Name: Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Öğrenin, genetik olarak kodlanmış FRET sensörü kullanarak hücre içi safra asidi dinamiklerini gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, metabolizma araştırmalarında etiketleme gerektirmeden canlı hücrelerde safra asidi taşımasını doğrudan görselleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ERC başlangıç hibeleri (ERC-2011-StG 280255 ve ERC-2013-StG 337479) ve Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü (Vidi 91713319) tarafından desteklenmiştir.

1. Geçici Transfeksiyon Not: CytoBAS ve NucleoBAS (Malzeme Tablo bakınız) başarılı bir şekilde çok sayıda hücre türleri (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK ve HEK293T hücreleri) kullanılmıştır. Sensör kullanmak için ana şartı o hücreye girmek için kodlama DNA gerektiren ifade edilecek gerekiyor. <ol><li> % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 FBS,% 1 L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) için uygun olan komple kültür ortamında hücrelerin seyreltilir. </li><li> Steril 8 de odacıklı cam kapak (0.8 cm 2) içine istenilen yoğunlukta Plaka hücreleri. Bu gerekli değildir, ancak bir alt-konfluent (% 60-80 konflüansa), deney günü hücre katmanı Amaç. </li><li> Oyuk başına 400 ul nihai hacme kadar komple kültür ortamı. Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir. </li><li> NucleoBAS ve 0.5 ug eklenmesi ile steril tüp içine transfeksiyon karışımı hazırlayınveya kültür ortamının 100 ul CytoBAS DNA (serum / antibiyotik serbest). Iyi girdap. Bir transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks karıştırın. Optimum verim vermek transfeksiyon reaktifleri hücre tipi bağlıdır ve önceki test gerektirebilir. <ol><li> Örneğin, 1 mg / ml polietilenimin (PEI) 2.5 ul kullanımı ve DNA / PEI 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın inkübe edin. </li></ol></li><li> Hücrelere damlacıklar transfeksiyon karışımı ekleyin ve hafifçe elle plaka sallayarak karıştırın. 9.6 cm 2 ~ bir kuyu için karışımın 100 ul ekleyin. Geçici olarak transfekte hücreler için ayrı ayrı görüntüleme odaları için transfeksiyon karışımı 10 ul kullanın. Not: 24-48 saat sonra, hücreler, safra asidi sensörü ifade edecektir ve deneyler için de kullanılabilir. </li></ol> 2. Kararlı Transfeksiyon <ol><li> % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 Fetal Sığır S için uygun komple kültür ortamında pelet seyreltinERUM,% 1, ml başına 150.000 hücre konsantrasyonunda L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) ve 6 oyuklu bir kültür plakasına (2 mi ucu hacim) oyuk başına yaklaşık 300,000 hücre ekleyin. </li><li> Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir. </li><li> CytoBAS veya NucleoBAS DNA 0.5 mikrogram ekleyerek steril tüpe tranfeksiyon karışımı hazırlayın kültür ortamında 100 ul (serum / antibiyotik ücretsiz) için (Malzeme Tablosuna bakınız). Iyi girdap. Bir transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks karıştırın. <ol><li> Örneğin, 1 mg / ml polietilenimin (PEI) 2.5 ul kullanımı ve DNA / PEI 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın inkübe edin. </li></ol></li><li> Hücrelere damlacıkları içinde transfeksiyon karışımı 100 ul ekleyin ve hafifçe elle plaka çalkalayarak karıştırın. Stabil bir hücre dizisi oluşturmak her zaman bir transfekte edilmemiş kontrol içerir. </li><li> 37 ° C&#39;de hücreler O / N büyütün,% 5 CO2. </li><li> Hücreleri tripsinize edin üreticinin protokolüne uygun olarak (37 ° C w hücreleri inkübei 1.5 ml 25 cm 2 hücre kültürü başına tripsin önceden ısıtılmış) ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 250 xg&#39;de onları aşağı doğru döndürün. Tam kültür ortamı içinde 13 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Çeşitli 10 cm çapında kültür yemekleri üzerine hücreler bölün: 0.5 ml (düşük yoğunluklu), 1.5 ml (orta yoğunlukta) ve 4.5 ml (yüksek yoğunluklu). 6.5 ml kalan için de yapın. </li><li> 10 ml nihai hacme kadar kültür ortamı. U2OS hücreleri için, örneğin CytoBAS olarak neomisin direnç kaseti ile plasmidler için 800 ug / ml G418 kullanmak NucleoBAS pozitif hücreleri seçmek için inşa eder. Bu konsantrasyonlar hücre tipi bağlıdır ve transfekte edilmemiş hücreler, 2 ila 10 gün (U2OS hücreleri için 800 ug / ml G418) içinde öldü düşük antibiyotik (G418) konsantrasyonu seçilerek belirlenebilir. </li><li> Untransfected hücreler ölene kadar uygun antibiyotik (G418) ile kültür ortamı her 72 saat yenileyin. </li><li> 20X bir amaç için mikroskop altında kültürü plakası inceleyinpozitif koloniler (floresans, yeşil, mavi veya sarı floresan için kullanılan en filtre kümesi kullanılarak izlenebilir). </li><li> Kültür çanak dış altındaki bir kalemle diğer kolonilerden izole yalan olumlu koloniler işaretleyin. </li><li> Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile iki kez plaka yıkayın ve aspire. Yaklaşık 15 steril klonlama silindirleri alın ve steril silikon içine batırın. Petri yemek hafifçe basılarak seçilen kolonilerin etrafında onları uygulayın ve birden fazla koloni klonlama halkada yer olduğundan emin olun. </li><li> Pipet 20 klonlama silindirde önceden ısıtılmış tripsin (1 x, 0.25%) ve ul ve yuvarlanır hücrelerin çoğu (mikroskopla dikkat edin) kadar 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Klonlama silindir (U2OS ve Huh7 hücreleri,% 10 FBS ve 800 ug / ml G418) serumu ve uygun antibiyotik ile kültür ortamında 150 ul ilave edin ve aşağı hücreleri tekrar süspansiyon ve 96- aktarmak birkaç kez pipetleyin veiyi plaka. 4-24 saat sonra orta yenileyin ve hücreler önümüzdeki birkaç gün (37 ° C, U2OS ve Huh7 hücreleri için% 5 CO 2) &#39;de konfluent büyümeye olanak sağlar. </li><li> Her 3 veya 4 gün antibiyotik ile orta yenileyin. Hücreler konfluent büyüdü sonra, daha geniş bir plaka aktarabilirsiniz. Kültür deneyler için yeterince büyük olana kadar bu adımı yineleyin. Yedekleme için bazı şişeleri cryopreserve. Soğukta saklama ortamı takviyesi olmayan ortam (DMEM) içinde% 20 FBS ve% 20 DMSO içerir. Not: Şimdi, hücre çizgisi monoklonal ve safra asidi Sensor ifade etmek için kararlı olarak düşünülmektedir. Antibiyotik G418 (400 mg / ml) yarısı konsantrasyonu stabil hücre ekspresyonu sağlamak için artık yeterli olmaktadır. </li></ol> 3. Lentiviral İletimi Not: Bazı hücre çizgileri, polietilenimin (PEI) yöntemi gibi geleneksel yöntemler ile transfekte etmek zordur olarak kabul edilir. Hücrelerin viral transdüksiyon etkin alternatif bir araç fveya gen dağıtım ve stabil transgen ekspresyon. <ol><li> % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 FBS,% 1 L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) için tam kültür ortamı içinde hücreler, uygun seyreltilir ve 6 oyuklu bir kültür plakasına oyuk başına yaklaşık 200,000 hücre ekleyin. </li><li> Oyuk başına 2 ml&#39;lik bir nihai hacme kadar kültür ortamı. Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir. </li><li> 500 ul CytoBAS lentivirüs (isteğe bağlı olarak) ihtiva eden ortam ile 4-6 saat boyunca kuluçkaya hücreler viral transductions gerçekleştirme 10 ug / ml dietilaminoetil (DEAE) -dextran ya da başka bir lentiviral içeren tam kültür ortamı ile 1 ml &#39;lik bir toplam miktar kadar doldurulur transdüksiyon arttırıcı. Untransduced kontrol hücreleri ile bir kuyu eklemeyi unutmayın. </li><li> Ortamı çıkarın ve istenen antibiyotik (500 ug / ml higromisin) içeren tam kültür ortamı 2 ilave edin. Temin CytoBAS transdüksiyon bir lentiviral yapı kullanaraks hücrelere direnç higromisin. İstenen şartlar altında hücrelerin büyütün. </li><li> 3 günde antibiyotik (500 ug / ml higromisin) ile orta yenileyin ve% 80 confluent, tüm negatif kontrol hücreleri ölene kadar (çoğu hücre hatları için yaklaşık 1-2 hafta sürer) ne zaman hücreleri bölme. Hücre hattı artık Safra Asit Sensörü ifade etmek için stabil sayılır. <ol><li> Seçenek olarak ise, 1-3 gün viral transdüksiyon sonra deneyler için hücreleri kullanır. Canlı virüs mevcut olabilir gibi, bu uygun güvenlik düzeyine sahip odalarda FRET-okuma ekipmanı gerektirir. </li></ol></li><li> Seçenek olarak ise, stabil hücre hatlarının izolasyonu için hızlı, floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) gerçekleştirmek. <ol><li> Bir konfluan 160 cm 2 şişesi Hasat hücreleri. </li><li> Ml başına en fazla 5 x 10 6 hücre bir konsantrasyona &lt;% 5 serum ile Leibovitz kültür ortamı hücreleri (L-15 ortamı) ile seyreltilir </li><li> Sıralanan hücrelerin toplanması için toplama orta 1 ml (L-1 ile FACS tüpleri doldurmak5 ortamı +% 1.5 pen / strep,% 1 L-fazlalığı ve% 20 serum). </li><li> 405 lazerle heyecanlı sitrin (520-580 nm) veya Cerulean (450-520 nm) için sıralama hücreleri. </li><li> Yaklaşık 500,000 hücre sıralama sonra hücreler (5 dakika, 250 x g) durması ve 5 ml bunları tekrar süspansiyon, normal komple kültür ortamı (% 10 FBS, 250 ug / ml Higromisin U2OS ve Huh7 CytoBAS hücreleri) ve bir T25 kültür onları plaka şişe. İstenen koşullar (37 ° C U2OS ve Huh7 hücreleri,% 5 CO2) altında hücre büyütün. </li></ol></li></ol> Safra Asit Sensör 4. Canlı Hücre Görüntüleme Not: safra asidi taşıyıcıları ihtiva eden hücreler, lipofilik bileşikleri çıkaran% 1-10 kömür filtrelendi serumu ile ortam içinde kültürlenebilir. Normal serum sık sık Safra Asit Sensör hücre içi safra asidi birikimine ve doygunluk yol açabilecek safra asitleri içerir. <ol><li> Konfokal mikroskop kullanılarak FRET ölçümler <ol><li> Sabit olarak veya transie hücreler plakantly steril 8 kuyu lamel dipli haznesi slayt içine istenilen yoğunlukta sensörü ifade (0.8 cm 2). Tüm kültür ortamı hücreleri büyümek (kömür filtrelendi serum kullanılarak), böylece deney gününde, birbirine karışmaya yaklaşık% 60-70 kadardır. </li><li> PBS veya Leibovitz L-15 kültür ortamında 1 x 200 ul ile bir kez oda slayt yapışık hücreler yıkanır. </li><li> Herhangi bir CO2 kontrol edilmesi gereklidir, böylece aspire edin ve 300 ul Leibovitz L-15 kültür ortamı ile değiştirin. Not: fenol kırmızısı olmadan DMEM da kullanılabilir, ancak CO 2 tamponlu koşulları gerektirir. Safra asidi sensörü gösterileri (bazı) pH duyarlılığı öylesine veri toplama sırasında pH sabit tutmak hedefliyoruz. </li><li> L-15 kültür ortamında da konfokal görüntüleme deneyinde kullanılacak bileşikleri seyreltilir. Görüntüleme sırasında, oda içindeki sıvının nispeten büyük miktarlarda numune (50-100 ul), hızlı bir şekilde karışmasını sağlamak için ilave edilmesi gerekir dikkate almakböylece 3-5x çözümler yapmak. </li><li> 37 ° C inkübasyon odası ile bir konfokal mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın ve menekşe 405 nm lazer açın. Amaç üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve bunun üstüne 8 odasına yerleştirin. FRET tek hücre görüntüleme için, 63X yağ objektif kullanın. Sensör başarıyla oda sıcaklığında kullanılır olmuştur, ancak hücre davranışı değişmiş olabilir. </li><li> Düzgün konfokal mikroskop ayarlarını yapın. <ol><li> Set Toplama modu: XYT (tek odak düzlemi zaman atlamalı görüntüleme). </li><li> Denemeyi duraklamadan bileşikler satın almalar arasında eklenecek izin 20 sn aralıklarla görüntüleri edinin. </li><li> Cerulean: Emisyon tespiti için ayarlayın spektral aralık 450-520 nm; Sitrin: 520-580 nm. </li></ol></li><li> Transillüminasyon ışık kullanılarak tek bir hücre tabakası üzerinde odaklanır. Görüntüleme başlatın ve daha doğrusu z-konumunu ayarlamak. Kazanç ayarlayın ve devam ederken arka planda gelen sinyali ayırt etmek her kanal için ofsetilgi hücreleri tüm pikseller için iyi bir doyma aşağıdaki ing. </li><li> Faiz (ROI) bölgeyi tanımlamak için daireler çizin. Benzer floresan gösteren hücreleri seçin. Açıkçası boyut ve şekle ortalama hücre farklı hücreler kaçının. Sensörün photobleaching en aza indirmek için mümkün olduğu kadar kısa bir süre boyunca ışığa hücreleri Açığa. Bu hücre çevresine çok yakın değil ROI&#39;leri çizmek tavsiye edilir. Bu alan, fokal sürüklenme (z-yönünde hareket eden hücreler) daha zor deney sırasında flüoresan oranındaki değişiklikleri izlemek için hale getirmek için flüoresan yoğunluğundaki değişimlerle en duyarlıdır. </li><li> Konfokal mikroskop ile ölçümler başlayın. Gök mavisi ve sitrin floresan sabit olana kadar bekleyin. </li><li> Ölçüm sırasında seçilen zaman noktalarında 50-100 ul safra asitleri veya başka bileşikler ekleyin. Sıvı (nihai hacmin üçte birine beşte biri) nispeten yüksek miktarlarda / p çalkalamadan (10 saniye içinde) de sıvıları karıştırmak için gerekli olanYukarı ve aşağı ipetting. Pipet ile 8-iyi odasının kenarına dokunacak ve hücreler odak dışında alamadım böylece yavaş yavaş sıvı eklemek için emin olun. Plato fazı ulaşılmadan önce yeni bileşikler ilave etmeyin. Bu yaklaşık 200 saniye sürer. </li><li> 100 ul GW4064, son konsantrasyonu 5-10 uM (sensör doyurucu doz) eklenmesi ile her deney sonlandırın ve sensör floresan stabil olana kadar bekleyin. </li><li> Denemeyi kaydedin ve bir AVI dosyası olarak veri ihracat. </li><li> ImageJ aç hem AVI dosyaları (kanal 00, gök mavisi, 01 kanal, sitrin) Eklentiler&gt; Yığınlar&gt; Yığın harmanlayıcıyı seçerek. Alternatif doğrudan Görüntü J, ithalat confocal dosyası (örneğin, .lsm veya .lif dosyaları) (http://www.openmicroscopy.org mevcut) uygun eklentileri kullanarak ve 4.1.14 adıma geçin. <ol><li> Stack 1: Kanal 01 (sitrin) kullanın. </li><li> Stack 2 için: Kanal 00 (cerulean) kullanın. </li></ol></li><li> Düzenle üzerine tıklayın&gt; Seçim&gt; ekleyöneticiye, ROI yöneticisi penceresini açmak için. Onay kutusunu işaretleyin &#39;Tümünü Göster&#39;. </li><li> Oval Seçim aracıyla belirli hücrelerin kapsayan ilgi birkaç bölgelerini (ROI) çizin. Ayrıca hücrelerin dışında veya arka plan sinyalini belirlemek için sensör ifade etmeyen bir hücrenin içerisindeki bir alanda tek daire çizin. Bu bağlı fokal sürüklenme (z-yönünde hareket eden hücreler) ya da hücre göçü için floresan yoğunluğundaki değişiklik belirgin iken deneylerde hücre çevresine çok yakın ROI çizmek için tavsiye edilir. </li><li> Tek hücreyi seçin. Eklentiler&gt; Oran Profiler tıklayın. RAW, oran ve Ratio_Profile Bu 3 ekranlar ile sonuçlanacaktır. RAW penceresi FRET varsa sitrin (mavi çizgi) yoğunluğundaki artış ve cerulean (kırmızı çizgi) bir düşüş göstermektedir. Oran penceresi FRET bir artış ile artacağı cerulean oranı sitrin / hakkında bilgi verir. Ratio_Profile penceresi her iki kanal ölçülen floresan yoğunluğunun gerçek sayısını verir. MICROS EğerDosyaları kanal sırası tersine olabilir kullanılan kurulum özgü dosyaları (örneğin, .lsm veya .lif yerine avi) baş. </li><li> Ek veri olarak ekli e-tabloda Ratio_Profile penceresinden verileri kopyalayın. Diğer tüm hücreler (ve arka plan ROI) için de yapın. Not: Online e-tablo, tüm veri maksimum BAS aktivasyonu beklenen hangi duruma normalize edilir. GW4064 FXR en güçlü bir aktivatör olduğu göz önüne alındığında, GW4064 bir fazlalık ile inkübe edildikten sonra flöresan oranı Bu GW4064 ilavesiyle deney sonuna tek önemlidir 1 olarak ayarlanır. Bunun avantajı, verileri artık daha kolay bir şekilde kıyaslanabilir farklı günlerde lazer yoğunluğu ya da dedektör kazanç ve deneyler bağımlı olmasıdır. Ayrıca, elektronik tablonun alt grafikte, bir çalışan ortalama deneysel gürültü eğrileri düzeltmek için de kullanılabilir. Çalışan Avera beri, kinetik veriler analiz Ancak, bu grafiği kullanmayınge pürüzsüz, hızlı kinetik tepkiler de olacaktır. </li></ol></li><li> Kontrol THP kullanılarak FRET ölçümleri (FACS) <ol><li> Steril FACS alım tamponu (0.3 mM EDTA,% 0.5 BSA,% 0.01 NaN3 ve 10 mM D-glukoz) FACS deneyi için tüm bileşikleri seyreltilir. </li><li> PBS içinde 5 mM EDTA kullanılarak% 80 birbirine bağlı T-160 cm 2 hücre kültür şişesi Hasat hücreleri. 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Oda sıcaklığında 5 ml FACS alım tamponu içinde yıkayın hücre topağı 2x. </li><li> Coulter Sayacı veya sayma odacığı kullanılarak hücre sayımı. </li><li> 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar FACS alım tamponu pelet seyreltin. Tek hücre homojen bir süspansiyon oluşturmak için yukarı ve aşağı pipet ve. Hücreler ayrıştırmak zordur iseniz, meme takunya en aza indirmek için sıralama önce hücre süzgecinden örnekleri koydu. </li><li> Pipet 200 ul FACS tüpü başına hücre ve ışıktan koruyunuz. </li><li> Bileşiğin istenen konsantrasyonu ekleme (örneğin,, Safra asitleri, sentetik FXR ligandlar, taşıyıcı inhibitörleri). Vortex. (Karanlıkta) çalkalayarak oda sıcaklığında 20-30 dakika kuluçkalayın. </li><li> Bu arada, FACS (lazerler ısınmak için zamana ihtiyacım var) başlatın. </li><li> Deney (bakınız Şekil 3) için yolluk parametreleri flow sitometri ayarlayın: <ol><li> Kapıları belirlemek için hücreleri transfekte 100.000-200.000 NucleoBAS veya CytoBAS etrafında yükleyin. </li><li> İlk arsa merkezinde hücreleri çizmek için FSC ve SSC gerilimler ayarlayın. </li><li> Menekşe lazer kullanarak Cerulean (450/40 nm) gerilim değeri ve sitrin (525/20 nm) gerilim ayarlamak ve tüm NucleoBAS veya CytoBAS pozitif hücreler dağılım arsa içinde çizilen emin olun. </li><li> Bakınız Şekil 4, doğru kapıları (Gate P4 kadar Gate P1) ayarlayın. <ol><li> SSC-A / FSC-A arsa ortasında ana nüfusu seçerek genellikle sol alt köşesinde görüntülenen ölü hücreleri, dışlamak için kapı P1 kullanın. </li><li> Gate P2 kullanınFSC-H / FSC-bir pencere analizinden duplets kaldırmak için. Tek hücreler çiftler daha diyagonal çizgi sunulmuştur. </li><li> Sitrin Gate P3 (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) pencere citrine ve gök mavisi yüksek hücrelerin yolluk, NucleoBAS / CytoBAS pozitif hücreleri seçmek için kullanılabilir, bir nüfus sağ üst köşesinde çaprazdan görüntülenen arsa. </li><li> Mümkün olduğunca yakın nüfusun sol üst, kapısının P4 çizin ve hücrelerin en fazla 5% Bu kapının içinde kalan emin olun. </li></ol></li><li> Otomatik floresan belirlemek için bazı untransfected hücreler (CytoBAS veya NucleoBAS hiçbir ifadesi) yükleyin. Untransfected nüfus kapısı P3 bulunan olmayabilir. Otomatik floresan hücreleri hariç gerektiğinde kapı P3 ayarlayın. </li></ol></li><li> FACS tüpleri koymadan önce örnekleri Vortex. Her bir örnek için, kapı P3 en az 10,000 hücre ölçer. Not: Nüfus Hiyerarşi Pencere olayların sayısını verirebeveyn kapısının her kapısı ve% için görüntülenen. Kapının 4&#39;te, ebeveynin% Tüm NucleoBAS pozitif hücrelerin yüzdesi olarak artan bir sitrin / cerulean oranı hücreleri belirtmektedir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo%3A+basis+of+biosensor+construction%2C+live+imaging%2C+and+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li>
<li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
<li>Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+FRET+sensor+proteins+based+on+mutually+exclusive+domain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).</li>
<li>Lindenburg, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Stickiness%3A+Thermodynamic+Characterization+of+Intramolecular+Domain+Interactions+To+Guide+the+Design+of+Fo%CC%88rster+Resonance+Energy+Transfer+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors.</a> Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).</li>
<li>van der Velden, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+bile+acid+transport+in+single+living+cells+using+a+genetically+encoded+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor.</a> J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).</li>
<li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heteromeric+organic+solute+transporter+%CE%B1-%CE%B2%2C+Ost%CE%B1-Ost%CE%B2%2C+is+an+ileal+basolateral+bile+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter.</a> J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).</li>
<li>Meier, P. J., Stieger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salt+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bile salt transporters.</a> Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).</li>
<li>Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mTurquoise-based+cAMP+sensor+for+both+FLIM+and+ratiometric+read-out+has+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range.</a> PLoS One. 6 (4), e19170(2011).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Plass, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesoid+X+receptor+and+bile+salts+are+involved+in+transcriptional+regulation+of+the+gene+encoding+the+human+bile+salt+export+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump.</a> J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada canlı hücrelerin safra asidi taşıma uzaysal dinamiklerini izleme yeteneğine sahip yeni bir genetik olarak kodlanmış safra asidi sensörü kullanılması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu biyosensör böylece FRET tabanlı safra asidi sensörüne (BAS) oluşturulması, FXR-LBD&#39;sine füzyonla birleştirilir gök mavisi ve sitrin floresan proteinlerden oluşur. Hücre kültürü ve FACS veya (konfokal) mikroskopi temel deneyime sahip olduğunda Safra Asit Sensör kullanımda nispeten basit ve kullanı...

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) yaygın olarak yüksek zamansal ve uzaysal çözünürlüğü 1 ile canlı hücrelerin hücresel fonksiyonları daha iyi anlayabilmek için kullanılır. FRET olarak uyarılmış bir donor-florofor enerji alıcı bir florofor aktarılır. Verimliliği FRET verici ve alıcı bir florofor ve yönelimi arasındaki mesafe sıkı bir şekilde bağlıdır ve bu nedenle, iki florofor etkileyen konformasyonel değişiklikler duyarlı bir değerini göstermektedir. Bu olay küçük moleküllerin görüntüleme için FRET tabanlı biyosensörler oluşturmak için istismar edilmektedir. Artar / verici florofor 2 karşı alıcısı emisyon şiddeti oranı azaldıkça bunların konsantrasyonundaki değişiklikleri takip edilebilir. Örneğin, FRET bazlı kalsiyum biyosensör hücreler 3 canlı M serbest kalsiyum konsantrasyonlarında hızlı ve kararlı bir tespiti için verir. FRET tabanlı biyosensörler diğer avantajları tek canlı hücrelerinde görüntüleme vardır, tvaris non-invaziv, yetenekleri değişik hücre türleri ve hücre bölmeleri 4 hedeflenmesini. Hücre içi safra asidi dinamiklerinin birçok yönü hala tam olarak anlaşılamamıştır. Örneğin, küçük konjuge ve konjuge olmayan safra asidi taşıma mekanizması altında yatan yönetmelik hakkında bilinmektedir. Teknikleri Mevcut bu taşıma öncelikle lusiferaz-tabanlı gazetecilere, radyoaktif işaretli safra asitlerinin, ya da floresan safra asidi analoglarının faydalanmak izlemek. İkincisi muhtemelen onların özelliklerini etkileyen safra asitlerinin değiştirilmesine gerektirir. Lusiferaz tabanlı muhabirler kötü zaman çözünürlüğe sahip. Bunun yanı sıra, bu teknikler, örneğin kaybına neden olur ve tek hücre görüntüleme için geçerli değildir. Bu nedenle, bu rasyometrik algılama 5, 6 avantajı içerir, çünkü özellikle FRET biyosensörler kullanan taşımacılık faaliyetlerinin canlı tek bir hücre görüntüleme sağlayan yöntemleri kullanmak yararlı olacaktır. Iken CF varyantlarıP / YFP formu en sık FRET çiftleri kırmızı-kaymıştır safra asidi sensörü 7 de dahil olmak üzere yeni sensörler ile FRET araç kutusunun bir genişlemeye yol açmıştır kendini dernek uyaran mutasyonları taşıyan Morange ve mCherry kullanarak yeni stratejiler kullanılmıştır. Daha önce farnesoid X reseptörü (FXR) ligand bağlanma domeni ile kaynaşmış bir donor-florofor (cerulean) ve bir akseptör-floroforu (sitrin) oluşan genetik olarak kodlanmış FRET safra asidi sensörüne (BAS) hazırlandı (FXR-LBD) ve bir peptit, bir LXXLL motifi 8 ihtiva etmektedir. Bir safra asidi bağımlı bir şekilde FXR-LBD This peptid ilişkilendirir. FXR aktivasyonu üzerine, sitrin ve Cerulean arasındaki uzaklık şekilsel bir değişikliğe bağlı değiştirecektir. Memeli hücre hatlarında, sitrin / cerulean oranında açık bir şekilde tespit edilebilir bir artış FXR, etkinleştirme, saflaştırılmış sensör ters yönde çalışır ve FXR aktivasyon üzerine azalan bir FRET oranı neden olurken. Bu sensör (CytoBAS)Sitozolik safra asidi dinamikleri izlenmesine olanak sağlar. Hücre içi hedefleme motifleri karboksil terminal ilavesi ile, BAS konstrukt, farklı hücre bölmeleri safra asidi konsantrasyonlarının ölçülmesini sağlar çekirdeğin (NucleoBAS) ve peroksizom (PeroxiBAS) hedeflenebilir. Peroksisomal hedefleme motifinin eklenmesi safra asitleri olan yanıt zarar vermez, ancak hücre geçirgen FXR-ligandları bir peroksizom 8 içindeki PeroxiBAS değişiklikleri FRET uyarmadı. Bu tutarsızlık doğası bilinmemektedir gibi, protokol aşağıda CytoBAS ve NucleoBAS odaklanmıştır. Bu genetik olarak kodlanmış FRET sensör kullanımı yakın zamanda safra asidi taşıyıcıları + / taurokolat ko-taşıma polipeptid (NTCP), Na ve organik çözücünün taşıyıcı alfa / beta (OSTαβ) 8 ihtiva eden hücreler gösterilmiştir. NTCP başlıca karaciğer safra asidi ithalatçı ve OSTαβ bir bazolateral bağırsak safra olduğunuelektrokimyasal safra asidi konsantrasyonu gradyanı 9, 10 bağımlı bir ithalatçı ve ihracatçı hem işlev görebilir asit taşıyıcı. Son veriler NTCP ve / veya OSTαβ safra asidi taşıma sırasında, ligand-FXR-LBD etkileşiminin bir sonucu olarak, FRET oranda sağlam ve hızlı yanıt gözlenebilir gösterdi. Burada, biz böyle odaklı mikroskopik analiz ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) olarak FRET ölçmek için yöntemler ayrıntılı protokoller tanımlayan kritik adımları vurgulamak, olası sorunları çözmek ve alternatif yöntemleri tartışmak. Bu genetik olarak kodlanmış FRET sensörünü kullanarak, FXR-LBD ile safra asidi etkileşimi sayısal ve canlı hücrelerin doğrudan izlenir ve gerçek zamanlı olarak safra asidi taşıma ve dinamiklerini görselleştirme hızlı ve basit bir yöntem sağlar edilebilir. CytoBAS ve NucleoBAS kodlayan memeli sentezleme plasmidleri ticari olarak temin edilebilir. Bu nedenle, bu biyosensör daha katkıdasafra asidi taşıyıcılar veya FXR etkinleştirmek ve safra asidi biyoloji ve sinyalizasyon içine daha derin bir kavrayış sağlayan bileşiklerin anlayış.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagles ortamı (DMEM)</td> <td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>L-glutamin içermeyen yüksek glikoz</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (kalem / strep)</td> <td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin (200mM)</td> <td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>İnvitrojen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (10x)</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25 hücre kültürü şişesi</td><td>VWR uluslararası</td><td>392-0253</td><td>Laminin kaplı</td></tr><tr><td>T-175 hücre kültürü şişesi</td><td>VWR uluslararası</td><td>392-0238</td><td>Laminin kaplı</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>VWR uluslararası</td><td>734-0229</td><td>Poli-L-lizin ve Laminin kaplı</td></tr><tr><td>10 cm çanak</td><td>VWR uluslararası</td><td>392-0243</td><td>Laminin kaplı</td></tr><tr><td>Dietilaminoetil (DEAE) - Dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (genetik) 50 mg / ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin B, 50 mg / ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Klonlama silindiri (6 x 8 mm)</td> <td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz kültür ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Fenol kırmızı</td></tr><tr><td>Polistiren yuvarlak tabanlı tüp (5 ml) Facs tüpü</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Kapaksız, steril olmayan</td></tr><tr><td>Falcon 2,063 tüp (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Çıtçıtlı kapak, steril</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8 kuyulu kapak camı</td><td>Thermo scientific</td><td>155409</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Kömür filtreli FBS</td><td>Life teknolojileri</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Diğer kimyasallar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nv t.</td><td></td></tr></tbody></table>

genetik olarak kodlanmış fret tabanlı safra asit sensor kullanımı hücre içi safra asit dynamics gerçek zamanlı İzleme

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), tek hücrelerde protein katlanmasını, etkileşimini ve lokalizasyonunu izlemek için güçlü bir araç haline gelmiştir. FRET prensibine dayanan biyosensörler, canlı hücrelerdeki hücre altı sinyalleşme olaylarının yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlükle gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlamıştır. Burada, farnesoid X reseptörü ligand bağlanma alanına (FXR-LBD) kaynaşmış iki florofordan oluşan, böylece çok sayıda safra asidi türü ve diğer (sentetik) FXR ligandları tarafından aktive edilebilen bir safra asidi sensörü oluşturan genetik olarak kodlanmış bir Safra Asidi Sensörünün (BAS) uygulamasını açıklıyoruz. Bu sensör, safra asidi konsantrasyonlarını lokal olarak ölçmek için çekirdek (NucleoBAS) ve sitozol (CytoBAS) dahil olmak üzere farklı hücresel bölmelere hedeflenebilir. Floresan etiketler veya radyonükleuslar ile etiketlemeye gerek kalmadan endojen safra asitlerinin hücresel safra asidi akışının, akışının ve hücre altı dağılımının hızlı ve basit bir şekilde ölçülmesine izin verir. Ayrıca, BAS FRET sensörleri FXR ligand bağlanmasını izlemek için faydalı olabilir. Son olarak, bu FRET biyosensörünün, spektral olarak farklı diğer floroforların görüntülenmesi ile birleştirilebileceğini gösteriyoruz. Bu, hücre içi safra asidi dinamiklerinin ve i) ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonu ve/veya bolluğunun veya ii) tek bir hücrede hücre içi sinyallemenin birleşik analizine izin verir.

Sunulan FRET BAS sensörü, iki florofor sitrin ve gök mavisi) ile bir LXXLL motifi bağlı FXR (LBD-FXR) ligand bağlanma dayanmaktadır. Bu sensör, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe (Şekil 1 A) canlı hücreler safra asidi taşıma soruşturmalar izin verir. Gök mavisi ve sitrin mutasyonlar molekül içi kompleksi (Şekil 1 B) oluşumunu teşvik etmek için uygulanmıştır. Safra asitleri ve diğer F...

Genetik olarak kodlanmış bir BAS FRET sensörü kullanarak canlı hücrelerde safra asidi dinamiklerini incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu Safra Asidi Sensörü, çok çeşitli hücre tiplerinde safra asidi taşınmasını ve FXR aktivasyonunu incelemek (düzenlemek) için benzersiz bir araçtır.

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Bu prosedürün genel amacı, safra asidi taşınmasını ve dinamiklerini yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükle kolayca görselleştirmek için Genetik Olarak Kodlanmış bir FRET Safra Asidi Sensörü kullanmaktır. Bu sensör, safra ve dinamiklerin glikoz, lipitler ve enerji metabolizması ile ilişkisi gibi temel metabolik soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, safra asidi taşınmasının artık safra asitlerinin etiketlenmesine gerek kalmadan tek canlı hücrelere doğrudan izlenebilmesidir.Bu yöntem, hücre ve safra asidi taşınması ve dinamikleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, etkileri veya aktivasyonu ve tek canlı hücreleri görselleştirmek veya protein lokalizasyonu ile safra asidi taşınmasının görüntülenmesini birleştirmek için de kullanılabilir. Genetik olarak kodlanmış safra asidi sensörü, bundan böyle sensör, bir donör gök mavisi florofordan ve sitrin florofor hariçten oluşur.İki florofor, bir FXR ko-faktörü olan peptide kaynaşmış FXR nükleer safra asidi reseptörünün ligand bağlama alanı ile bağlanır. İki florofordaki iki tasarlanmış amino asit değişikliği, gök mavisi ve sitrin arasındaki moleküller arası etkileşimleri teşvik eder. Sensörü taşıyan iki farklı yapı kullanılmıştır.Bir yapıda, sensör c-terminal nükleer lokalizasyon sinyalini içerir ve bu nedenle çekirdekte birikir. Diğer yapıda, sensör herhangi bir hedefleme dizisinden yoksundur ve bu nedenle sitoplazmada lokalize olur. Aşağıdaki video protokolü, sensörün canlı hücrelerde nasıl görüntüleneceğine odaklanmaktadır.Metin protokolü, sensörü ifade eden hücrelerin nasıl tasarlanacağını ve bunların gerçeklere göre nasıl daha fazla analiz edileceğini kapsar. Hücreleri görüntülemeye hazırlanırken, sensörü istenen yoğunlukta ifade eden hücreleri, tam kültür ortamında steril, sekiz kuyulu bir kapak kaymalı alt hazne kızağında plakalayın. Hücreler yüzde 60 t0 70 birleşmeye ulaştığında deneye devam edin.Hazne sürgüsüne yapışan hücreleri 200 mikrolitre 1x PBS veya Leibovitz L-15 Kültür Ortamı ile bir kez yıkayın. Ardından, çözeltiyi aspire edin ve 300 mikrolitre Leibovitz L-15 Kültür Ortamı ile değiştirin, böylece CO2 kontrolü gerekmez. Leibovitz L-15 yerine Fenol Kırmızısı ile DMEM kullanılıyorsa, sensör PH'a duyarlı olduğu için veri toplama sırasında PH'ı takip etmeyi planlayın. Daha sonra, deneyde kullanılacak bileşiklerin seyreltmelerini GW4064 ve TCDCA dahil olmak üzere 3x ila 5x konsantrelerde hazırlayın.Görüntüleme sırasında 50 ila 100 mikrolitrelik alikotlar eklemeye hazırlanın, böylece çözeltiler slayt odasında hızlı bir şekilde karıştırılır. Şimdi, konfokal bir mikroskobun görüntüleme yazılımını başlatın ve lazeri açın. Mikroskop, 63x yağ objektifi, 37 santigrat derece inkübasyon odası ve mor 405 nanometre lazer ile donatılmalıdır.Ardından, mikroskobun ayarlarını yapın. Tek bir odak düzleminin zaman atlamalı görüntülemesi için çekim modunu XYT olarak ayarlayın. Görüntü alma hızını 20 saniyelik aralıklarla ayarlayın, böylece molalar sırasında bileşikler eklenebilir.Ayrıca, bir görev tespiti için spektral aralığı ayarladığınızdan emin olun. Transillüminasyon kullanarak hücrelere odaklanın. Ardından, yazılım kontrolünde, ilgilenilen bölgeleri tanımlamak için daireler çizin.Benzer çiçeklenme yoğunluklarına ve normal boyut ve şekle sahip hücreleri seçin. Hücrenin çevresine yakın çizmeyin. Ardından ölçüm yapmaya başlayın.Değerlerini not edin ve gök mavisi ve sitrin salkımı stabilize olana kadar ölçüm yapmaya devam edin. Çiçeklenme stabilitesi elde edildikten sonra, ölçüm sırasında seçilen zaman noktalarında 50 ila 100 mikrolitre safra asidi veya diğer bileşikler ekleyin. Pipetleme sırasında haznenin kenarından kaçının ve sıvıyı yavaşça ekleyin.Bu adımın doğru şekilde yürütülmesi deney için kritik öneme sahiptir. Yine, devam etmeden önce çiçek salkımının stabilize olmasına izin verin. Beş ila 10 mikromolar konsantrasyon için dikkatlice 100 mikrolitre GW4064 ekleyerek deneyi sonlandırın.Çiçeklenme bir kez daha stabilize olana kadar kayda devam edin. Ardından, deneyi kaydedin ve verileri bir avi dosyası olarak dışa aktarın. Eklentileri, yığınları, yığın ayırıcıyı seçerek kaydedilen avi dosyalarını görüntü J'de açın.Ardından, RLI yöneticisi penceresini açmak için düzenle, seç ve yöneticiye ekle'ye tıklayın. Ardından, seçeneği değiştirin, tümünü göster. Oval seçim aracıyla, belirli hücreleri kapsayan birkaç yatırım getirisi çizin.Hücrelerin çevresine yaklaşmayın çünkü hücreler muhtemelen bir miktar odak kayması veya göç geçirecektir. Ayrıca, arka plan sinyalini belirlemek için hücrelerin dışındaki bir alana bir daire çizin. Sensörü ifade etmeyen bir hücrenin içindeki bir alan da kullanılabilir.Şimdi, bir ROI seçin ve eklentilere ve ardından oran profilleyiciye tıklayın. Üç ekran açılacaktır. RAW, Oran ve Oran Profili.RAW penceresi, sitrin yoğunluğundaki artışı mavi bir çizgi olarak ve FRET varsa gök mavisindeki azalmayı kırmızı bir çizgi olarak gösterir. Oran penceresi, FRET'teki bir artışla artacak olan sitrin / gök mavisi oranı hakkında bilgi gösterir. Oran profili penceresi, her iki kanaldaki çiçeklenme yoğunluğu ölçümleri için değerleri gösterir.Mikroskoba özel kurulum dosyaları kullanılırsa, kanal sırası ters görünebilir. Şimdi, istatistiksel analiz için verileri oran profili penceresinden bir elektronik tabloya kopyalayın. Ardından, seçilen diğer tüm ROI'ler ve arka plan ROI'si için aynı şeyi yapmaya devam edin.Sensörü eksprese eden ve endojen safra asidi taşıyıcıları olmayan U2OS hücreleri üzerinde canlı hücre kantitatif yoğunluğuna dayalı bir FRET deneyi gerçekleştirildi. Hücreler TCDCA ile tedavi edildi. Bu, FRET'te herhangi bir değişikliğe neden olmadı.Hücreler GW4064 ile muamele edildiğinde, ortalama sitrin / gök mavisi oranı önemli ölçüde artmıştır. Sensörün diğer proteinlerle birleştirilebileceğini göstermek için, sensörü NTCP ve OST alfa-beta ile birlikte eksprese eden U2OS hücreleri tasarlandı. TCDCA ve GW4064'e eklendiğinde sitrin / gök mavisi oranında net bir artış gösterdiler.Bu videoyu izledikten sonra, safra asidi sensörünü kullanarak safra asidi dinamiklerini nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedür, ilgilendiğiniz proteinin hücre altı lokalizasyonu gibi daha fazla görüntüleme bilgisini içerecek şekilde kolayca genişletilebilir.Bu proteinin dalga boyu sensörden farklı olduğu sürece. Foto ağartmayı önlemek için, sensörü ifade eden hücreleri mümkün olduğunca karanlıkta tutmak önemlidir.

real-time-monitoring-intracellular-bile-acid-dynamics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Bu makale FRET kullanarak canlı hücreler glutamin dinamiklerini izlemek için nasıl gösterecektir. Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için düşünceler genetik olarak kodlanmış glutamin sensörler için ele alınacaktır.

Genetiği Kodlanmış Sensörleri kullanarak glutamin Akı Görüntüleme

Araçlar sınırlıdır safra asidi malabsorpsiyon teşhis ve in vivo olarak safra asidi taşınma ölçülür. Canlı hayvanların yenilikçi bir yaklaşım kombine proton (1H) artı flor (19 F) manyetik rezonans görüntüleme kullanır tarif edilmektedir; Bu yeni yöntem, klinik uygulamada safra asidi malabsorbsiyona taranması için öteleme potansiyele sahiptir.

Çok florlu Safra Asitler ve kullanma<em&gt; İn Vivo</em&gt; Manyetik Rezonans Görüntüleme Tedbir Safra Asit Ulaşım

Bu iletişim kuralı hemipteran böcekler, yaprak bitleri gibi besleme tarafından üretilen bitkilerde kalsiyum sinyalleri analiz etmek için basit bir yöntem özetliyor. GFP kalsiyum Biyoalgılayıcı GCaMP3 ile dönüştürülmüş Arabidopsis thaliana kalsiyum dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü ile gerçek zamanlı vivo içinde görüntüleme için izin verir.

Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Çok fonksiyonlu Ser/Thr kinaz AURKA'nın aktivasyonu, Thr288'deki otofosforilasyonu ile ayırt edilir. Burada, mitoz boyunca kinaz aktivasyonunu takip etmek için hızlı bir FRET protokolü ile birlikte prob mühendisliği için bazı stratejileri göstermektedir.

Aurora kinazının Gerçek Zamanlı İzlenmesi Canlı Hücrelerde Konformasyonsal FRET Biyosensörleri Kullanılarak Aktivasyon

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Bu video protokolünde, modifiye edilmiş iki fotonlu bir mikroskopta orbital izleme yöntemini kullanarak, canlı hücreler içindeki floresan olarak işaretlenmiş lizozomları - yüksek hızda ve üç boyutta - izliyoruz.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

Bu makale, uzaklaşan ve düzlem dalga görüntüleme kullanılarak yüksek kare hızlı ultrason görüntüleme ile köpek karaciğerinde HIFU ablasyonunun gerçek zamanlı izlenmesini açıklamaktadır. Fokuslu Ultrason için Harmonik Hareket Görüntüleme, ablasyonlu bölgede akustik radyasyon kuvvetinin neden olduğu yer değiştirmenin azalmasını görüntülemek için kullanılır.

Yüksek Yoğunluk Gerçek zamanlı izleme Ultrason (HIFU) Ablasyonu Odaklı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Odaklı Ultrason Harmonik Hareket Görüntüleme kullanma Köpek karaciğerler (HMIFU)

Öğrenin, genetik olarak kodlanmış FRET sensörü kullanarak hücre içi safra asidi dinamiklerini gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, metabolizma araştırmalarında etiketleme gerektirmeden canlı hücrelerde safra asidi taşımasını doğrudan görselleştirir.

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

Daha fazla video keşfet