10⁴ arasında GFP pozitif hücre ekleyin.Bu düşük yoğunlukta ekim yapmak, tekil ES hücre kolonilerinin seçilmesini kolaylaştıracaktır. Dört beş gün sonra, mikroskop kullanarak tekil, küre şeklinde, tekil ES hücre kolonilerini tanımlayın. Bir pipet yardımıyla her bir koloniyi, jelatinle ön işlem görmüş ve 30 µL tripsom içeren 96 kuyucuklu bir plağın bir kuyucuğuna aktarın.Tüm koloniler seçilip besiyerine ayrıştırıldıktan sonra, hücreleri çoğu kuyucuk %70 konfluens düzeyini aşana kadar 37 °C'de karbondioksit inkübatöründe büyütün. Bu işlem genellikle yaklaşık iki gün sürer. Hücreler pasajlama için hazır olduğunda, besiyerini uzaklaştırın ve 30 µL tripsin ekleyin.Hücreleri beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, tripsini nötralize etmek için her kuyucuğa 180 µL ES hücre besiyeri ekleyin. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için pipetle yukarı ve aşağı hareketler yapın.Her kuyucuktan, her birinde 130 µL ES hücre ortamı içeren, jelatin kaplı üç adet 96 kuyucuklu plakanın her birine 70 µL transfer edin. 37 °C'de inkübe edin. Plakalar %70 ila %85 konfluense ulaştığında, sonraki bölümlerde açıklandığı şekilde her bir klonun genotipleme ve ekspresyon analizini gerçekleştirmek için kullanın.Hücre stoklarını ekteki belgede açıklandığı şekilde dondurun. Burada, klonların istenen delesyon açısından taranması için dört set primer tasarlanacaktır. Bunlar; iç primerler, dış primerler ve her iki 5-prime ve 3-prime gRNA hedef bölgeleri için gRNA çevreleyici primerleri içerir.129 ve Cas genotiplerine karşılık gelen tek nükleotid polimorfizmi (single nucleotide polymorphism) veya snip izini elde etmek için burada gösterilen web sitesini ziyaret ederek başlayın. Bu işlem sizi Mitchell Lab CRISPR web sayfasına yönlendirecektir. Orada, verilen bağlantıya tıklayın.Site, MM-9 fare genom montajındaki 129 ve Cas genomları arasındaki snip'leri görüntüleyen izleği içeren UCSC genom tarayıcısına yönlendirecektir. Ardından, silinecek bölgenin koordinatlarını girin ve "go" butonuna tıklayın. İstenen silme işleminin ortasında, üçten fazla snip içeren yaklaşık 500 baz çiftlik bir bölgeye yakınlaşın.SNP'ler seyrek olduğunda, alele özgü primer tasarımı karmaşık olabilir. Mutlak alele özgü primerler tasarlamak mümkün değilse, orta derecede alele özgü primerler kullanılabilir. Sadece qPCR sonuçlarının analizi sırasında, silinmiş ve silinmemiş klonlar arasındaki CT değerlerini karşılaştırmayı unutmayın.Şimdi, üst paneldeki "View" (Görünüm) seçeneğine tıklayın. Açılır menüden "DNA"yı seçin. "Get DNA in Window" (Pencerede DNA'yı Al) sayfası görüntülenecektir.Sıralama biçimlendirme seçeneklerinde, tüm harflerin büyük olması seçeneğini belirleyin ve ardından hedef diziyi tamamen büyük harflerle görüntülemek için "Get DNA" düğmesine tıklayın. Bu diziyi kopyalayıp bir Word belge dosyasına yapıştırın. Daha sonra, diziyi 129 cast snip iziyle karşılaştırın, snip pozisyonlarını vurgulayın ve 129 snip'i küçük harflerle işaretleyin.129 dizisini tamamladığınızda, iki adet fast day formatlı dizi oluşturmak için diziyi kopyalayın. Biri 129 için, diğeri ise Cas için olsun. Cas dizisinde, her snip pozisyonuna doğru bazı yerleştirin ve snip'i küçük harfle işaretleyin.Ardından, diziyi karşılık gelen genomla, 129 veya Cas ile etiketleyin. Daha sonra, tarayıcıya Primer3Plus adresini yazın. Uygun alana, nükleotid değişimi yapılmış 129 dizisini yapıştırın.Primerleri tasarlamak için varsayılan ayarları kullanın. İç alele özgü primerleri tasarlamak için "Task" seçeneğinin sağındaki açılır menüye tıklayın ve "Primer List"i seçin, ardından "Pick Primers"a tıklayın. İleri ve geri primerlerin listelendiği yeni bir sayfa açılacaktır.3-prime ucunda veya 3-prime ucunun dört baz uzağında küçük harfle işaretlenmiş bir snip içeren ileri veya geri primerini seçmek için seçim kutusunu kontrol edin. 3-prime ucunda snip bulunan primerlerin qPCR sırasında artan alel spesifikliği gösterdiğini unutmayın. Ekranın altındaki "Send to Primer3 Manager" düğmesine tıklayın.Seçili primeri görüntüleyen yeni bir sayfa açılacaktır. İkinci primeri seçmek için primer listesi sayfasına dönün ve ana sayfaya dönmek için geri düğmesine tıklayın. Görev açılır menüsünden Tespit'i seçin.Ana sayfa yenilenecek ve alt kısımda bir sol ve bir sağ primer dizi kutusu görünecektir. İlk primer dizisini uygun kutuya yapıştırın. Ardından, Ana sekmesinin yanında bulunan Genel Ayarlar sekmesine gidin ve ürün boyut aralığı ayarını 80 ila 200 baz çifti olarak değiştirin."Pick Primers" (Primerleri Seç) butonuna tıklayın. İlk primer dizisi için beş olası primer çiftinin görüntülendiği bir sayfa açılacaktır. Primerlerin solundaki kutucukları işaretleyerek primer çiftleri listesinden bir primer seti seçin ve ekranın altındaki "Send to Primer3 Manager" (Primer3 Yöneticisine Gönder) butonuna tıklayın. Bunlar 129 iç alele özgü primerler olacaktır.Cast aleli için primerleri tasarlamak amacıyla bu adımları tekrarlayın. Ardından, bu tekniği dış alele özgü primerlerin ve alele özgü olmayan primerlerin tasarımına uygulayın. Son olarak, beraberindeki belgede açıklandığı şekilde qPCR kullanarak primerlerin alel özgüllüğünü test edin.Daha önce hazırlanan 96 kuyucuklu plakadan genomik DNA'yı ekstrakte edin. Kuyucukların tabanında biriken yoğuşmaları çöktürmek için plağı kısa süreliğine santrifüjleyin. Bu DNA, delesyon taraması için kalıp olarak hizmet edecektir.Ardından, 384 kuyucuklu bir plakta, her klon için qPCR gerçekleştirin ve işlemi tekrarlayın. Tespit aşamasını içeren, ardından eritme eğrisi analizi ile devam eden iki adımlı PCR kullanın. Çalışmanın ardından, öncelikle her allelin amplifikasyonunu iç allele özgü primerler ile kontrol edin.Bir allelin amplifiye olmaması veya alleller arasında beş döngüden fazla CT değeri farkı olması, bu klonların heterozigot bir delesyon taşıdığını gösterir. Her iki allelin de amplifiye olmaması, homozigot bir delesyon taşıdıklarını gösterir. Ardından, her bir allelin amplifikasyonunu dış allele özgü primerler ile kontrol edin.Hedef delesyon 1 KB'den daha büyükse, dış primerlerle amplifikasyon yalnızca bir delesyon mevcut olduğunda gerçekleşecektir. 22 ile 28 arasındaki bir CT değeri delesyonu doğrular. 1 KB'den küçük hedef delesyonlar için amplikon boyutunu elektroforez ile doğrulayın.Delesyon klonlarının bulunduğu 96 kuyucuklu bir plaka, alele özgü iç primerler kullanılarak qPCR ile taranmıştır. Gri çubuklar Cas-özgü primerleri ve siyah çubuklar 129-özgü primerlerden gelen amplifikasyonu temsil etmektedir. İç primerlerle düşük bir CT değeri veya amplifikasyon olmaması, hedef delesyonu gösterir.Bir veya her iki alelde delesyon bulunan klonlar daha sonra dış primerlerle taranır. Dış primerlerle yapılan amplifikasyon, delesyonu doğrular. Monoallelik delesyona sahip klonlar, silinmeyen aleldeki insersiyonların veya delesyonların (indel olarak adlandırılan) yokluğunu doğrulamak için gRNA hedef bölgelerinin yanındaki primerler kullanılarak taranır.Sadece, silinmemiş aleldeki hedef bölgelerde büyük indel'ler bulunmayan monoallelik klonlar sonraki ekspresyon analizinde kullanılır. Burada 129 veya Cas SCR silinmiş klonlardan elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. SCR, ES hücrelerinde yakın zamanda tanımlanmış Sox2 spesifik bir enhancer'dır.Kırmızı çubuklar Sox2 Cas alelinin ekspresyonunu, mavi çubuklar ise Sox2 129 alelinin amplifikasyonunu temsil etmektedir. Bu şekilde görülebileceği üzere, 129 veya Cas alelindeki SCR'nin silinmesi, CIS'deki Sox2 ekspresyonunu azaltmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, CRISPR teknolojisini kullanarak nasıl geniş bir silinme oluşturulacağı ve silinmiş klonlarınızın genotiplemesini yapmak için alele özgü primerlerin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

generating-crisprcas9-mediated-monoallelic-deletions-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Bu iletişim kuralını tasarlayın ve çoğaltılmış arttırıcılar deactivating füzyon protein SID4X-dCas9-KRAB, olarak da bilinen artırıcı girişim (Enhancer-i) ile hedefleme gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Bu iletişim kuralı gen ekspresyonu düzenleyen arttırıcılar tanımlaması sağlar ve ortak bir hedef geni düzenleyen arttırıcılar arasındaki ilişkileri diseksiyon kolaylaştırır.

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Burada, embriyonik kök hücreler kullanarak, özellikle büyük DNA knock-in (KI) için genetiği değiştirilmiş fare modelleri geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak ayarlanır ve geleneksel homolog rekombinasyon aracılı doğrusallaştırılmış DNA hedefleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş KI verimliliği ile sonuçlanır.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Bu makale, CRISPR/Cas9 sistemi ve üç fenotip tabanlı tarama stratejisi kullanılarak sentromerle ilişkili protein-E (CENP-E) nakavt hücrelerinin yapımını bildirmektedir. İlaç geliştirme ve biyolojik araştırmalar için yararlı olan CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yeni bir yaklaşım oluşturmak için CENP-E nakavt hücre hattını kullandık.

CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinde CRISPR/Cas9 ile monoallelik delesyon oluşturmayı. Bu yöntem gen transkripsiyon düzenlemesini ve artırıcı fonksiyonunu incelemek için kullanılır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Daha fazla video keşfet