Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Bu deneyin genel amacı, ex-vivo optogenetik kullanarak nöral projeksiyonların ve mikro devrelerin fonksiyonel ve sinaptik özelliklerini araştırmaktır. Bu, kanal rodopsinin ekspresyonunu ve yama kelepçesi kayıtlarıyla birlikte belirli projeksiyonlarda aktivasyonunu içerir. Bu yöntem, beyin alanları içinde ve arasında yerel ve uzun vadeli bağlantının sinaptik özellikleri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu, korku davranışını destekleyen nöral devreleri araştırırken burada gösterilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel elektriksel stimülasyon teknikleriyle uygun olmayan devreleri ve sinapsları incelemeye izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, gerekli tüm adımları en iyi şekilde gerçekleştirme zorluğunun üstesinden gelmek zorunda kalacaklardır.

Bu, viral enjeksiyonların stereotaktik hedeflemesini, kanal rodpsin için en uygun ekspresyon süresinin belirlenmesini, kaliteli beyin dilimlerinin hazırlanmasını ve stabil ışık aktivasyonu ve kayıtlarını içerir. Prosedürün bu kısmına başlamadan önce, bir floresan proteine kaynaşmış kanal rodopsini eksprese etmek için tasarlanmış rekombinant adeno-ilişkili bir viral vektör, stereotaktik cerrahi ile medial prefrontal kortekse sokuldu. Safir bir bıçak takarak ve 320 mikron kalınlığında kesecek şekilde ayarlayarak vibratomu hazırlayın.

Onaylanmış yöntemlere göre fedakârlık yapıldıktan ve beynin çıkarılmasından sonra, beyinciği kesmek için bir neşter kullanın, ardından medial prefrontal korteksi içeren beynin ön kısmını izole edin. Beynin ön kısmını dilimleyene kadar buz gibi soğuk kesme solüsyonuna koyun. Kesme haznesini bir soğutma ünitesi kullanarak 4 santigrat derecede tutulan buz gibi soğuk kesme solüsyonu ile doldurun.

Çözeltiyi oksijenlendirin. Beyni filtre kağıdı ile kurulayın. 35 derecelik bir açıyla kesilen yüzde dört agar bloğunu vibratom aşamasına yapıştırın ve beyin dokusunun arka kısmını bu bloğun üzerine yapıştırın.

Dilimleme sırasında stabilite için beyin bloğunun önüne ve arkasına iki ek agar bloğu yapıştırın. Sahneyi mendil takılı olarak kesme haznesine yerleştirin ve suya batırıldığından emin olun. Akut dilimleri kesmeye başlayın.

Her dilimi ikiye bölün ve oda sıcaklığında oksijenli ACSF ile sağlanan bir arayüz odasına aktarın. Akut amigdala dilimlerini kestikten sonra, arayüz odasını 36 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin ve dilimlerin 35 ila 45 dakika iyileşmesine izin verin. Post-hoc analiz için enjeksiyon bölgesini içeren dilimlerin bir alt kümesini, iki parça filtre kağıdı arasına sıkıştırarak ve gece boyunca PBS'de yüzde dört paraformaldehit içine batırarak sabitleyin.

Burada, bir floresan proteine kaynaşmış kanal rodopsini eksprese etmek için tasarlanmış rekombinant adeno-ilişkili bir viral vektör, stereotaktik cerrahi ile medial genikülat çekirdeğin ve bitişik posterior intralaminar çekirdeğin medial bölümüne sokuldu. Beyni elde ettikten sonra, beyincik ve beynin ön kısmını çıkarmak için bir neşter kullanın ve ardından beynin orta kısmını daha önce olduğu gibi buz gibi soğuk kesme solüsyonunda soğutun. Beyni filtre kağıdı ile kurulayın ve ardından vibratom aşamasına yapıştırın.

Yine, dilimleme sırasında stabilite için beynin arkasına ek bir agar bloğu sabitleyin. Sahneyi dört santigrat derece kesme çözeltisi ile doldurulmuş kesme haznesine yerleştirdikten sonra, amigdala içinden 320 mikron koronal kesitler kesin, ikiye bölün ve bölümleri daha önce olduğu gibi arayüz haznesinde toplayın. Floresan aydınlatma kullanan bir stereomikroskop altında enjeksiyon bölgesini kontrol edin.

Yama mikroskobunu liflerin ve hücrelerin optogenetik aktivasyonu için hazırlamak için, monte edilmiş ışık yayan diyotu veya LED'i ışık dağıtım yolu üzerine ortalayın. Arka odak düzleminde ve her bir hedefin çıkışında 470 nanometre dalga boyunda LED ışık yoğunluğunu ölçmek için bir güç ölçer kullanın. Işık yoğunluğunu milimetre kare başına miliwatt cinsinden hesaplamak için bir elektronik tablo kullanın ve her hedef için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.

Daha sonra, arayüz odasından bir akut amigdala dilimi alın ve mikroskoba monte edilmiş dilim bölmesine yerleştirin. Dilimi, arabirim bölmesinde yukarı bakan dilim yüzeyi kayıt odasında da yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Dilimi dakikada bir ila iki mililitre hızında taze, oksijenli ACSF ile perfüze edin.

Sıcaklık yaklaşık 31 santigrat derece olmalıdır. Floresan lambayı açın ve ifade edilen spesifik floresan protein için uygun filtre setini seçin. Genel bir bakış elde etmek için 5x reklam verme amacını kullanın.

Ve hedef alandaki lif yoğunluğunun değerlendirilmesi için 60x hedefi. Ardından, mikroskop ışık yolundaki açıklığı deney için gerektiği gibi açın veya kısıtlayın. Bir yama kaydı elde etmek için, bir yama pipetini dahili solüsyonla doldurun ve elektrot tutucusuna monte edin.

Yama pipetine pozitif basınç uygulayın ve yavaşça banyo solüsyonuna indirin. Ardından, görsel kontrol altında, yama pippette'yi dilime indirmek için mikromanipülatörü kullanın. Yama pipeti ile ilgilenilen nörona yandan ve üstten yaklaşın.

Pipet, hücre yüzeyinde görünen bir çukur ile gösterildiği gibi hücrenin yüzeyine ulaştığında pozitif basıncı serbest bırakın. Bir gigaseal elde etmek için negatif basınç uygulayın. Membran yamasını yırtmak için daha fazla emme uygulayın ve tüm hücre kaydını elde edin.

Daha sonra, hücreden gelen elektriksel tepkileri kaydederken 470 nanometre dalga boyunda ışıkla kanal rodopsini aktive ederek etiketli lifleri bağlı bir LED ile uyarın. Sinaptik stimülasyon için, LED'i tetiklemek için veri toplama yazılımının dijital çıkışlarını kullanın. LED stimülasyon yoğunluğunu manuel olarak ayarlayın.

Bir sonraki kaydedilen hücre için gerektiği gibi açık veya kısıtlı bir açıklıkla veya belirli test maddelerinin varlığında stimülasyonu tekrarlayın. Kayıttan sonra, post-hoc analiz için dilimleri iki filtre kağıdı arasına sıkıştırarak ve gece boyunca yüzde dört paraformaldehite batırarak sabitleyin. Medial prefrontal korteksten gelen lifler, optogenetik eşleştirilmiş nabız stimülasyonu kullanılarak uyarılırken, bazolateral amigdala ana nöronu ve bir internörondan uyarıcı post-sinaptik akımlar kaydedildi.

Bu temsili izler, stimülasyondan ortaya çıkan eşleştirilmiş nabız kolaylaştırmasını ve eşleştirilmiş nabız depresyonunu gösterir. Aşağıdaki iki görüntü, medial prefrontal korteksten liflerin optogenetik aktivasyonu ile ortaya çıkan ileri beslemeli inhibisyonu göstermektedir. Bu ilk görüntü, bir bazolateral amigdala ana nöronunda 70 milivoltta temsili bir uyarıcı postsinaptik akımı ve sıfır milivoltta inhibitör postsinaptik akımı göstermektedir.

İnhibitör postsinaptik akım, sırasıyla disinaptik ve monosinaptik girişi gösteren uyarıcı postsinaptik akıma kıyasla daha uzun bir sinaptik gecikmeye sahiptir. Bu görüntü, 50 milivoltta fazik uyarıcı ve inhibitör postsinaptik akım dizisi tarafından uyandırılan ışığın, inhibitör postsinaptik akımın disinaptik doğasını daha da destekleyen AMPA kainat antagonisti CNQX tarafından bloke edildiğini göstermektedir. Bu görüntü, klorür kanal blokeri, pikrotoksin ve pikrotoksin artı CNQX tarafından 50 milivoltta uyarıcı ve inhibitör postsinaptik akım dizisinin sonraki bir bloğunun etkilerini göstermektedir.

İnhibitör postsinaptik akım, pikrotoksin tarafından bloke edilir ve kalan uyarıcı postsinaptik akım CNQX tarafından bloke edilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, beyin dilimlerinin hazırlanması ve ışıkla uyarılan tepkilerin kaydedilmesi birkaç saat ila tam bir gün içinde yapılabilir. Ön koşullar, iyi enjeksiyon bölgeleri ve hücrelerde kanal rodopsininin yeterli ekspresyonu ve çalışılacak projeksiyonlardır.

Bu prosedürü takiben, işaretli aksonların ve sinapsların anatomik çalışmaları gibi diğer yöntemler ışık ve elektron mikroskobik düzeyde gerçekleştirilebilir. Bu, aktive edilmiş sinapsların anatomik ve moleküler özellikleri ile fonksiyonel korelasyona izin verir. Bu videoyu izledikten sonra, ışıkla aktive olan liflerin ve beyin dilimlerinin analizi için gerekli tüm adımları iyi anlamış olmalısınız.

Bu, kanal rodopsin ekspresyonu, etiketli liflerin değerlendirilmesi ve aktivasyonunun yanı sıra sinaptik tepkilerin kaydedilmesi ve analizini içerir.