(C I) Viral Mimik Poli ile Orta gebelik Sahnesi'nde Farelerde Anne Bağışıklık aktivasyonu indüksiyon

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik gelişimin orta gestasyonel evresinde viral benzeri poly'nin intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla farelerde maternal immün aktivasyonu (MIA) indüklemektir. Bu yöntem; immün disfonksiyonun beyin gelişimi ve davranışındaki bozulmalara nasıl yol açabileceği gibi, nöro-immünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, özellikle MIA'yı otizm ve şizofreni için çevresel bir risk faktörü olarak incelemek isteyen araştırmacılar için tasarlanmış olmasıdır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır; çünkü MIA indüksiyon yöntemindeki küçük farklılıklar, yavrulardaki alt akış tepkisini önemli ölçüde değiştirebilir. Zamanlanmış bir çiftleşme çifti oluşturmak için, östrus döngülerini senkronize etmek amacıyla standart fare kafeslerinde her kafese beş dişi fare gelecek şekilde yan yana yerleştirerek başlayın ve her hayvanı etiketlemek için kulak delme yöntemi kullanın. Karanlık döngü başlamadan sıfır ila iki saat önce, dişi fareleri her kafese iki adet gelecek şekilde yerleştirin, her bir farenin vücut ağırlığını tartıp kaydedin ve ardından her iki dişi farenin bulunduğu kafese bir erkek fare ekleyin.

Karanlık döngüsünün sona ermesinden sonraki sıfır ila dört saat arasında, her dişi fareyi kuyruk tabanından nazikçe kaldırın ve hayvanın kafes ızgarasını ön pençeleriyle kavramasına izin vererek vajinal açıklıkta beyazımsı bir kütle olup olmadığını belirleyin. Tıkaç belirgin değilse, vajinal açıklığa nazikçe 200 µL'lik bir pipet ucu yerleştirin. Koagülasyondan kaynaklanan direnç, bir tıkaç oluşumunu doğrular.

Vajinal tıkaç varlığı sadece çiftleşmenin gerçekleştiğini kanıtladığından, tıkacı olan fareleri yeni bir kafese gruplandırın. Embriyonik gün 10,5 ile 11,5 arasında, tıkacı olan her dişi fareyi kuyruğunun tabanından kaldırarak abdomeninde bir şişlik olup olmadığını kontrol edin, ardından gebeliği doğrulamak için fareleri tartın ve gebe hayvanları bireysel temiz kafeslerde barındırın. Poly(I:C) tozunu 50 mililitrelik konik tüpte tartın.

Embriyonik gün 12.5'te, konik bir tüp içerisindeki uygun hacimdeki poly(I:C) üzerine uygun hacimde %0.9 sodyum klorür ekleyin ve kapağı kapatın. Çözelti berraklaşana kadar salin damlacığını toz üzerinde nazikçe yuvarlayın. Ardından tüpü santrifüjleyin ve poly(I:C) çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

poly(I:C) çözeltisinin 260'a 280 oranını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Bu oran, üreticinin belirttiği üzere 1,54 ile 1,82 arasında olmalıdır. Ardından, ilk fareyi tartın ve 0,3 mililitrelik bir insülin şırıngasına hesaplanan karşılık gelen hacimdeki poly(I:C) çözeltisini doldurun.

Ardından, fareyi kuyruğundan tutarak kafesle üstüne yerleştirin ve ensesinden sabitleyin. Şimdi iğneyi, eğimli tarafı yukarı gelecek şekilde, iki üst meme ucunun merkezine, fareye göre yaklaşık 20 derecelik bir açıyla yerleştirin ve poly(I:C) çözeltisini uygulayın. Sonra fareyi tekrar kafese koyun.

Tüm farelere enjeksiyon yapıldıktan sonra, diğer karıştırıcı etkilerden kaçınmak için kafesleri sessiz, trafiği az bir odada tutun ve fareleri ertesi sabah tartın. Davranışsal testlerden en az üç gün önce, 8 ila 12 haftalık yetişkin maternal immün aktivasyon veya MIA yavrularının kafes altlıklarını değiştirin. Testten 30 dakika önce, fareleri test odasına alıştırın.

Bir ön-uyaran inhibisyon testi için, fareleri piezoelektrik bir sensörün üzerindeki pleksiglas silindirlere yerleştirerek sabitleyin. Fareyi, 120 desibel beyaz gürültünün altı denemesiyle birlikte beş dakika boyunca ön-uyaran inhibisyon odasına alıştırın. Ardından fareleri, tabloda belirtildiği şekilde randomize edilmiş ses karışımlarına maruz bırakın ve MIA hayvanlarının ön-uyaran inhibisyonunu belirlemek için sonuçları bazal irkilme yanıtı ile karşılaştırın.

Açık alan testi için bir fareyi, tanımlanmış 17 by 17 santimetre boyutlarında bir merkez bölgesi olan açık kare bir arenanın köşesine yerleştirin ve farenin izlediği yolu tavana monte edilmiş bir kamera aracılığıyla 10 dakika boyunca kaydedin. Ardından, merkez bölgesine giriş sayısını ve merkez bölgesinde geçirilen süreyi belirleyin. Mermer gömme testi için bir fareyi, 5 santimetre derinliğinde sıkıştırılmış temiz titrek kavak talaşı içeren bir test kafesine 10 dakika boyunca alıştırın; ardından fareyi ana kafesine geri koyun ve test kafesine 20 adet lacivert, 1.5 santimetre çapındaki cam mermeri dört by beşlik bir ızgara şeklinde nazikçe yerleştirin.

Şimdi fareyi 10 dakika boyunca test kafesine geri koyun, ardından hayvanı kendi kafesine yerleştirin ve test süresi boyunca gömülen boncukların sayısını sayın. Embriyonik gün 12,5'te yapılan Poly(I:C) enjeksiyonu, maternal plasental fetal eksende akut bir inflamatuar yanıt uyandırabilir ve beyin gelişimi ile davranışsal fenotipler üzerinde kronik bir etki oluşturabilir. Nitekim poly(I:C), enjeksiyondan üç saat sonra maternal dalak, plasenta ve fetal beyinde daha yüksek Il6 gen ekspresyonu indükler.

Genel olarak, salin ile işlem görmüş yetişkin yavrularla karşılaştırıldığında, MIA yetişkin yavrular açık alan testinde daha az merkez bölge girişi ve daha kısa merkez bölge süresi sergilerler. poly(I:C) enjekte edilen hayvanlar ayrıca mermer gömme testinde daha sık gömme davranışları ve daha düşük ön-uyaran inhibisyonu gösterirler. Serebellum lobul yedi'deki Purkinje hücre kaybı, MIA yavrularının bir diğer belirgin özelliğidir ve bu hayvanların serebellum lobul yedi'sinde, salin enjekte edilen kontrollere kıyasla daha az kalbindin pozitif Purkinje hücresi gözlemlenir.

Bu prosedür uygulanırken, MIA indüksiyonundan sonra gebe farelerin rahatsız edilmemesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Ardından, ek çevresel etkileşimleri incelemek için postnatal stres veya enfeksiyon gibi ek faktörler indüklenebilir.