Name: İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin, insan hipofiz adenom hücrelerini üç boyutlu aljinat-boncuk kültüründe nasıl sürdüreceğinizi. Bu yöntem, tümör hücre biyolojisi ve istila belirteçlerinin ekspresyonunu incelemek için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardımı için Bay O. Rios'a teşekkür ederiz.

Bu çalışma Tıp Kurumu ve Ulusal Politeknik Enstitüsü Araştırma ve Avans Çalışmaları Merkezi&#39;nin yerel etik kurullar tarafından insan malzemesi kullanımı için onaylanmıştır. 1. Tümör Örnek Toplama <ol><li> Bir transsfenoid cerrahi işlem 14 ile bir hastadan hipofiz adenomu doku biyopsisi edinin. </li><li> hipofiz adenomları örnek toplamak ve taze,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile zenginleştirilmiş 199 kültür ortamı (M199), 0.6 mg / mL sodyum bikarbonat, 2.4 mg / ml HEPES ve 1, 50 mL% ihtiva eden steril bir cam şişe içine yerleştirin pH 7.4&#39;te antibiyotik (penisilin / streptomisin). Buz üzerinde bir cam şişe içinde örnek koruyun. Not: Tümör dokusu cerrahi sonra birkaç saat işlenebilir. </li><li> buz üzerinde cam şişede laboratuvara tümör örneği taşıyın. </li></ol> Enzimatik Doku Ayrılma Çözümleri 2. hazırlanması,Tripsin inhibitörü Çözelti ve alginat solüsyonlarından Not: Hücre kültürü prosedürü öncesinde aşağıdaki çözümleri hazırlamak. Kullanmadan önce 0.22 um zar filtre kullanılarak tüm çözümler, filtre. <ol><li> M199-serumsuz 5 ml kollajenaz (tip I) &#39;in 5 mg çözülmesiyle kolajenaz% 1 çözeltisi hazırlayın. </li><li> PBS-EDTA% 0.3 10 ml tripsin 0.01 g çözülerek% 0.01 çözelti tripsin hazırlayın. </li><li> M199-serumsuz 20 ml soya tripsin inhibitörü, 2 mg çözülmesiyle% 0.1 tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlayın. </li><li> tripsin inhibitörü çözeltisi 4 ml DNase I 134 U / ml 20 ul çözülmesiyle DNAz çözeltisi hazırlayın. </li><li> 155 mM NaCI, 40 ml EGTA 22.8 mg çözülmesiyle EGTA çözeltisi (1.2 M) hazırlayın. PH 7.4 ayarlayın. 50 ml&#39;lik bir son hacme kadar devam edin. </li><li> 155 mM NaCI, 50 ml 238 mg HEPES eritilerek HEPES çözeltisi (20 mM) hazırlanır. </li><li> 1.2 çözerek% 1.2 aljinat çözeltisi hazırlayınHEPES çözeltisi, 100 ml g sodyum alginat yer alır. aljinat çözeltisi Otoklav. </li><li> 7.4 pH ayarlamak, 50 mi HEPES çözeltisi içinde CaCI2 750 mg çözülmesiyle kalsiyum çözeltisi (102 mM) hazırlanması </li></ol> 3. Primer Hücre Kültürü ve Aljinat Kapsülleme <ol><li> Laminer akış kabini içinde, yaklaşık olarak 20 mi ari PBS Ca + 2 ve Mg + 2, pH 7.4 (PBS *) ihtiva eden bir 35 mm Petri kabı, tümör dokusu yerleştirin. </li><li> hafifçe doku yıkama, cerrahi pens ile doku almak ve taze PBS * içeren başka petri yerleştirin. kırmızı kan hücreleri ve enkaz kaldırılana kadar bu adımı tekrarlayın. </li><li> cerrahi cımbız kullanarak, hipofiz adenomu doku tutun ve küçük cerrahi makas, küçük parçalar halinde kesin. yuvarlak kenarlı bir Pasteur pipeti ile, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg, 15 ml&#39;lik bir tüp içine Santrifüjü doku parçaları ve PBS * aktarın. Not: Bir Pasteur kenarlarını yuvarlamak içinPipet, biraz Bunsen beki içinde pipet ucu Alev. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak PBS * çıkarın ve (yaklaşık olarak doku 65 mm3 5 mi), ters çevirme, iki ya da üç kez karışımı kolajenaz çözeltisi 3-5 ml ekleyin. sabit dönüş, 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca kolajenaz doku inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg&#39;de tüpü santrifüjünde bir Pasteur pipeti ile kollajenaz çıkarın. </li><li> daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg tüp santrifüj, DNAz 5 ml ilave edilir ve üst edilerek, iki ya da üç kez karıştırılır. Not: doku tamamen ayrışmış değilse, 37 ° C&#39;de 3 dakika boyunca tripsin ile ikinci bir enzimatik sindirim gerçekleştirin. tripsin inhibitör çözeltisinin 2 hacim eklenerek sindirim durdurun. </li><li> Pasteur pipeti ile süpernatant aspire ve atın. EGTA çözeltisi 1 hacim pelet yeniden askıya ve aljinat çözeltisi 2 hacim ile karıştırın. </li><li> Yavaşça hücre süspansiyonu ve aljinat mixPasteur pipeti ile pipetleme. Bir 21 G iğne ile steril bir şırınga alın piston kaldırmak; aljinat ve hücre çözeltisi şırınga yüklemek için bir pipet kullanın. </li><li> Yavaşça şırıngaya pistonu yerleştirin ve dikkatli bir şekilde aljinat hücre çözeltisi damla ile damla kalsiyum açısından zengin çözeltinin yaklaşık 30 ml ihtiva eden bir cam behere dağıtın. </li><li> Yaklaşık 5 cm kadar CaCl2 çözeltisine şırınga iğnesi yerleştirin. CaCI2 ile temas halinde alginat hücreli bir süspansiyon jeli küresel tanecikler oluşturulur. 5 dakika boyunca, kalsiyum çözeltisi aljinat tanelerinden tutun. Not: boncuk düştü edildiği cam beher karıştırın. birbirine yapışmasını önlemek için, dairesel hareketlerle elle yavaşça hareket ettirin. </li><li> Dikkatle Pasteur pipeti ile kalsiyum çözeltisi kaldırmak ve FBS% 20 ile zenginleştirilmiş M199 3-5 ml ile iki kez boncuk yıkayın. </li><li> Düzenli T25 doku kültürü içine aljinat boncuk aktarınsteril bir spatula kullanılarak şişe,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de M199 4-5 ml% 20 FBS ile zenginleştirilir ve inkübe ekleyin. Her üç günde bir kültür ortamı değiştirin. </li></ol> 4. Aljinat gelen Hücreleri Özgürleştirin Not: Ön aljinat tanelerinden hücreleri serbest bırakılması için, poli-D-lisin ile kat 13 mm çapında lamelleri. DİKKAT: Sülfürik Asit A ​​ÇOK KOROZİV ASİT NEDİR VE APTS GÖZ VE cilt tahrişine neden olabilir. Bu reaktiflerin KOLU İÇİN LATEX ELDİVEN KULLANIN. <ol><li> Bir çeker ocak içinde, bir noktadan cımbız ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 20 sulu sülfürik asit ihtiva eden bir cam petri lamelleri bırakın. </li><li> sülfürik asit tortusundan ayırma, ve her biri 5 dakika için damıtılmış su ile lamelleri beş kez yıkayın. Bir noktaya cımbız yer oda sıcaklığında 15 ° C&#39;de 5 dakika için 0.1 M NaOH içeren bir petri tabağına temiz lamelleri kullanılması. </li><li> NaOH Durusu ve imbikle ile bir kez yıkayınled su, su aspire ve lamelleri kurulayın. </li><li> 4 dakika boyunca APTS (aminopropil-trietoksilanın) ile kaplamak için lamelleri bir mikropipet kullanın distile su ile Petri kabı sel (6 lamelleri için 500 ul kullanın). Hızla su aspire ve su altında girmesine izin gelin cımbız ile lamelleri hareketli, damıtılmış su ile yıkayın devam ediyor. </li><li> su aspire ve lamelleri kuru, temiz bir Petri kabı içine bir nokta cımbız yer lamelleri kullanarak ve 3 kez, 45 saniye, her sırasında mikrodalga içinde sterilize. poli-D-lisin, 100 ug (0.1 mg / ml) steril su 1000 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca poli-D-lizin, yaklaşık 50 ul lamelleri inkübe edin. Tamamen poli-D-lisin aspire. Not: kültür ortamında çözünebilir poli-D-lizin hücresi çoğalmasını inhibe olduğu için önemlidir. </li><li> Her biri 5 dakika lamelleri, steril su ile beş kez çalkalayın. st aspireerile su ve izin lamelleri bir laminer akış kabini içinde kurumaya. </li><li> aktin hücre iskeletinin analiz etmek, aljinat gelen hipofiz hücreleri kurtarmak. 1 ml bir pipet kullanılarak kültür şişesi aljinat taneleri bazı alın ve 15 ml&#39;lik bir tüp içine yerleştirin. </li><li> 55 mM sodyum sitrat 5 ml oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg ve santrifüj (323.6 Na 3 C6Hs 5 O 7 mg, 2H 2 O 20 ml HEPES çözeltisi çözülür). Süpernatantı aspire ve atın. </li><li> % 20 FSB ile zenginleştirilmiş ılık M199 1 ml pelet yeniden askıya; hafifçe Pasteur pipeti ile bir hücre süspansiyonu karıştırılır. DİKKAT: faloidin VE DAPI ZEHİRLİ DEĞİLDİR. Bu reaktiflerin KOLU İÇİN ELDİVEN KULLANIN. </li><li> , Hücreleri saymak 1.5 ml tüp% 0.4 Tripan mavisi çözeltisinin 125 ul aktarmak için. M199 75 ul, son aşama (seyreltme faktörü = 5) &#39;de elde edilen hücre süspansiyonu 50 ul ekle. İyice karıştırın. </li><li> plac bir mikropipet ucu kullanınhemositometre odasında Tripan mavisi hücre süspansiyonu e yaklaşık 10 ul. </li><li> Faz kontrast aydınlatma bir ters mikroskop kullanılarak hemositometre sayacında hücreleri sayın. 1 mm merkezi kare ve dört 1 mm köşe kareler tüm hücreleri saymak. Seyreltme faktörü ile kare başına ortalama sayısı çarpılarak mililitre başına hücre yoğunluğu elde etmek -. 10 4 Örneğin, kare başına ortalama sayıları 45 hücreleri x 5 x 104 = 2.25 x 106 hücre / ml ise. Not: hemositometre odasının on meydanlarında hücreleri saymak. alt ve sağ kenarlarında orta çizgiye temas hücreleri saymayın. </li><li> Tohum poli-D-lizin kaplı 13 mm çapında cam lameller üzerine 35.000 hücre. </li></ol> 5. Aktin Hücre iskeleti Düzenlemesi <ol><li> Kültür içerisinde 48 saat sonra, bir Pasteur pipeti ile kültür ortamı ortadan kaldırmak ve hızlı bir şekilde PBS lamel 500 ul hemen PBS kaldırmak. </li><li> t Fix ve permeabilize37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca tespit tamponu (0.1 M BORU, pH 6.75,% 4, PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4,% 0.5 Triton X-100 ve% 2 formaldehid) lamel 500 ul O hücrelerin C </li><li> sabitleme tamponunu çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 3.5 paraformaldehit lamel 500 ul ilave edin. paraformaldehit çözüm çıkarın. </li><li> Her biri 5 dakika için PBS lamel 500 ul ilave edilerek lamelleri üç kez yıkayın. Sabit çalkalamada olarak, oda sıcaklığında lamelleri yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca 50 mM amonyum klorür ile inkübe hücreleri amonyum klorür çözeltisi aspire adım 5.4 tekrarlayın. </li><li> 30 dakika boyunca PBS içinde% 1 BSA (IgG içermez, proteazlar içermez) ile hücrelerin inkübe BSA çözeltisi çıkarın ve adım 5.4 tekrarlayın. </li><li> RT&#39;de 7 dakika, tekrar adımı 5.4 için rodamin-konjuge Phalloidin 50 uM inkübe hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika tekrar adım 5.4 PBS içinde seyreltilmiş DAPI 255 uM hücreleri inkübe edin. Sonunda t montajO bir montaj ortamı ile lamelleri ve oje ile mühür. </li><li> 541 nm eksitasyon dalga boyunda bir 63x objektif ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak aktin sitoskeletal düzenlemelerin görüntüleri elde edin. </li></ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+Extracellular+Matrix+Mimics+for+3D+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).</li>
<li>Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+T+%22Carbohydrate+chemistry%22">Carbohydrate chemistry</a>. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).</li>
<li>Jonitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+capacity+of+human+chondrocytes+embedded+in+alginate+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix.</a> Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).</li>
<li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+scaffolds+to+enhance+transplanted+myoblast+survival+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration.</a> Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+composition+effects+on+a+neural+stem+cell-seeded+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+C.+Methods%22%5BJournal%5D)">Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold.</a> Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).</li>
<li>Wee, S., Gombotz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+release+from+alginate+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein release from alginate matrices.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).</li>
<li>Tashjian, A. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+strains+of+hormone-producing+pituitary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Clonal strains of hormone-producing pituitary cells.</a> Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).</li>
<li>Fasekas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+pituitary+adenomas+in+cell+cultures+by+light+and+electron+microscopic+morphology+and+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Folia.+Histochem.+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling.</a> Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).</li>
<li>Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+Production+by+Human+Pituitary+Adenomas+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture.</a> Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).</li>
<li>Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+suspension+culture+of+human+prolactin-secreting+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).</li>
<li>Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+human+pituitary+tumor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures.</a> In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).</li>
<li>Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hormones+by+human+anterior+pituitary+cells+in+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).</li>
<li>Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+endonasal+surgery+for+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+neurosurg%22%5BJournal%5D)">Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas.</a> World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).</li>
<li>Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAplin%2C+J+%22Measuring+cell+adhesion%22">Measuring cell adhesion</a>. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).</li>
<li>Guiraud, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+prolactin-producing+pituitary+adenomas+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In.+Vitro.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture.</a> In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).</li>
<li>Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+alginate+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol pek çok kritik adımlar vardır. İlk hücre kültürünün tüm besinler ve gazların difüzyonu aynı koşullar korumak için gerekli olan boncuk büyüklüğü homojenliği vardır. Bizim tecrübelerimize göre, aljinat boncuk yapmak için bir 21 G iğne kullanımı üniforma boncuk boyutu verimli bir kültür edinimi için izin verir. İkinci önemli faktör iğne mesafedir; Bu mesafe, kalsiyum çözeltisinden 5 cm kalsiyum çözeltisinin yüzeyinde ile aljinat / hücre çözümü akışı çarpışması nedeniyle deforme inci ve ölü hücreleri önlemek içi...

Bunlar kültür edilmiş hücreler için üç boyutlu bir yapısal destek ve hücreden hücreye iletişimde 1 bakımını sağlamak için, üç boyutlu iskele kapsamlı hücre kültürü kullanılmıştır. Doğal olarak elde edilmiş polimer malzemeleri, tip I kollajenin, kitosan ve alginat da dahil olmak üzere, üç boyutlu bir yapı iskelesi yapmak için kullanılmıştır. Aljinat kahverengi deniz yosunu Macrocystispyrifera (deniz yosunu) elde edilen doğal bir polimerdir. Bu polimer β-D-mannuronik asit (M) ve α-L-guluronik asit (G), kalsiyum ve baryum gibi bazı iki değerli katyonların mevcudiyetinde 2 ve şekiller stabil jeller tekrarlanan birimlerden oluşur. Kalsiyum klorür (CaCI2) çözeltileri yaygın olarak, aljinat tanelerini oluşturmak üzere çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Aljinat çözeltiler hemen üç boyutlu küresel jel oluşturmak CaCI2 düştü. alginat çözeltisi hücreleri ile karıştırılır, hücreler aljinat B içine kapsüllenirEADS 3. Aljinat sağlamıştır olan özellikleri kondroitler 4 iskelet miyoblastların 5 ve nöral kök hücreler 6 da dahil olmak üzere hücreleri, çeşitli kapsüllenmesi için bir matris olarak kullanılmak zorundadır. Bu inert bir malzemedir ve besin, oksijen ve hücre yaşamını ve işlevini korumak metabolik ürünlerin dağıtılması için; Üstelik, diğer jel esaslı kültür sistemleri farklı olarak, aljinat taneleri içinde kültürlenmiş hücreler aynı zamanda, sodyum sitrat, kalsiyum şelatlar kullanılarak iskele serbest bırakılabilecektir ve hücreler daha sonra daha ileri araştırmalar 7 hasat edilebilir. Hipofiz adenomları tipik olarak düşük çoğalma oranları ile iyi huylu tümörlerdir. Fare hipofiz adenomları hücre çizgileri, iki boyutlu bir sistemin 8 başarılı kültürlenmiştir. Ancak, salgı insan hipofiz hücre tümörlerinin bu kültür verimli bir gelişme değildir; dağınık tümör hipofiz hücrelerinin zayıf büyüyecekkültürde hücreler yayılan sınırlı eki ve sergilemek ve hücreler genellikle kültür çanak 9,10 yüzen agregatlar oluştururlar. Birçok deneme enzimatik ve mekanik dispersiyon yaklaşım 11, salt mekanik bir dispersiyon yaklaşım 12 ve tümör eksplantlannın 10 kültür de dahil olmak üzere, bir tümör hipofiz hücresi süspansiyonu elde etmek için yapılmıştır. Bu yaklaşımlar ile farklı yazarlar farklı zaman aralıklarında için geçerli yapışık kültürleri elde edilmiştir. Tümör hücrelerinin salgı kapasiteleri tümör tipi ve üremeleri oranları 9 bağlıdır, bu iki boyutlu sistemlerde hayatta kalmak için. Ancak, uzun vadeli kültürlerde, fibroblast fenotipleri ile hücreleri 11,13 hakim. Bu makale ayrıca analizleri sağlayan alginat iskele onları açığa aljinat tanelerinde kapsüllenmiş hipofiz adenomları hücrelerinden bir birincil hücre elde edilmesi için bir yöntem tarif ederkendi hücre biyolojisi, örneğin, kendi iskelet düzenlemelerin yönleri.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktif&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>199 kültür ortamı&nbsp;</td><td>Canlandırıcı&nbsp;</td><td>31100-027</td><td>Kültür için, 37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-Hidroksietil) piperazin-N&akut;-2etansülfonik asit (HEPES)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin)</td> <td>İnvitrojen ve nbsp;</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip I</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin ve nbsp;</td><td>Canlandırıcı&nbsp;</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Araştırma Organikleri</td><td>3002E</td><td></td></tr><tr><td>Sorbean tripsin inhibitörü ve nbsp;</td><td>Canlandırıcı&nbsp;</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>2139</td><td></td></tr><tr><td>Aljinik asit, Macrocystis pyrifera (Yosun)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>A-2158</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td><td>JT Baker</td><td>1332</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat (Na3C6H5O7)</td><td>JT Baker</td><td>3646</td><td></td></tr><tr><td>Piperazin-N, N & prime;-bis (2-etansülfonik asit) (PIPES)</td> <td>Research Organics</td><td>9624P</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Glikol 6000 (PEG 6000)</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol tetraasetik asit (EGTA)</td><td>Araştırma Organikleri</td><td>9574E</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat (MgSO4)</td><td>JT Baker</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>JT Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür (NH4Cl)</td><td>J.T. Baker</td><td>660</td><td></td></tr><tr><td>BSA Sığır Serumu Albümini IgG İçermeyen</td><td>Jackson İmmüno Araştırması</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash; Tetrametilrodamin B izotiyosiyanat</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Toksik. Bu reaktifi işlemek için eldiven kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol, Dihidroklorür (DAPI)</td><td>İnvitrojen ve nbsp;</td><td>D1306</td><td>Toksik. Bu reaktifi işlemek için eldiven kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>Sülfürik asit (H2SO4)</td><td>JT Baker</td><td>9681</td><td>Çok aşındırıcı. Bu reaktifi işlemek için eldiven kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NAOH)</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td>Göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Bu reaktifi işlemek için eldiven kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan (APTS)</td> <td>Sigma</td><td>A-3648</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>T8154 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name&nbsp; &nbsp; </td><td>Company&nbsp; </td><td>Katalog Numarası&nbsp; </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td>Toksik: Kansere neden olabilir. Bu reaktifi işlemek için eldiven kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>Döndürücü&nbsp;</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>DuPont Corporation&nbsp;</td><td>Model sorvall TC6</td><td></td></tr><tr><td>çalkalayıcı&nbsp;</td><td>Laboratuvar Hattı Aletleri</td><td>Modeli 314-820&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan hipofiz adenom hücreleri üç boyutlu aljinat-boncuk kültür

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Üç boyutlu bir kültür yöntemi tarif edildiği primer hipofiz adenomları hücreleri aljinat taneleri yetiştirilir. Aljinat kahverengi deniz yosunu elde edilen bir polimerdir. Kısaca, tümör dokusu küçük parçalar halinde kesilmiş ve kolajenaz ve tripsin ile enzimatik sindirme sunulur. Daha sonra, bir hücre süspansiyonu elde edilir. Tümör hücre süspansiyonu% 1.2 sodyum alginat ile karıştırılmış ve bir CaCl2 solüsyonu içine düştü ve aljinat / hücre süspansiyonu küresel boncuklar oluşturmak üzere CaCI2 ile temas halinde jelleştirilmiş olmasıdır. Aljinat taneleri gömülü hücreleri,% 20 FBS ile zenginleştirilmiş kültür ortamı tarafından sağlanan besin sağlanır. aljinat taneleri üç boyutlu kültürü dört ay kadar uzun bir süre için adenom hücrelerin canlılığını muhafaza eder. Ayrıca, hücreler, sodyum sitrat olan boncuk yıkayarak alginat açığa çıkartılır ve daha immünositokimyasal analizler için cam lameller üzerine tohumlanabilir. Bir cel kullanımıl kültür modeli asgari örgütsüzlük ile aktin hücre iskeletinin fiksasyon ve görselleştirme için izin verir. Özet olarak, aljinat taneleri pituiter adenoma hücrelerinin bakımı için güvenilir bir kültür sistemi sağlar.

Bu protokol kültür ve farklı zaman dilimlerinde için aljinat boncuk adenom hipofiz hücrelerinin korunmasında başarı ile tatbik edilmiştir üç ay sonra Şekil 1 aljinat boncuk gömülü hücreleri Şekil.; Bu hücreler. ters ışık mikroskobu (Şekil 1) altındaki iki refraktif yuvarlak şekiller Şekil 2 alginat gömülü fare hipofiz adenomları Hücrelerinde N-kaderin lokalizasyonunu göstermektedir. N-kadherin, hücre-hüc...

Aljinat boncuklarda üç boyutlu kültür, basitliği ve tekrarlanabilirliği nedeniyle, hipofiz adenom hücrelerini korumak için seçildi. Prosedürler, ilk enzimatik sindirimi ve tümör dokusunun mekanik ayrışmasını içeriyordu ve sonraki hücre süspansiyonu, aljinat boncukları içinde kapsüllendi.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Bu yöntemin genel amacı, insan hipofiz adenomu hücrelerinin sürdürülmesi için üç boyutlu bir alginat boncuk kültürünü tanımlamaktır. Bu yöntem, istilacılığın farklı belirteçlerinin ekspresyonu gibi tümör hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diğer üç boyutlu sistemlerin aksine, alginat iskelenin, hipofiz adenomu hücrelerinin daha ileri incelemeler için alginat boncuklardan ayrıştırılmasına olanak tanımasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdaki araştırma görevlisi Carmen Solano-Agama gerçekleştirecektir. Başlamak için, laminer akışlı kabin içerisinde çalışırken, daha önce elde edilmiş adenoma tümör dokusunu yaklaşık 20 milliliters kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS bulunan 35 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Dokuyu yıkamak için cerrahi pens kullanarak dokuyu taze PBS içeren başka bir petri kabına aktarın.Alyuvarlar ve debris tamamen uzaklaştırılana kadar taze tampon çözeltiye aktarma işlemini tekrarlayın. Ardından, cerrahi pensle hipofiz adenomu dokusunu tutun ve küçük bir cerrahi makasla dokuyu küçük parçalara ayırın. Daha sonra, yuvarlak uçlu bir pasteur pipeti kullanarak doku fragmanlarını ve tamponu 15 milliliter'lik bir tüpe aktarın.Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 ×g'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, PBS'yi uzaklaştırmak için bir pasteur pipeti kullanın ve üç ila beş mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin. Tüpü tersyüz ederek iki ila üç kez karıştırın ve dokuyu kollajenaz içinde 37 °C'de, sabit rotasyon altında 30 dakika inkübe edin.Tüpü tekrar 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve kolajenaz solüsyonunu uzaklaştırmak için bir pasteur pipeti kullanın. 5 mililitre TNase ekleyin, tüpü tersyüz ederek iki üç kez karıştırın ve ardından örneği tekrar santrifüjleyin. Eğer doku tamamen disosiye olmamışsa, metin protokolüne uygun olarak ikinci bir enzimatik sindirim gerçekleştirin.Ardından, süpernatantı aspire edin ve atın. Sonra, peleti yeniden süspande etmek için bir hacim EGTA çözeltisi kullanın ve iki hacim aljinat çözeltisi ile nazikçe karıştırın. 21 gauge iğne içeren steril bir şırınganın pistonunu çıkarın ve aljinat ile hücre karışımını şırıngaya yüklemek için bir pipet kullanın.Pistonu şırıngaya nazikçe yerleştirin ve şırınga iğnesini, kalsiyum klorür çözeltisinden yaklaşık beş santimetre uzaklıkta olacak şekilde beherin içine yerleştirin. Şimdi, aljinat hücre süspansiyonunu dikkatlice damla damla behere aktarın. Süspansiyon, çözeltiyle temas ettiğinde jelleşerek küresel boncuklar oluşturacaktır.Boncukların birbirine yapışmasını önlemek için cam beheri dairesel hareketlerle yavaşça karıştırın. Ardından, aljinat boncuklarını kalsiyum klorür çözeltisinde beş dakika bekletin. İnkübasyonun ardından kalsiyum çözeltisini dikkatlice uzaklaştırın ve boncukları iki kez yıkamak için %20 FBS ile zenginleştirilmiş 3-5 mL M199 kullanın.Steril bir spatula ile alginat boncuklarını standart bir T25 doku kültürü flaskına aktarın ve üzerine FBS içeren dört ila beş mililitre M199 ekleyin. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve %5 karbondioksit ile inkübe edin. Ardından, metin protokolüne uygun olarak poli-D-lisin kaplı lamelleri hazırlayın.Aktin hücre iskeletini analiz etmek için, pipet yardımıyla kültür balonundan bir mililitre aljinat boncuğu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Beş mililitre 55 millimolar sodyum sitrat ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 ×g hızında santrifüjleyin. Ardından süpernatantı aspire edin ve atın.%20 FBS ile zenginleştirilmiş bir mililitre ılık M199 kullanarak pellet'i süspande ediyoruz ve hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırıyoruz. Ardından, hücreleri metin protokolüne uygun olarak saydıktan sonra, 13 milimetre çapındaki poli-D-lisin kaplı cam lameller üzerine 35.000 hücre ekiyoruz. Hücreleri 48 saat inkübe ettikten sonra kültür ortamını uzaklaştırıyoruz ve hücreleri bir kez yıkamak için PBS kullanıyoruz.Ardından, hücreleri sabitlemek ve permeabilize etmek için lam başına 500 µL fiksasyon tamponu ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Fiksasyon tamponunu uzaklaştırın ve lam başına 500 µL PBS içinde %3,5 paraformaldehit ekleyin. Çözeltiyi uzaklaştırmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Son olarak, hücreleri yıkadıktan ve metin protokolüne göre rhodamine konjuge phalloidin ve dapi çözeltisinde inkübe ettikten sonra, aktin sitoskeletinin görüntülerini elde etmek için 63x objektif ve 541 eksitasyon dalga boyuna sahip bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Bu şekil, üç ay sonra alginat boncuklar içinde gömülü adenoma hipofiz hücrelerini göstermektedir. Burada görüldüğü üzere, hücreler ters ışık mikroskobu altında çift kırılımlı yuvarlak şekiller sergilemektedir.Bu şekilde, aljinat içine gömülmüş sıçan hipofiz adenom hücrelerinde N-cadherin lokalizasyonu görülebilmektedir. N-cadherin hücre-hücre temas noktalarında lokalize olmuştur ve nükleus genişlemiş kromatin sergilemektedir. Bu deneyde, 10 fonksiyon göstermeyen insan hipofiz adenomu kullanılarak Ki67 immün reaktivitesi üzerinden proliferasyon indeksi elde edilmiş ve 19.2 ± 1.5% oranında bir ortalama etiketleme indeksi saptanmıştır.Burada, invaziv olmayan hücrelerin aktin sitoskeleti, küçük aktin stres lifleri ile birlikte uzamış şekiller sergilemiştir. Daha fazla dallanmalar ve aktin filaman düzenlemeleri, kültür sisteminden bağımsız olarak hipofiz adenomuna göre farklılık göstermiştir. Örneğin, fonksiyonel olmayan invaziv bir adenomda, bu hücreler arasındaki baskın şekil, aktin filamanlarının kesintili kortikal halkalarıyla birlikte yuvarlak şekildir.Yöntem kavrandıktan sonra, birincil hipofiz adenomu kültürü üç saat içinde tamamlanabilir. Doğru şekilde uygulandığında, alginat enkapsülasyonu 15 dakikada gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, alginat hücre solüsyonu akımının kalsiyum solüsyonu yüzeyiyle çarpışması sonucu oluşabilecek sert inci benzeri yapıların ve ölü hücrelerin önüne geçmek için, iğnenin kalsiyum solüsyonundan beş santimetreden daha uzak tutulmaması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, hipofiz adenomu hücrelerinin bu üç boyutlu iskelede hücre iskeletlerini nasıl organize ettikleri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, alginat parçacıklarının fiksasyonu ve ardından polietilen glikol iledehidrasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hipofiz adenomu hücrelerinin üç boyutlu alginat boncuk kültüründe nasıl sürdürüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

three-dimensional-alginate-bead-culture-human-pituitary-adenoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada kendi kendine montaj 3-boyutlu iskele kültür insan nöral progenitör hücrelerin kullanımını tanımlamak. Biz flow sitometri ile analiz edilecek daha sonra örneğin iskeleleri hücreleri serbest bırakmak için bir protokol mevcut. Bu protokol detaylı mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için diğer hücre türlerine adapte olabilir.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

Biz nöroendokrin kanser hücre hatlarını kullanarak 3D çok hücreli sferoidler büyümek için basit bir agaroz bindirme platformu sunmak. Bu yöntem, endokrin tümör hücreleri üzerindeki terapötik ilaçların etkisini araştırmak için çok uygun bir yol sağlar. Bu da bize kanser tedavisi için insan nöroendokrin tümör sferoidler kurulmasına yardımcı olabilir.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Bu video, glial hücrelerin üç boyutlu bir kültürünü oluşturmak için bir tekniği göstermektedir. Sıçan beyninden türetilen glial hücreler, hücre dışı matris bileşenleri içeren fotokrosçapraz bağlanabilir bir polimer matris içinde kapsüllenir. Bir büyüme ortamında inkübe edildikten sonra, glial hücreler, üç boyutlu bir kültür oluşturmak için destekleyici matris içinde çoğalır.

Sıçan Beyninden Elde Edilen Glial Hücrelerin Üç Boyutlu Bir Kültürünün Oluşturulması

Bu video, beyin tümörlerinden türetilen gliomasferlerin nasıl tek hücrelere ayrıldığını ve hyaluronik asit bazlı bir hidrojel içinde nasıl kapsüllendiğini göstermektedir. Bu süreç, yapılandırılmış, üç boyutlu bir glioblastoma modeli oluşturarak hücre-hücre etkileşimlerini teşvik eder.

Glioblastoma hücrelerinin 3 boyutlu kültürü için hyaluronik asit bazlı bir hidrojel

Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Kanser hücreleri bir kollajen jele gömülür ve daha sonra uydu tümörlerinin invazivliği ve oluşumunun izlenebileceği bir 3D kültür sistemi oluşturmak için bir aselüler fibrin jeli içine sıkıştırılır.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Burada, üç boyutlu kültür glioblastoma hasta elde edilen hücre içinde uygun tunable Biyomalzeme beyin matris taklit etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir vitro, in vivo glioblastoma hücre kültüründe genellikle kayıp birçok özelliklerini korur deneysel platformu sağlar.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Hasta BMPC örneklerinin üç boyutlu kültürleri ve kemik metastatik prostat kanserinin ksenogreftleri orijinal tümörlerinin fonksiyonel heterojenliğini korur ve bu da kistler, sferoidler ve kompleks, tümör benzeri organoidlerle sonuçlanır. Bu makale, heterojen hasta türemiş örneklerin 3D kültürü ve IFC kullanılarak analizleri için bir optimizasyon stratejisi ve protokolü sağlar.

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Hipofiz bezi, vücudun endokrin sisteminin anahtar düzenleyicisidir. Bu makalede, fare hipofizinden organoidlerin gelişimi, biyolojisi ve işlevi tam olarak anlaşılamayan bezin kök hücre popülasyonunu incelemek için yeni bir 3D in vitro model olarak açıklanmaktadır.

Hipofiz Kök Hücre Biyolojisini Keşfetmek için Fare Hipofizinden In Vitro Model Olarak Organoidlerin Geliştirilmesi

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Öğrenin, insan hipofiz adenom hücrelerini üç boyutlu aljinat-boncuk kültüründe nasıl sürdüreceğinizi. Bu yöntem, tümör hücre biyolojisi ve istila belirteçlerinin ekspresyonunu incelemek için güvenilir bir model sunar.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

Daha fazla video keşfet