Dizi-CGH, Bütün exome sıralama ve rahim içinde elektroporasyon Rodents beyin malformasyonlar için sorumlu genlerin tanımlamak için birleştirerek yeni bir strateji

Bu prosedürün genel amacı, beyin malformasyon bozuklukları için yeni aday genleri tanımlamak ve nedensel rollerini in vivo olarak doğrudan doğrulamaktır. Bu strateji, beyin gelişimi ve ilişkili patolojilerle ilişkili moleküler yolları keşfederek nörobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu stratejinin temel avantajı, beyin bozuklukları ile ilişkili yeni genlerin keşfedilmesine ve yeni tanı araçlarının geliştirilmesine yardımcı olmasıdır.

Bu yaklaşımı kullanarak, anormal nöronal göçün neden olduğu bir beyin malformasyonu olan periventriküler nodüler heterotopinin patogenezinde C6orf70 geninin önemli katkısını açıklayabiliriz. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir mühendis olan Fabienne Schaller olacak. Yazılı protokolde belirtildiği gibi ve kurumsal ve ulusal yönergelere göre prosedür için bir E15 hamile sıçan hazırlayın.

Hayvanın uygun şekilde uyuşturulduğundan, gözlere oftalmik merhem sürüldüğünden ve karnın uygun şekilde traş edildiğinden ve dezenfekte edildiğinden emin olun. Deride ve kaudal karın kasında iki santimetrelik dikey bir kesi yapmak için keskin bir makas kullandıktan sonra, orta hat karın boşluğundan bir uterus boynuzunu dikkatlice ortaya çıkarır. Embriyoları nemlendirmek için 37 santigrat derece önceden ısıtılmış normal salin solüsyonunu damla damla uygulayın.

İşlem boyunca uterusu nemli tutun. DNA'yı enjekte etmek için, bir elinizde bir embriyoyu nazikçe tutun ve kafası kolayca erişilebilir hale getirin. Daha sonra, diğer elinizi kullanarak, orta hattan bir milimetre uzakta ve iki ila üç milimetre derinlikte bulunan sol yan ventriküle bir mikroenjektöre bağlı bir cam kılcal damarı dikkatlice yerleştirin.

Enjeksiyonun görsel olarak izlenmesine izin vermek için yaklaşık bir mikrolitre DNA'yı hızlı yeşil ile enjekte etmek için mikroenjektörü kullanın. DNA'yı hücrelere elektropore etmek için, önce normal salin çözeltisini üç x yedi milimetre elektrotun yüzeyine damlatın. Daha sonra pozitif elektrodu enjekte edilen tarafa ve negatif elektrodu enjekte edilmemiş sağ ventriküle yerleştirin.

950 milisaniye aralıklarla beş elektrik darbesi vermek için ayak kontrollü pedalı kullanın. Elektroporasyonu takiben, uterus boynuzunu karın boşluğuna geri getirin ve embriyoların daha doğal bir şekilde pozisyon almasını sağlamak ve intraoperatif sıvı kaybını hesaba katmak için steril salin ekleyin. Kas duvarını emilebilir cerrahi dikişlerle kapatın, ardından basit bir kesikli dikiş kullanarak cildi kapatın.

Ameliyat sonrası analjezi 48 saate kadar veya kurumsal kılavuzlarda belirtildiği şekilde sağlayın. Fareyi temiz ev kafesine geri koyun ve anesteziden çıkana kadar izleyin. Protokolün yazılı kısmında belirtildiği gibi beyinleri% 4 paraformaldehit ile sabitledikten sonra, PBS'de 10 dakika boyunca yıkayın.

Yıkarken, çözünmüş agarozun sıcaklığının 50 santigrat dereceyi geçmemesine dikkat ederek PBS'de 50 mililitre% 4 agar hazırlayın. Agarozu plastik gömme kalıplarına dökün ve ardından beyinleri agarozun içine yerleştirin. Gömülü beyinleri dört santigrat dereceye yerleştirin ve agarozun en az bir saat polimerize olmasına izin verin.

Agaroz polimerize olduktan sonra, beynin etrafındaki fazla agarozu kesin, ardından beyni, beynin ön arka erişimi bıçağa dik olacak şekilde vibratom taban plakasına yapıştırın. Yapıştırıcının kuruması için birkaç dakika bekledikten sonra, yapıştırılmış beyinli plakayı vibratom odasına yerleştirin. Vibratomu PBS ile doldurun ve 100 mikron kalınlığındaki bölümleri dilimlemeye başlayın.

Kesitleri aldıktan sonra, bölümleri mikroskop slaytlarına aktarın ve fazla sıvıyı çıkarın. Ardından birkaç damla montaj ortamı ekleyin ve bölümlerin üzerine bir lamel yerleştirin. Gece boyunca kurumaya bırakın.

Lazer taramalı konfokal mikroskopta 10x büyütme kullanarak kesitleri görüntüleyin. Görüntüleri analiz etmek için, önce nicel görüntü analizi için uygun yazılımı kullanarak görüntüyü 8 bit'e dönüştürün. Ardından bir temsili GFP pozitif floresan hücresi seçin ve tahmine tıklayarak ve hücrenin kenarlığını çizmek için serbest el seçim aracını kullanarak şeklini manuel olarak tanımlayın.

Yazılım, hücrenin çapını ve yoğunluk eşiğini otomatik olarak korur. Yazılımın transfekte edilmiş hücreleri korteks boyunca lokalize etmesine izin vermek için hücreleri bul'a tıklayın. Ardından, gerekirse yanlış pozitifleri manuel olarak kaldırın.

Korteksin tüm kalınlığını, bölge aracına tıklayarak, bir ve sekiz şeridin sırasıyla ventriküler bölgeye ve kortikal plakanın tepesine karşılık geldiği sekiz bölge şeridi seçerek, ayrı bölümlerde normalize edilmiş sekiz ilgi alanına bölün. Ardından, yazılımın tüm korteksteki GFP transfekte edilmiş hücrelerin göreceli konumunu saymasına izin vermek için uygula'ya tıklayın. Son olarak, verileri analiz için bir Excel dosyasına aktarmak için nicelemeyi kaydet'e tıklayın.

Dizi CGH ve tüm ekzom dizilemesi, C6orf70'i gelişimsel gen anormallikleri için aday bir gen olarak tanımladı. Kantitatif PCR, bu genin PHF10 ve DLL1 ile birlikte sıçan serebral korteksinde eksprese edildiğini belirledi. Aşağıdaki görüntüler, elektroporasyondan 5 gün sonra E20 sıçan beyinlerinin temsili neokortikal koronal kesitlerini göstermektedir: ya tek başına yeşil floresan protein yapısı ile ya da C6orf70 kodlama dizisini hedefleyen shRNA ile kombine edilmiş ya da göreceli etkisiz uyumsuzluk yapısı ile.

Filament A knock down, bozulmuş nöronal göçün kontrolü olarak kullanıldı. C6orf70 veya Filament A'yı hedefleyen shRNA ile utero elektroporasyon, beyaz oklarla gösterildiği gibi ventriküler bölge içinde GFP pozitif hücrelerin tutuklanmasına neden olurken, GFP'yi tek başına veya uyumsuzluk yapısıyla kombinasyon halinde eksprese eden hücreler nöronal göçü değiştirmedi. Bu prosedürü denerken, nöronal proliferasyon, göç veya olgunlaşma gibi hangi kortikal oluşum durumunu analiz etmek istediğinizi göz önünde bulundurmak önemlidir.

Kemirgen embriyonik beyinde rahim içi elektroporasyon yapmayı öğrenmenin uzun bir eğitim süresi, beceri ve düzenli uygulama gerektirdiğini unutmayın.