Name: Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Öğrenin, korku davranışlarıyla ilişkili sinir devrelerinin sinaptik özelliklerini incelemek için beyin dilimlerinde ekzogenetik optogenetik yöntemini. Bu teknik, geleneksel yöntemlerle erişilemeyen sinapsları çalışma olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cora Hübner ve Andrea Gall'a bazı temsili sonuçların elde edilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından Mükemmellik Girişimi (EXC 307) çerçevesinde finanse edilen bir Mükemmellik Girişimi olan Tuebingen Üniversitesi'ndeki Werner Reichardt Bütünleştirici Sinirbilim Merkezi (CIN) ve Charitable Hertie Vakfı'ndan sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

Etik deyimi: Tüm deneysel prosedürleri araştırmalarda hayvanların kullanımına ilişkin AB direktifi uyarınca ve yerel Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (Regierungspräsidium Tuebingen, Baden-Württemberg, Almanya devlet) Tübingen Üniversitesi&#39;nden sorumlu değildir. 1. Stereotaktik Enjeksiyon Yöntemi <ol><li> Bir sterilizatör kullanılarak steril aletler (makas, neşter, kelepçeler, matkap, iğneler, dikiş malzemesi) hazırlayın. Örneğin steril bir cerrahi örtü steril pamuk swap, dezenfektan, steril fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.4) ve H2O 2 gibi steril araç ve diğer gerekli çözümler ve cerrahi malzemeleri düzenlemek. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre yatay bir mikroelektrot çektirmenin bir 3 mm genişliğinde kutu filament kullanarak enjeksiyonlar için cam mikropipetler (Şekil 1A, ek) çekin. Not: Derin enjeksiyonları için, elektrot konik yeterince olmalıventral en koordinatları ulaşmak için uzun (yaklaşık 5 mm;. koordinatlar için, 1.10 bakınız). </li><li> Karışımlar virüsü çözeltisi 1 ul steril PBS içinde% 0.1 hızlı yeşil çözelti, 0.2 ul (cam pipet çözeltisi daha iyi görülmesi için). Ince ucu (Şekil 1A,) ile bir mikrolitre pipet kullanarak virüs çözümü ve hızlı yeşil karışımı ile cam pipetler doldurun. Not: rekombinant Adeno-ilişkili viral vektörler (rAAV) çalışma biyogüvenlik seviye 1 (BSL 1) çalışma olarak kabul edilir ve bir BSL 1 laboratuvarda yapılacak gerekiyor. Bu çalışmada, (Şekil 1C) kullanılan rAAVs vardı: 1) MPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotip 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotip 2/9) 23; 3) mpITC /: Bla, rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotip 2/1) 23 </li><li> küçük bir hayvan anestezi makinesi (: indüksiyon oksijen içinde% 3 İsofluranın) kullanarak bir fare anestezisi. Not: Bu çalışmada kullanılan Fare 4&#39;ü -7 haftalık ve aşağıdaki suşlar ve genotiplerinin: (Şekil 2A ve 3A-D deney) C57BL6 / J yabani tip; GAD67-GFP 24 (Şekil 2B ve 3E-H deney); Tac2-Cre 25 (Şekil 2C ve 3I-J deney). </li><li> kulak ve gözler arasındaki başını tıraş. pamuklu çubuklarla kullanarak traş kafa dezenfektan (tabanlı providon-iyot) uygulayın. </li><li> anestezi sırasında gözlerin kurumasını önlemek için bir göz merhemi sürün. Deri altına analjezik ile (meloksikam göre 0.1 ml, 5 mg / ml solüsyon) fare enjekte edilir. </li><li> (: Bakım için oksijen% 2 İsofluranın) stereotaktik çerçeve (Şekil 1A) fare yerleştirin ve bir gaz anestezi maske ile anestezi korumak. Devam etmeden önce ekstremite çekme refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin. Not: tüm cerrahi prosedür sırasında steril olarak mümkün olduğu kadar iyi korumak; tek kullanımlık yüz maskesi giymek, cerrahi gitmekVe eldiven wn. </li><li> makas kullanarak başın üst deri kesi olun. Yavaşça H 2 O 2 ile kafatası yüzeyi ve temiz kafatası açığa çıkarmak için kelepçeler ile düzeltmek, künt forseps kullanarak tarafına cilt çekin. </li><li> Her iki yarımkürede (Şekil 1B) için iyi bir ipucu kalıcı marker ve matkap delikleri kullanarak kafatası Mark enjeksiyon siteleri. MPFC: Bu çalışmada enjeksiyon (Bregma (mm)) vardır koordinatları anterior 1.9, 0.3 ± yan, ventral 2.1; MGM / PIN: 1.8 ± yan, 3.0 arka ventral 3.8; mpITC /: Bla 3.35 ve 4.75 ventral ± yan, 1.45 posterior. </li><li> Bir basınçlı enjeksiyon cihazına bağlı stereotaktik çerçeve üzerine dolu cam pipet montaj ve Bregma pozisyonuna pipet getirmek. </li><li> ince düz uçlu forseps kullanarak cam pipet ucu kesiyorum. virüs çözümü aerosol oluşumunu önlemek için yavaşça yapın. Pipet birkaç basınç darbeleri uygulayarak ve Viru damlalarının ekstrüzyon gözlemleyerek açık olduğundan emin olunsolüsyonu. </li><li> İstenen enjeksiyon koordinatlarına gidin ve basınçlı enjeksiyon cihazda aşağıdaki ayarları kullanarak pipet içeriği (~ 0.5 ul) yarısı enjekte: Basınç: 20 psi, ortalama darbe uzunluğu: 30 ms, bakliyat ortalama sayısı: 50. </li><li> bu geri çekme yavaş (1 mm / dakika) önce yaklaşık 1 dakika boyunca yer pipet bırakın. Not: pipet diğer yarımkürede aynı pipetle işlemi tekrarlamadan önce bloke olmadığından emin olun. Engellenen ucu durumunda, temiz ya da tekrar bregma ucu ve sıfır pipet konumunu kesiyorum. </li><li> PBS (pH 7.4) ile temiz kafatası, yavaşça, kelepçeler kaldırmak birlikte cilt çekin ve bireysel düğme sütür ile kesi sütür (3-4 knot). yaranın etrafındaki dezenfektan (tabanlı providon-iyot) uygulayın. </li><li> anestezi durdurmak ve tamamen uyanık kadar gözetimsiz fareyi bırakmayın. Tek muhafaza tutmak ya da tamamen iyileşti sadece diğer hayvanların şirkete geri dönün. Ameliyat sonrası sağlık durumunun izlemeye devam ve administer analjezik gerekirse. Yerel Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından ileri sürülen kurallara göre prosedürlerini takip edin. </li></ol> Akut Dilimleri 2. Hazırlık <ol><li> ACSF, kesme çözüm aletleri (makas, neşter, pens, spatula, Pasteur pipeti) ve agar blokları hazırlayın. Not: Yapay beyin-omurilik sıvısı (ACSF) 1 L deney başına gerekli olan ve daha önce 16,23 yayınlanan iki kez damıtılmış H2O kimyasallar çözülmesiyle hazırlanır. Kesme solüsyon 2 M MgSO 4 stok çözeltisi 0.87 ml ACSF 200 ml ilave etmek suretiyle hazırlanır. </li><li> Oksijenat ACSF ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile deney boyunca kesme çözeltisi. </li><li> Derin izofluran kullanarak küçük bir hayvan anestezi makinesi (oksijen% 3) kullanarak fare uyutmak. Devam etmeden önce ekstremite çekme refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin. </li><li> Büyük makas kullanarak fare başını kesmek ve hemen soğukbuz gibi soğuk kesim çözüm baş. </li><li> kaudal gelen rostralinde ve tek orta hat kesi açık kafatası hafifçe forseps kullanarak yanlara kafatası parçaları itin. Hızla hafifçe küçük bir yuvarlak spatula ile kafatasının dışında çekerek beyin kaldırmak. neşter ile beyincik kesti. buz gibi soğuk kesim çözüm beyin yerleştirin. </li><li> MPFC enjeksiyon siteleri için: (MPFC içeren) bir neşter kullanılarak beynin ön kısmı kesilmiş ve dilimleme kadar buz gibi soğuk kesim çözüm koymak. </li><li> Bir filtre kağıdı ile aşırı kesim çözüm çıkarın ve vibratome sahneye beynin posterior bölümünü tutkal. </li><li> Eğik amigdala dilimleri için, 35 ° açı (Şekil 1D, orta) bir agar bloğu (% 4) kesim üzerinde beyin tutkal. Koronal amigdala dilimleri, MGM / PIN enjeksiyon siteleri ve MPFC enjeksiyon siteleri için, (Şekil 1D, sol ve sağ) sahnede doğrudan beyin tutkal. dilimleme sırasında istikrar için beynin arkasındaki ek agar blok yerleştirin. </li><li> Placbir soğutma birimi ile, 4 ° C&#39;de muhafaza edilir, buz soğukluğunda oksijenli kesme çözeltisi ile bölme kesme e aşaması. Bir safir bıçak kullanarak amigdala (320 mikron) akut dilimleri hazırlayın. Oda sıcaklığında oksijenli ACSF ile birlikte bir ara bölmesi dilimleri yerleştirin. </li><li> 45 dakika - Akut amigdala dilimleri hazırlanmasından sonra, 35 dilim kurtarmak için 36 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde ara yüz bölümü yerleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığına ara yüz bölümü geri döner. Bu dilimler kayıt, adım 3.2 ile devam edin. </li><li> Akut amigdala dilimleri (- 2.9 2.8 adımları) için daha önce açıklandığı gibi adım 2.10 başlamasından sırasında, enjeksiyon siteleri dilim kesti. su banyosu dilimler geçmesi burada gerekli değildir. İsteğe bağlı: hızlı, enjeksiyon yeri konumunu tahmin floresan lamba ve uygun filtre setleri ile donatılmış bir Stereoskop dilimleri gözlemlemek. </li><li> iki filtre kağıtları ve Dalg arasına sandviç by-hoc sonrası analizi için enjeksiyon siteleri içeren dilimleri FixPBS çözeltisi O / N% 4 paraformaldehid (PFA) bunları dig. Enjeksiyon sitelerin analizi için adım 4.1 ile devam edin. </li></ol> Presinaptik Liflerin 3. Görselleştirme ve Uyarım <ol><li> liflerin ve hücrelerin Optogenetic aktivasyonu için yama mikroskop hazırlanması: <ol><li> Işık teslimat yolunun üzerine monte ışık yayan diyot (LED) merkezi. </li><li> arka odak düzlemi de ve 470 nm uygun dalga boyu seçiminde bir güç metre ile her bir amacın çıkışında LED ışık yoğunluğunu ölçün. </li><li> MW / mm 2 ışık yoğunluğunu hesaplamak ve 470 nm dalga boyundaki için ölçülen değerler için her hedef için (ışık çıkışı (mW / mm2) karşı LED yoğunluğu (%)) bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. </li></ol></li><li> Bir floresan lamba ile donatılmış dik mikroskop üzerine monte dilim odasında arayüz odası ve yerden akut amigdala dilim almak. dilim böyle dilim konumlandırmak için özenarayüz odasında yukarı bakacak e yüzeyi de kayıt odasında yukarı bakacak. ~ 31 ° C&#39;lik bir sıcaklıkta, 2 ml / dak - 1 bir oranda taze oksijenli ASCF sahip dilim serpmek. </li><li> ifade spesifik floresan proteini için uygun filtre setleri ile birlikte floresan lamba kullanarak dilim presinaptik liflerin gözlemleyin. Bir genel (Şekil 1 E) ve hedef alanı içinde lif yoğunluğu değerlendirmesi için 60x objektif elde etmek için 5x amacı kullanın. GFP ve YFP için, kullanım Filtre belirtilen MCherry &quot;kırmızı&quot; (Uyarma 560/40, ışın ayıracı 585, Emisyon 630/70) set filtre kullanın için &quot;yeşil&quot; (Uyarma 472/20, ışın ayıracı 495, Emisyon 490 LP) ayarlayın: Not malzemeler / ekipman tabloda. </li><li> Aç veya deney (Şekil 2D) için arzu edildiği şekilde bir mikroskop ışık yolu diyaframı kısıtlar. </li><li> Bir yama kayıt elde etmek için, iç çözümü ile bir yama pipet doldurmak ve ben montajn-elektrotu tutucu. yama pipet pozitif basınç uygulayın ve yavaş yavaş mikromanipülatör kullanarak dilim içine görsel kontrol altında ilk banyo çözeltisi içine ve sonra indirin. <ol><li> yan ve üstten yama pipet ile ilgi nöron yaklaşın. Pipet (hücre yüzeyinde girinti görünür) hücrenin yüzeyi üzerinde olduğunda, pozitif basınç serbest bırakın ve negatif basınç uygulanarak, bir &quot;gigaseal&quot; elde edilir. </li><li> tam hücreli kayıt elde etmek için membran yama rüptüre daha emiş uygulayın. Daha sonra, hücreden elektrik yanıtları kaydederken Chr (470 nm) aktive etmek için uygun dalga boyu kullanılarak bağlanan LED ile etiketlenmiş lifleri uyarır. </li><li> sinaptik stimülasyonu için düşük LED yoğunluğu ile başlar ve istenen sinaptik akım genliği ulaşılana kadar artar. Zamanlama ve darbe uzunluğu Şekil (örnekler kontrol etmek için veri toplama yazılımı dijital çıkışları yapılandırarak LED tetik3). Not: diğer yazılım ve / veya TTL üreten cihazlar LED tetiklemek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> ve / veya belirli ilaçların mevcudiyetinde aşağıdaki kaydedilen hücre için arzu edildiği gibi mikroskop ışık yolu açılmış ya da sınırlı açıklığı (aşama 3.4) ile tekrar uyarılması. </li><li> Kayıttan sonra, iki filtre kağıtları arasına sandviç ve% 4 PFA O / N onları daldırarak-hoc sonrası analizi için dilimleri düzeltin. </li><li> elektrofizyolojik verileri analiz edin. Not: Uygun yazılım her uyarım çevrimdışı kaydedilen tarama verileri görselleştirmek için. ilaçların etkilerini analiz ederken, tüm bireysel tarama için sinaptik akım genlikleri uyuşturucu etkisinin zaman sürecini elde etmek için zirve algılama rutinleri kullanın. ilaç etkisi kararlı duruma ulaştığında belirleyin. Deneysel koşul başına ortalama ≥10 bireysel Piyango yazılım kullanın, rakamlar için temsili ortalama yanıtları hazırlamak için (cf Şekil 3B-D, FHJ sağ panel). Not: Birkaç alternatif yazılım paketleri veri analizi için kullanılabilir. </li></ol> Enjeksiyon Siteleri 4. Post-hoc analizi <ol><li> ve (yeniden görüntüleme adımı 3,7, arzu edildiği takdirde), PBS içinde üç kez sitesi kayıt (adım 2.12) enjeksiyon bölgesi dilimleri yıkayın. Bu arka arkaya 10 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde taze PBS ile üç kez çözelti değiştirerek yapılır. </li><li> PBS içinde% 2 agar-agar çözeltisi hazırlayın ve ~ 65 ° C&#39;ye kadar soğumaya bırakın. Bir küçük 30 mm çaplı petri altındaki düz yer dilimleri, agar-agar dilimleri gömmek ve katı kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Bir vibratome aşamasında gömülü dilim veya dilimleri ile bir agar bloğu Tutkal ve PBS ile odasını kesme sahne yerleştirin. </li><li> Rezeksiyon 70 mikron kalınlığında dilim gömülü. İsteğe bağlı: rezeksiyon sonra, dilimler, hücre mimarisini (Şekil 3A, C) ortaya çıkarmak için NeuroTrace ile, yani lekeli olabilir ve / veya bYFP veya mCherry için y immünofloresan boyama Chr füzyon proteininden sinyalini arttırmak için. </li><li> montaj medya ile slaytlar ve lamel üzerine monte dilimleri. Resim enjeksiyon bölgesi ve eğer istenirse, bir flüoresan mikroskop veya konfokal lazer tarama mikroskobu (Şekil 2A-C) projeksiyon alanlarda lifler ihtiva eden, aynı zamanda görüntü dilimleri. </li></ol>

<ol><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li>
<li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li>
<li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li>
<li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices%2C+ventral+hippocampus%2C+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li>
<li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li>
<li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li>
<li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala%3A+implications+for+fear+and+emotional+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64(2014).</li>
<li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li>
<li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin%2C+parvalbumin%2C+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li>
<li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li>
<li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li>
<li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8%2C+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li>
<li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li>
<li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li>
<li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li>
<li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+channelrhodopsin-2+%28ChR2%29+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol değilse tüm kolayca çoğunda uygulanabilir nöral devreleri ve yerel bağlantı ex vivo optogenetic soruşturma için bir yöntem açıklanır, Epifloresans ışık limanda bir LED ~ 470 nm ile donatarak dik dilim patch-kelepçe kayıt kurulumları. dilimleri aksonal çıkıntıların Optogenetic uyarım önemli bir avantajı, mukabil lif yollarının bilinmemektedir açık bir şekilde tanımlanmış olup, ya da korunmuş değildi, çünkü belirli bir aktivasyonu ve konvansiyonel elektrik stimülasyonu ile erişilebilir değildi bağlant...

görselleştirme ve beyin bölgeleri ve nöronların belirli türleri arasında belirli bağlantı eşzamanlı aktivasyonu için hassas aletleri fonksiyonel bağlantı altta yatan sağlıklı beyin fonksiyonu ve hastalık durumları anlamada daha önemli hale gelmektedir. İdeal olarak, bu nöronlar iletişim tespit hangi hassas sinaptik özellikleri fizyolojik soruşturma gerektirir. Bu, tek bir akut beyin diliminde korunamaz beyin alanları arasında bağlantı için geçerlidir. Geçmişte, bu büyük ölçüde ayrı deneylerde elde edilmiştir. Bir yandan, nöral izleyiciler enjekte in vivo daha sonra ışık veya ön ve postsinaptik mümkün elektron mikroskopik analizi ile bir arada kullanılmıştır. Kalkış bölgesinden lif yollarının korunması ve dilim hazırlanmasında erişilebilir Diğer taraftan, elektrik stimülasyonu hedef bölgede hücrelerin sinaptik iletişim mekanizması değerlendirmek için kullanılmıştır. Kendi görselleştirme ve post-hoc anatomik analiz 1- için izin verirken optogenetics gelişine, bu tür floresan proteinleri kaynaşmış Channelrhodopsins (Chrs) olarak ışık kapılı katyon kanalları, hedeflenen ifadesi, artık nöronlar ve onların aksonal yörüngeleri aktivasyonunu sağlar 4. Lif yolları belirli yörünge ayrılabilir olmadığı veya nedeni, 1) geleneksel elektrik stimülasyonu ile erişilebilir değildi beyin bölgelerinden girişleri değerlendirmek: Üst somata 5 kopmuş zaman CHR-ifade aksonlar bile teşvik edilebilir, çünkü beyin dilimleri mümkündür bilinmemektedir; 2) tümden öne ama eksik anlaşılmıştır belirli girdiler için menşe bölgeyi tanımlamak; ve 3) hem yerel hem de uzun menzilli projeksiyonlar, tanımlanan hücre tipleri arasında işlevsel bağlantı araştırmak. Çünkü avantajları bir dizi, beyin dilimleri devre Bu Optogenetic eşleme çapında olmuşturly son yıllarda kullanılan ve floresan etiketli CHRS ekspresyonu için viral vektörler, çeşitli ticari satıcılardan kolayca temin edilebilir. elektriksel stimülasyon da geçit veya diğer yakın hücrelerden ve eşit derecede hızlı ve zamansal hassas stimülasyon lifleri işe çünkü geleneksel elektrik stimülasyonu üzerinde optogenetic aktivasyonu bazı önemli avantajları nedeniyle stimülasyon elektrotları, fiber stimülasyon özgüllüğü yerleştirme dokuya hiçbir zarar vardır. Buna ek olarak, viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon kolayca Kre-bağımlı ekspresyonunu ve / veya özel promoterler 7 kullanılarak elde edilebilir, belirli beyin bölgelerinde 6 ve koşullu veya hücre tipi özel ifadesine hedeflenebilir. İşte, bu teknik korku sisteminde uzun menzilli haritalanması ve yerel devreleri için uygulanır. Amigdala korku ve duygusal anıları 8,9 edinimi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. Apart froamigdala m, medial prefrontal korteks (MPFC) ve hipokampus (HC), karşılıklı olarak amigdala bağlı yapılar, korku ve yok oluş anı 10,11 edinimi, konsolidasyon ve alma yönleri sorumlu tutulmaktadır. MPFC alt bölümleri aktivite 12,13 devletler, yüksek ve düşük hem de korku kontrolünde bir çift rol oynadığı düşünülmektedir. Bu kısmen amigdala aktivitesi ve çıkışını kontrol ediyorum amigdala için MPFC doğrudan bağlantıları aracılık olabilir. Bu nedenle, son yıllarda, bazı çalışmalar amigdala 14-17 yılında MPFC afferentleri ve belirli hedef hücreleri arasındaki sinaptik etkileşimlerini araştırmak için ex-vivo dilim deneyler başladı. korku öğrenme sırasında, klimalı ve koşulsuz uyaranlara ilgili duyusal bilgiler belirli talamik ve kortikal bölgelerden projeksiyonlar aracılığıyla amigdala ulaşır. Başol lateral (LA) nöronlara bu girdilerin Plastisiteateral amigdala (BLA) korku klima 9,18 altında yatan önemli bir mekanizmadır. Artan kanıtlar amigdala paralel plastik süreçleri korku bellek 19 kontrol etmek için inhibitör unsurlar içerdiğini göstermektedir. Kümelenmiş inhibitör nöronların bir grup GABAerjik medial paracapsular enterkale hücreler (mpITCs) vardır, ama bunların kesin bağlantı ve fonksiyon tam olarak 20-22 anlaşılmaktadır. Burada, optogenetic devre haritalama mpITCs talamik ve kortikal röle istasyonları 23 doğrudan duyusal girdileri almak olduğunu gösteren, afferent ve efferent bu hücrelerin bağlantı ve amigdala hedef nöronlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılır. mpITCs veya BLA nöronlarda CHR spesifik ifadesi etkili bir BLA aktivitesini kontrol roman ileri beslemeli ve geri bildirim inhibitör devrelerde yerleştirerek, mpITCs engellediğini ortaya, yerel etkileşimlerin haritalama sağlar, aynı zamanda karşılıklı BLA ana nöronlar tarafından aktive edilir23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaktik çerçeve</td><td>Stoelting, ABD</td><td>51670</td>, <td>fareler için başka bir stereotaktik çerçeve ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Steretoksik çerçeve fare adaptörü</td><td>Stoelting, ABD</td><td>51625</td>, <td>fareler için başka bir stereotaktik çerçeve ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Fareler için gaz anestezi maskesi</td><td>Stoelting, ABD</td><td>50264</td><td>artık mevcut değil, madde no ile değiştirildi. 51609M</td></tr><tr><td>Basınçlı enjeksiyon cihazı, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, ABD</td><td>T25-2-900</td><td>diğer basınçlı enjeksiyon cihazları (örneğin Picospritzer) kullanılabilir</td></tr><tr><td>Kwik Dolgu cam kılcal damarları</td><td>Dünya Hassas Aletler, Almanya</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anestezi makinesi, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Almanya</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Sıcaklık Kontrol Cihazı ve ısıtma yastığı</td><td>FHC, ABD</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Yatay Mikropipet Çektirme Modeli P-1000</td><td>Sutter Aletleri, ABD</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi alet sterilizatörü, Sterilizatör 75</td><td>Melag, Almanya</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotip 2/9)</td><td>Penn Vektör Çekirdeği, ABD</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotip 2/9)&nbsp;</td><td>Penn Vektör Çekirdeği, ABD</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotip 2/1)&nbsp;</td><td>Penn Vektör Çekirdeği, ABD</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>hızlı yeşil</td><td>Roth, Almanya</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran Anestezik, İzofuran CP (1ml / ml)</td> <td>CP Pharma, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptik, Betadin (providon-iyot)</td> <td>Purdure Ürünleri, ABD</td><td>BSOL32</td><td>diğer dezenfektan</td></tr><tr><td>ile değiştirilebilir Analjezik, Metacam Çözeltisi (5mg / ml meloksikam)</td> <td>Boehringer Ingelheim, Almanya</td><td></td><td>diğer analjezikler ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Bepanthen göz merhemi</td><td>Bayer, Almanya</td><td>0191</td><td>diğer göz merhemi ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Matkap NM3000 (SNKG1341 ve SNIH1681)</td><td>Nouvag, İsviçre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Sütür İğnesi</td><td>Güzel Bilim Araçları, Almanya</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Örgülü İpek Sütür</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Almanya</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kayıtlar, ışık stimülasyonu ve analizi</güçlü</td></tr><tr><td>>yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF)</td><td>kompozisyon için referans #16 ve #23'e</td><td></td><td></td>bakın</tr><tr><td>Kompozisyon için dahili yama çözümleri</td> referans <td>#16 ve #23'e</td><td></td><td></td>bakın</tr><tr><td>Magnezyum Sülfat Heptahidrat</td><td>Roth, Almanya</td><td>P027.1</td><td>saflaştırılmış olarak 2M stok çözeltisi hazırlayın su</td></tr><tr><td>dilimleyici, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Almanya</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Doku dilimleyici için soğutma ünitesi, CU65</td><td>Fisher Scientific, Almanya</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>Safir bıçak</td><td>Delaware Elmas Bıçaklar</td><td></td><td>özel sipariş, şirket ile bilgi almak</td></tr><tr><td>Stereoskop, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite floresan lamba (XI120Q-1492)</td><td>Lümen Dinamik Grubu, Kanada</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>Yama mikroskobu, BX51WI</td><td>Olympus, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B yama amplifikatörü&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Moleküler Cihazlar, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PClamp yazılımı, Sürüm 10</td><td>Moleküler Cihazlar, ABD</td><td></td><td>veri toplama ve stimülasyonu kontrol etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Banyo sıcaklık kontrol cihazı, TC05</td><td>Luigs & Neumann, Almanya</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>Üç eksenli mikromanipülatör Mini 25</td><td>Luigs & Neumann, Almanya</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör kontrolörü SM7</td><td>Luigs & Neumann, Almanya</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>yama pipetleri için cam kılcal damarlar</td><td>World Precision Instruments, Almanya</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Arayüz odası için selüloz nitrat filtre kağıdı&nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Almanya</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>LED ünitesi, CoolLED pE</td><td>CoolLED, UK</td><td>244-1400</td><td>CoolLED veya USL 70/470 ve uygun adaptörler LED stimülasyonu için iki alternatif seçenektir</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, UK</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED veya USL 70/470 ve uygun adaptörler LED stimülasyon LED ünitesi için iki alternatif seçenektir</td></tr><tr><td>, USL 70/470</td><td>Rapp Optoelektronik</td><td>L70-000</td><td>CoolLED veya USL 70/470 ve uygun adaptörler LED stimülasyonu için iki alternatif seçenektir</td></tr><tr><td>Çift portlu adaptör</td><td>Rapp Optoelektronik</td><td>CoolLED veya USL 70/470 şirketi ile görüşün ve uygun adaptörler LED stimülasyonu için iki alternatif seçenektir</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seti kırmızı (uyarma)</td><td>AHF, Almanya</td><td>F49-560</td><td>Filtreler F46-008</td></tr> <tr><td>seti olarak satın alınabilir&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (ışın ayırıcı)</td><td>AHF, Almanya</td><td>F48-585</td><td>Filtreler set F46-008 olarak satın alınabilir</td></tr> <tr><td>& &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emisyon)</td><td>AHF, Almanya</td><td>F47-630</td><td>Filtreler set olarak satın alınabilir F46-008</td></tr><tr><td>Filtre seti yeşil (uyarma)</td><td>AHF, Almanya</td><td>F39-472</td><td>Alternatifler: filtre seti F36-149 veya F46-002 (bant geçiren emisyonlu)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (ışın ayırıcı)</td><td>AHF, Almanya</td><td>F43-495W</td><td>Alternatifler: filtre seti F36-149 veya F46-002 (bant geçiren emisyonlu)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emisyon)</td><td>AHF, Almanya</td><td>F76-490</td><td>Alternatifler: filtre seti F36-149 veya F46-002 (bant geçiren emisyonlu)</td></tr> <tr><td>LaserCheck, el tipi güç ölçer</td><td>Coherent, ABD</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Yazılımı, Sürüm 6</td><td>Wavemetrics, ABD</td><td></td><td>elektrofizyoloji veri analizi için, diğer alternatif yazılım paketleri de kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr>Elektrofizyoloji veri analizi <td>için IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td></td> için nöromatik makro <td>paketi, diğer alternatif yazılım paketleri de kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Enjeksiyonların ve projeksiyonların post hoc analizi</td></tr><tr><td>Paraformaldehit tozu (PFA)</td><td>Roth, Almanya</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 mavi floresan Nissl boyası</td> Gömme ve rezeksiyon için <td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Roth, Almanya</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>SPL Life'ı gömmek için 30 x 10 mm petri kapları</td><td> Fen Bilimleri</td><td></td><td>alternatifleri kullanılabilir</td></tr><tr><td>Slides, Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Almanya</td><td>61303802</td><td>alternatifler</td></tr> kullanılabilir <tr><td>kapak fişleri</td><td>R. Langenbrinck, Almanya</td><td>3000302</td><td>alternatifler kullanılabilir</td></tr><tr><td>Vecta Shield montaj ortamı</td><td>Vector Laboratories, ABD</td><td>H-1000</td><td>alternatif montaj ortamı kullanılabilir</td></tr><tr><td>Düzleştirme için selüloz nitrat filtre fiksasyon için dilimler</td><td>Satorius Stedim Biotech, Almanya</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu LSM 710</td><td>Zeiss, Almanya</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beyin dilimleri korku devre ex vivo optogenetic diseksiyon

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic yaklaşımlar günümüzde yaygın ışığı ışık ile aktive olan protein ve nöral etkinlik sonraki manipülasyon hedeflenen ifade birleştirerek nöral popülasyonları ve devrelerin işlevini incelemek için kullanılır. Channelrhodopsins (CHRS) ışık geçişli katyon-kanal ve bir flüoresan proteinine olduğunda ekspresyon görselleştirme ve özel hücre tipleri aynı anda harekete geçirmek ve beynin belirli bölgelerde aksonal projeksiyonlar sağlar. Viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon yoluyla, CHR füzyon proteinleri yapısal olarak ya da koşullu tanımlanmış bir beyin bölgesi spesifik hücrelerde eksprese edilebilir, ve aksonal çıkıntılar daha sonra beyin kesitleri ex vivo Optogenetic aktivasyonu yoluyla anatomik ve fonksiyonel olarak incelenebilir. Geleneksel elektriksel stimülasyon yaklaşımlarla ele edilemeyen bağlantılarının sinaptik özelliklerini anlamak amacıyla bu, ya da roman AFFE belirlenmesinde özel bir öneme sahiptirkira ve daha önce çok az anlaşılmış oldu efferent bağlantısı. İşte bir kaç örnek bu teknik amigdala korku ile ilgili devreleri açıklık bu soruları araştırmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. amigdala korku ve duygusal anılar edinilmesi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. kanıt kaç satır medial prefrontal korteks (MPFC) korku edinimi ve nesli farklı yönlerini katılır, ancak amigdala ile hassas bağlantı sadece anlaşılmalıdır başlıyor düşündürmektedir. Ex vivo Optogenetic aktivasyon bazolateral amigdala (bla) &#39;de MPFC afferent ve hedef hücreler arasındaki sinaptik iletişim yönlerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini İlk olarak, gösterilmiştir. Bundan başka, bu ex vivo Optogenetic yaklaşım, amigdala GABAerjik nöronlar bir grup ile yeni bir bağlantı boyutlarını ölçen uygulanabilir kadar gösterilmiş olup, bir örnek olarak paracapsular birleştirilmiş zigot (mpITC).

Bu bölümde, duyusal ve modülatör BLA uzun menzilli projeksiyonlar ve mpITC nöronlar yanı sıra mpITC ve BLA arasında yerel bağlantı özelliklerinin fizyolojik özelliklerini araştırmak için bir ex vivo optogenetic yaklaşım ve farklı deneysel stratejiler temsili sonuçların akışını gösterir. Fare beyin arzu edilen koordinatları için seçilen viral vektörün stereotaktik enjeksiyon sonrasında (Şekil 1A-C vira...

Optogenetic yaklaşımlar yaygın nöral aktiviteyi işlemek ve beyin fonksiyonu için sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır. Burada, bir teknik optik aktivatör channelrhodopsin in vivo tanımlanması üzerine, korku ile ilgili devreler özel uzun menzilli ve yerel sinirsel bağlantılar sinaptik özellikleri ex vivo analiz için izin verdiği gösterilmiştir.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Bu deneyin genel amacı, ex-vivo optogenetik kullanarak nöral projeksiyonların ve mikro-devrelerin fonksiyonel ve sinaptik özelliklerini araştırmaktır. Bu işlem, kanal rhodopsin ekspresyonunu ve bunun spesifik projeksiyonlarda patch-clamp kayıtları ile birleştirilmiş aktivasyonunu içerir. Bu yöntem, beyin alanları içindeki ve arasındaki yerel ve uzun menzilli bağlantıların sinaptik özellikleri hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu durum, korku davranışını destekleyen nöral devrelerin incelendiği burada örneklendirilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel elektriksel stimülasyon tekniklerine uygun olmayan devrelerin ve sinapsların çalışılmasına olanak tanımasıdır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişilerin, gerekli tüm adımların optimal bir şekilde gerçekleştirilmesi zorluğunun üstesinden gelmeleri gerekecektir.Bu süreç; viral enjeksiyonların stereotaktik hedeflemesini, kanal rodopsin için optimal ekspresyon süresinin belirlenmesini, yüksek kaliteli beyin dilimlerinin hazırlanmasını, stabil ışık aktivasyonunu ve kayıtları içerir. Prosedürün bu aşamasına başlamadan önce, floresan bir proteine füzyonlanmış kanal rodopsin eksprese edecek şekilde mühend

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, bir fare beyninden eğik amigdala dilimlerinin oluşturulmasını göstermektedir. Beyin, amigdala ile sinaptik bağlantılar oluşturan medial prefrontal korteksten amigdala ve aksonları içeren dilimler elde etmek için vibratom örneği aşamasında belirli bir açıyla konumlandırılır. Beyin dilimleri, daha sonraki deneyler için dokuyu korumak için fizyolojik sıcaklıkta tutulur.

Bir Fare Beyninden Eğik Amigdala Dilimlerinin Üretilmesi

Bu video, medial prefrontal korteksten sinaptik bağlantılar açısından zengin amigdala bölgelerini açığa çıkaran bir murin beyninden ince koronal beyin dilimlerinin hazırlanmasını göstermektedir. Dilimler daha sonra nöronal canlılığı korumak için oksijenli yapay beyin omurilik sıvısında geri kazanılır.

Bir Fare Beyninden Amigdala Bölgelerini Açığa Çıkaran Koronal Beyin Dilimi Oluşturma

Bu videoda, nörona özgü floresan proteinler içeren transgenik beyin dilimlerinden elektriksel aktivitenin aynı anda görüntülenmesi ve kaydedilmesi için bir yöntem özetlenmektedir. Prosedür, beyin diliminin havalandırılmış yapay beyin omurilik sıvısı ile bir perfüzyon odasında tutulmasını, floresan etiketli hücreleri uyarmak için bir ışık kaynağı kullanılmasını ve elektrik sinyallerinin çok kanallı bir prob ve yama kelepçesi ile kaydedilmesini içerir.

Beyin Dilimlerindeki Nöronal Hücrelerin Eş Zamanlı Optik ve Elektrofizyolojik İzlenmesi

Bu video, farelerden alınan akut amigdala beyin dilimleri kullanılarak medial prefrontal korteks (mPFC) ve amigdala nöronları arasındaki sinaptik bağlantıyı analiz etmek için bir prosedürü göstermektedir. Bu farelerdeki mPFC nöronları, bir floresan proteine kaynaşmış channelrhodopsin eksprese eder. Channelrhodopsinler, ışık aktivasyonu üzerine mPFC nöronlarında iyon akışını ve aksiyon potansiyeli oluşumunu kolaylaştırır. Sonuç olarak, mPFC nöronları, postsinaptik amigdala nöronlarına bağlanan...

Amigdala Beyin Dilimindeki Nöronal Yolların Görselleştirilmesi ve Haritalanması

Nöronal popülasyonları in vitro olarak fotostimül etmek için optogenetik bir yaklaşım kullanarak ön beyin devrelerinin fonksiyonel topografyasını ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

Bu protokol, ex vivo beyin dilimlerinde optogenetik stimülasyonlar kullanarak uzak beyin bölgelerinden gelen uzun menzilli girdilerin hücre tipi spesifik fonksiyonel bağlantısını belirlemek için bir dizi yöntemi açıklamaktadır.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir.

SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Davranışı Modüle Etmek Için Nöronal Aktivitenin Optogenetik Manipülasyonu

Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.

Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Gözlemsel korku paradigması, kemirgenlerde dolaylı donmayı duygusal empati için bir model olarak değerlendirir. Bu prosedür, gözlemci kemirgenlerin, empatik donma tepkileri ortaya çıkarmak için caydırıcı ayak şokları alan belirli göstericilere maruz bırakılmasını gerektirir. Araştırmacılar, gözlemsel korku tahlillerini kullanarak, duygusal empatinin altında yatan sinirsel mekanizmaları araştırabilirler.

Farelerde Duygusal Empati Modeli Olarak Gözlemsel Korku

Öğrenin, korku davranışlarıyla ilişkili sinir devrelerinin sinaptik özelliklerini incelemek için beyin dilimlerinde ekzogenetik optogenetik yöntemini. Bu teknik, geleneksel yöntemlerle erişilemeyen sinapsları çalışma olanağı sunar.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Daha fazla video keşfet