Name: Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin, kapalı hücre kültürü sistemi kullanarak insan pluripotent ve sinir kök hücrelerini nasıl yetiştireceğinizi. Bu yöntem, maksimum sterilite ve üretilebilirlik sağlayarak klinik öncesi araştırmalarda kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Xvivo kapalı hücre kültür sistemi, özellikle Matt Freeman kullanmayı öğrenme yardım ettikleri için Biospherix kadroyla kabul etmek istiyorum; Miles &amp; Kelley İnşaat Şirketi, laboratuvar altyapısı, özellikle Russ Hughes kurma çalışmaları için Inc.&#39;in personel; laboratuvar şeklini, özellikle Adam Lukhard ve Devin Hugie koordine çalışmaları için Tesisleri ve Destek Hizmetleri Orange County bölümünün Çocuk Hastanesi personeli; veri yönetimi altyapısı ve uzaktan erişim, özellikle Viet Tran kurma yardım ettikleri için Bilgi Sistemleri Orange County bölümünün Çocuk Hastanesi personeli; Projenin, özellikle Dr. Maria minon ve Brent Dethlefs onların uzun süredir destek Orange County Üst Yönetim Ekibi Çocuk Hastanesi. Bu eser Çocuk Orange County Hospital ve Rejeneratif tıp için California Institute tarafından finanse edildiPHS hibe TR3-05476 üzerinden e. Tüm yazarlar, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

geri odasına mikroskop ve bölmeyi işlenmesine inkübatör hareket olarak CPF içinde yetiştirilen hücreler, oksijen veya karbondioksit konsantrasyonları herhangi bir değişiklik görüyoruz. Her bölme koşullar hücre kuluçka makinesinden çıkarılır önce hücreler tutulduğu özellikle inkübatör eşleştirilir kritiktir. aparat içindeki atmosfer sürekli HEPA filtreli ve oksijen ve karbondioksit konsantrasyonları ile ilgili özelleştirilebilir. Hücreler PSC&#39;ler veya NSC&#39;lerde,% 5 ve sırasıyla% 9, standart konsantrasyonlarda yetiştirilen olabilir; ya da seçenek konsantrasyonlarının farklı hücre tipleri için ya da belirli deneyler için seçilebilir. Bu nedenle, cihaz bir tıbbi dereceli oksijen, karbon dioksit ve azot ile (Şekil 4) sabit kaynakları ile birlikte verilir. Bu gazların tamamı üç sabit malzemeleri temin gaz özgü manifoldu sistemleri tarafından sağlanır. Cihaz, aynı zamanda bir kalibrasyon gazı karışımı, aşağıdakilerden oluşan besleniroksijen içinde% 10 (% 0.01 ±) karbon dioksit. manifoldu sistemleri, hücre üretim tesisi dışında yerleştirilmiştir ve gazlar tavan üzerinden tesis içine taşınıyor edilir. Kalibrasyon gazı tesisi içinde yer alır. Cihaz ayrıca da tavan üzerinden, ev vakumu ile birlikte verilir. gönderme birimleri bir elektronik izleme sistemini kullanarak ve kablosuz, tüm manifoldların çıktı basınçları sürekli izlenir. Herhangi bir basınç aralığında düşüyor durumunda, hücre üretim tesisi operatörleri otomatik olarak telefon ve uygun önlemler alınabilir şekilde bildirilir. aparatın güç gereksinimleri tavandan inen altı adanmış 120 V devreleri tarafından karşılandı ve sürekli tedarik sağlamak için hastanenin yedekleme jeneratörler bağlanır. aparatın operasyon bir kesintisiz güç kaynağı ile güçlendirilmiş bir PC tabanlı bir bilgisayarda yazılım üzerinden kontrol edilir. Bu güç ve bilgisayar düzenlemeleritemin etmesi, sürekli bile kamu gücü sistemi arızası durumunda sistem fonksiyonları. Aparatı kontrol yazılımı oksijen ve karbondioksit konsantrasyonları kontrolü yanı sıra sıcaklık, nem, ve oda basınçlar için izin veren bir kullanıcı dostu grafik arayüzü (Şekil 1). Tüm bu parametrelerin değerleri sürekli tüm cihaz parametreleri çalışan kaydını sağlamak için kaydedilmektedir. Bu veriler, bütünlüğünü korumak için her gece bir uzak sunucu üzerine yedeklenir. bilgisayar ve yazılım değerlendirmek ve / veya herhangi bir parametreyi değiştirmek için yönetici kullanıcılar tarafından uzaktan erişilebilir. Ayrıca, bilgisayar ve yazılım aygıtı parametrelerinin interaktif değerlendirmesine imkân ve yerel kullanıcılar ile sorun giderme, uzaktan erişilebilir. Ek bir alarm gönderme birimi cihazına bağlı hücre üretim tesisi operatörleri düzeneğin bir dışı hız durumunu belirten bildirilmesi gibi. Uzaktan erişim cKapasiteler giriş ve out-of-aralık durumunun özelliklerini değerlendirilmesi izin verir. Cihaz modüler bir sistem olarak hem makro ve mikro anlamda tasarlanmıştır. Bu kuluçka ve işlem odaları gibi tek bir hücre kültürü modüller birbirlerine göre olan boyutlar ve ihtiyaçları söz konusu olduğu gibi, hem de kendi düzeninde özelleştirilebilir. Ayrıca, bireysel modüllerin kontrol fonksiyonlarının çoğunu kendileri modüler böyle bireysel atmosferik gaz kontrolörleri, örneğin, kolayca sisteme önemli bir kesinti olmadan değiştirilebilir olmasıdır. bu mikro görselleştirme ve hücre kültürlerinin manipülasyonu için bir gibi özel işlem odaları, sisteme kolayca adapte edilir. Her iki faz-kontrast ve floresan mikroskop hücreleri canlı lekeli böylece sistemin (Şekil 6) içindedir ve koloniler t içinde aynı atmosferik şartlarda disseke edilebilirO Kuluçka makineleri. Işleme odasının yan duvarlarında mühürlü halkalardan geçirerek kabloların Yönlendirme güç kaynakları ve bilgisayarlar genellikle bir arabaya (Şekil 6) üzerine, aparatın dışında tutulması gibi donanımları tanır. Hücre üretim tesisinde işleme odaları geleneksel BSC&#39;ler farklı bir hava akımı desen var. Geleneksel BSC&#39;ler olarak, hava akımı merkezi havalandırma çıkışının aşağı akar ve daha sonra kabinenin kat ön ve arka kısmında iki farklı emme menfezleri tarafından alınan iki ayrı akım, ayrılır. Buna karşılık, CPF tavan ön kısmında tek delik vardır. Hava aşağı ve daha sonra bir giriş menfezi içine yukarı doğru çekilir bölme, arkasına doğru akar. FKP doğal, çok temiz olmasına rağmen, bu eşsiz hava akımı desen teknisyenleri biraz kontaminasyon riskini azaltmak için kendi tekniğini ayarlamak zorunda olduğu anlamına gelir. geleneksel BSC, bir laboratuar işçi s gibiAçık hücre kültür plakaları ve medya şişeleri yukarı ellerini koyarak hould kaçının. Ancak, yukarı olan yönü CPF değiştirilmiştir Hücre üretim tesisi laboratuvarı kendisi oldukça standart ve -20 ° C derin dondurucuda ile donatılmış olarak geliyor, -80 ° C derin dondurucuda, 4 ° C buzdolabı, bir santrifüj ve su banyosu. Laboratuvar de uygun eller serbest kullanım için ayak kontrolleri ile bir lavabo vardır. fonksiyonel klinik hücre üretim tesisi haline Bu laboratuvarda için, ancak, birkaç ek modifikasyonlar hala yapılmalıdır. Birincisi, cihaz kendisi uçucu organik bileşikler, partikülleri ve dekontaminasyon için kullanılan klor dioksit konsantrasyonlarının izlenmesi kapasitesine sahip yükseltilmiş olması gerekir. İkinci olarak, bir FACS makinesi ihtiva eden bir prosesleme gözü kapatıldı ve bir tampon modülü ile cihazının geri kalanına bağlanabilir. Bu hücre sıralama ve tr saflaştırılması için sağlayacakUygun çevre koşullarında ansplantable hücre popülasyonları. Son olarak, tüm cihaz yumuşak bir duvar temiz oda içinde muhafaza edilmelidir. Bu aparat 5 Standardizasyon (ISO) sınıfı 8 çevre için Uluslararası Örgütü sağlar. CPF yüksek sterilite ve bilgisayar kontrollü doğası hücre bazlı tedavi ve iyi üretim süreçleri ile gelecekteki uygulamalar için ideal bir sistem yapar. kirlenme riski büyük oranda hafifletilmiş, ama daha da önemlisi, hücre genişleme koşulları otomatik olarak kaydedilir ve bilgisayar sistemi tarafından arşivlenir. gaz konsantrasyonları, sıcaklık, nem, ve sisteme erişim tüm olaylarda sapmalar titizlikle belgelenmiştir. Ürün kalitesi sorunlarını araştıran bu ölçüde yardımcı olabilir. Ancak, yine de sınırlamalar vardır. Her türlü reaktifler ve sarf malzemeleri kullanımı (örneğin, medya bileşenleri, pipetler, plakalar) ayrı olarak belgelendirilmelidir. Eklemekitionally, Cpf izleme sistemi tarafından belgelenmiş değişkenlere tamamen ilgisiz olan ortaya çıkabilir (insan hatası birçok formları dahil) potansiyel sorunlar çok sayıda vardır. Böylece, yüksek eğitimli personel ve görevleri ayrıntılı manuel belgeler ihtiyacı yerinde kalır.

Standart kök hücre kültürü teknikleri, hücreler üzerinde aşırı stres oluşturan ve hücreleri kabul edilemez kontaminasyon risklerine maruz bırakan çeşitli çevresel kısıtlamalardan muzdariptir. Hücrelerin standart hücre kültürü koşulları altında dayanabileceği stresler arasında, karbondioksit ve oksijen konsantrasyonlarındaki ani değişiklikler vardır3,4. Bu, hücreler inkübatörden biyogüvenlik kabinine ve/veya mikroskoba taşındığında meydana gelir ve bu hücreler için optimal olmayabilir. Önceki çalışmalar, hipoksik koşullarda hem pluripotent hem de nöral kök hücrelerin kültürlenmesinin avantajlarını doğrulamıştır4,11 ve en iyi sonuçlar için bu koşulların sürekli olması gerekir. Ayrıca, laboratuvar ortamı ve personel, kültür ve manipülasyonlarının hemen hemen her adımında hücrelere etki ettiğinden, hücresel kontaminasyon riskleri daha yüksektir. Geleneksel temiz odalar, kontaminasyon risklerini büyük ölçüde azaltmak için etkili bir yöntem içerir, ancak pahalıdırlar, büyük bir ayak izine sahiptirler ve karbondioksit ve oksijen konsantrasyonları ile ilgili stres faktörlerini ele alamazlar. 
Hem kontaminasyon risklerini hem de gaz konsantrasyonlarını ele alabilen ve cGMP kriterlerini9 karşılamaya uygun hale getirilebilen bir hücre üretim tesisi, temel bilim araştırmalarının yanı sıra klinik uygulamalar için de yüksek kaliteli hücreler sağlar1,6,7. Böyle bir hücre üretim tesisi, asgari olarak aşağıdaki bileşenlerden oluşur: hücre kültürlerinin beslenmesi ve manipülasyonu için ısıtılmış bir çalışma alanı görevi gören bir işlem odası; reaktiflerin, tüplerin ve aletlerin ilk sterilizasyonu için bir laminer akış başlığı; davlumbaz ve işlem odası arasında iki tamponlama hava kilidi odası; proses odasından erişilebilen iki hücre kültürü inkübatörü; işlem odasına bitişik bir mikroskop odası; ve son olarak, bu modüller içindeki koşulları ayarlamak ve izlemek için bilgisayar yazılımı. Bu temel altyapıyı kullanarak, pluripotent kök hücrelerin ve multipotent nöral kök hücrelerin standart beslenmesi ve pasajlanması gibi çok çeşitli görevlerin yanı sıra Sendai virüsü tabanlı yeniden programlama, in vitro migrasyon çalışmaları ve elektrofizyolojik karakterizasyon için nöral kök hücrelerin farklılaşması gibi daha özel yöntemler gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo Sistemi</td><td>Biospherix</td><td>özel yapım</td><td></td></tr> <tr><td>Xvivo Yazılım</td><td>Biospherix</td><td>sürüm io.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 Manifold</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Manifoldu</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2</td> DP21 kamera ve floresan ile Manifold <td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 Glutamax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Ek</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Sodyum</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Büyüme Faktörü 2</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank's tabanlı Hücre ayrışması Tampon</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü R</td><td>& D Sistemleri</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antikor</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antikor</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antikor</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Takviyesi</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sarf Malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serolojik pipet</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serolojik pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serolojik pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serolojik pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serolojik pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 şişesi</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 şişesi</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 & mikro; l pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; l pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1.000 pipet ucu</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır Suyu</td><td>Clorox A714239</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

temel ve klinik öncesi araştırma bir kapalı hücre kültürü sistemi İnsan pluripotent ve sinir kök hücre kültürleme

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Bu makale, temel ve klinik öncesi araştırmalar için özel olarak üretilmiş, ticari olarak temin edilebilen kapalı bir hücre kültürü sisteminin nasıl kullanılacağını açıklamaktadır. Biyogüvenlik kabinleri (BSC'ler) ve inkübatörler, temel ve klinik öncesi araştırmalar için hücre hatlarının kültürlenmesi ve genişletilmesi için uzun süredir standart olmuştur. Bununla birlikte, birçok kök hücre laboratuvarının odak noktası temel araştırmadan klinik çeviriye kaydıkça, hücre kültür sisteminin ek gereksinimlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Tüm süreçler iyi bir şekilde belgelenmeli ve sterilite ve tekrarlanabilirlik için istisnai gereksinimlere sahip olmalıdır. Geleneksel inkübatörlerde, gaz konsantrasyonları ve sıcaklıklar, hücreler besleme, geçiş veya diğer manipülasyonlar için çıkarıldığında büyük ölçüde dalgalanır. Bu tür kesintiler, cGMP ve GLP yönergeleri için standart olmayan bir ortama katkıda bulunur. Bu kesintiler, özellikle hücreler terapötik amaçlar için kullanıldığında en aza indirilmelidir. Standart BSC ve inkübatör sisteminden kapalı bir sisteme geçme motivasyonu, bu tür kesintilerin ihmal edilebilir hale getirilebilmesidir. Kapalı sistemler, hücre kültürlerini beslemek ve manipüle etmek ve bunları sıcaklık ve gaz konsantrasyonlarının tutarlı olduğu kontrollü bir ortamda tutmak için bir çalışma alanı sağlar. Bu şekilde, pluripotent ve multipotent kök hücreler, türetildikleri andan tedavide nihai kullanımlarına kadar optimum sağlıkta tutulabilir.

Bu el yazması bazı ayrıntılı bir hücre üretim tesisi ve kapalı bir sistem içinde hücrelerin kültürlenmesi benzersiz özelliklerini açıklar. Hücre üretim tesisi toplu küçük bir ayak izi vardır ve kolayca bir 6 x 7,5 m 2 Oda (Şekil 2) içinde muhafaza edilebilir bir ısmarlama, Kapalı, hücre kültürü cihazı içermektedir. Hiçbir zaman laboratuar personeli veya ortama maruz kalan cihaz içinde hücrelerdir. Cihaz birkaç modülden oluşmaktadır: bir süreç odasını, bir laminer akış kaput, kaput ve süreç odasının, iki hücre kültür kuluçka merkezleri ve süreç odasına bitişik bir mikroskop odası arasında 2 tamponlama airlock odaları (Şekil 3). Sistem çevresel değişkenler (Şekil 1) kontrol ve izlenmesine olanak tanıyacak yazılım tarafından kontrol edilir. Bu yazılımı çalıştıran bilgisayar, bir kesintisiz güç kaynağı üzerindedir. Gazlar th besleniroksijen, azot ve karbon dioksit (Şekil 4) için manifoldlar bir dizi e sistemi. Etkin bir set ve bir yedek kümesi - aygıt için Gazlar tankların iki takım her vardır manifoldu sistemleri tarafından sağlanır. Aktif seti aşağı çekildiğinde, manifoldu otomatik olarak yedek ayarlanır ve personel sipariş yedek tankları geçer. güç bir yedek jeneratör sistemi üzerindedir. Pluripotent ve nöral kök hücreler yeni ekipman doğasında ekledi komplikasyonları olan, daha önce geliştirilen protokoller 9 kullanarak bu tesiste hipoksik koşullarda yetiştirilebilir. Pluripotent kök hücreler daha sonra izole edilir ve genişletilmiş tam transfekte koloniler, tespit etmek pluripotense-spesifik antikorlar kullanılarak, Sendai virüsü kullanılarak elde edilebilir. (Şekil 5A ve B), bu iPSCs kaynaktan, nöral kök hücreleri ve nöronların çifte SMAD inhibisyonu kullanılarak elde ve bunların fenotipi USI doğrulanabilir<html> ng NSC-özgü antikorlar (Şekil 5C ve D). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Hücre Üretim Tesisi için Şekil 1. Grafik Arayüzü. (A) CPF grafiksel gösterimi varsayılan ekran ve (Şekil 1 2F) Şekil 3. Tampon Modülü 1 üzerinde fare bir tıklama gösterilen çizim CAD maçları O 2 değerleri (Şekil 3&#39;te 3) işlem odasını eşleşecek şekilde ayarlanır kendi kontrol ekranı (B) açılır. Benzer şekilde, Süreç tıklayarak Odası veya İnkübatör 1 değerleri uygun şekilde değiştirilebilir veya izlenebilir kendi kontrol ekranlarında (sırasıyla C ve D), getirir.<html> rYer = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Hücre Üretim Tesisi 2. Şekil. (A) bir ön sağ görünümden görüldüğü gibi sistem. sağa mikroskop aksesuarları ve bilgisayar ile tavana güç ve gaz bağlantılarını ve arabası unutmayın. (B) sağda görülen tampon modülleri erişim kapıları ile laminer akış kaputu. Arkada görülen (C) iki indikatörler (siyah kapılar) ile işlem odası. (D) sistemin sağ tarafında üzerinden bir görünüm mikroskop gösteren ve mesafe görülen tampon odalarına kapılar izlemek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Hücre Üretim Tesisi Şekil 3. A CAD Drawing. Cihazı giren tüm öğeler ilk laminer akış kaputu kurutulmuş alkol ve hava ile sildi (1). Öğeler sonra UCPC modülüne geçirilmeden önce ön tampon modülü (2F) uygun atmosfere geçiş, ya da Proses Odası (3). Hücreler, iki kuluçka (4, 5) &#39;de kültürlenmiştir. Canlı hücre boyama, koloni toplama, genel hücresel morfoloji ve göç analizi değerlendirilmesi UPC modülünde yer alan, ya da Mikroskop Odası (6). Son olarak, atık arka tampon modülü (2R) aracılığıyla sisteme çıkar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Gazların ve Güç Şekil 4. kaynakları. (A) laboratuvarın tüm inkübatör malzemeleri olarak CO 2 manifoldu 4 x 4 kurulum. (B) O 2 manifoldu 2 x 2 kurulum ve malzemeler sadece hücre üretim tesisidir. Sistem için azot aynı zamanda otomatik olarak (sol alt) cryofreezers doldurur (sağda) bir sıvı azot manifolduna bağlı (sadece çıkış işareti altında, C) bir buharlaştırıcı oluşturulur. Manifold 160 litre sıvı azot tank iki çift beslenir 2 x 2 ayarlanır. CO2, O2 ve N2 durdurucular (d) &#39;tavandan temin edilmektedir. Ev tipi vakum, aynı zamanda bu konumda temin edilir. sisteme güç kaynağı elektrik kabloları bir çift sadece tedarik Gaz durdurucular arkasında gördüm.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Sendai virüsü ile Hipokside türetilmiş Şekil 5. pluripotent kök hücrelerin (A). SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (terminolojisi Stover et al. 9 bulunur), faz kontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs AF-594-etiketli Tra-1-60, 1 canlı boyanmış: Medyada 100 seyreltme. Tüm iPSCs Sendai virüsü ile% 5 O 2 hücre üretim tesisinde kalıt. Oda slaytlar% 5 O 2 yetiştirilen SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC türetilmiş NSC&#39;lerde (C) Faz kontrast. Hücreler daha sonra% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve anti-insan Nestin birincil antikor ile boyanmış ve Alex-488 ikincil antikor edildi. Tüm ölçek çubukları 100 altındadır1;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

İşte pluripotent kök hücreleri (PSC) ve nöral kök hücreleri (NSC), geleneksel biyogüvenlik kabini ve inkübatörünün yerini alarak maksimum sterilite ve tekrarlanabilirliğe izin veren kapalı bir hücre kültürü sisteminde büyütmek için bir protokol. Bu ekipman, klinik iyi üretim uygulaması (cGMP) ve klinik iyi laboratuvar uygulaması (cGLP) yönergelerine uygundur.

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Bu ekipmanı kullanmanın genel amacı, kök hücreleri tanımlanmış atmosferik koşullar altında maksimum sterilite ile büyütmektir. Bugün, hücre kültürü parametreleri üzerinde hassas bir kontrol sağlayan kapalı bir hücre kültürü tesisi kullanımını göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu tesisi multipotent kök hücrelerin ve pluripotent kök hücrelerin kültürü için kullanıyoruz.Bu yöntemin temel avantajı, hücrelerin işlem aşamasında nerede olduklarına bakılmaksızın sabit bir ortama maruz kalmalarıdır. Hücrelerin manipüle edilmesi, inkübatörde tutulması veya mikroskop altında incelenmesi fark etmeksizin, döngü boyunca oksijen, CO2 ve sıcaklığa maruz kalma durumları sabittir. Prosedürü, laboratuvarımdaki uzman bilim insanı Alexander Stover uygulamalı olarak gösterecektir.Bu prosedüre başlamak için, gaz konsantrasyonunu ayarlamak üzere bir modüle tıklayın. Mevcut ayarları gösteren yeni pencerede, Ayar Noktası (Setpoint) altındaki mevcut oksijen ayar noktası değerine tıklayın ve bu modül için gereken oksijen konsantrasyonunu girin. Ardından, ayar noktasını onaylamak için yeşil onay işaretine tıklayın.Bu işlemi karbondioksit için tekrarlayın ve sadece oksijen ayarı yapılabilen tampon odaları dışındaki tüm modüller için %5 karbondioksit set değeri girin. Ardından, yeni set değerlerine ulaşıldığından emin olmak için Proses Değerleri olarak etiketlenen mevcut gaz konsantrasyonlarını izleyin. Sonrasında, tüm modüllerin gaz set değerlerini uygun değerlere ayarlayın.Birbirine maruz bırakılacak odacıkların karbondioksit ve oksijen seviyelerini eşleştirin. Örneğin, hücreleri %5 oksijende büyüten bir inkübatörü açmadan önce işlem odasını %5 oksijene ayarlayın. Ayrıca, işlem odasına malzeme eklemek için kullanılan tampon odasını da %5 oksijene ayarlayın.Ardından, gaz ayarlamaları için kullanılan aynı ekranı kullanarak işlem odasının sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın. Sonrasında, işlem odası taban sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın. Her inkübatörün altındaki inkübasyon modülü bankalarına tıklayın ve bankaların sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.Laminar akışlı kabinde, sisteme girecek tüm malzemeleri %70 etanol ile püskürterek temizleyin ve kurumalarını bekleyin. Herhangi bir erleni veya hücre plağını, %70 etanol ile doyurulmuş steril bir gazlı bezle nazikçe silin. Ardından, tampon odasının hem dış hem de iç kapılarının güvenli bir şekilde kapalı olduğundan emin olun; daha sonra dış kapıyı açın, malzemeleri içeri yerleştirin ve kapıyı kapatın.Yazılımı kullanarak tampon modülünü seçin ve Dilution Factor sekmesine tıklayın. Log Factor kutusuna bir girin ve ardından başlat'a tıklayın. Grafik arayüzde Dilution Factor ibaresi yanıp sönmeyi bıraktığında, tampon bölmesinin iç kapısını açın ve malzemeleri işlem bölmesine aktarın.İşlem haznesinden ürünleri çıkarmak için öncelikle tampon haznesinin bir Seyreltme Faktörüne tabi olduğundan emin olun. Ardından, iç kapıyı açın, çıkarılacak ürünleri içeri yerleştirin ve kapıyı kapatın. Bundan sonra, dış kapıyı açın ve ürünleri çıkarın.Her bir inkübatörün tabanındaki su tepsisine üç adet petri kabı yerleştirin. Bu kapları steril su ile doldurun ve inkübatördeki bağıl nem set değerinin korunması için kritik olan bu kaplardaki su seviyesini muhafaza edin. Grafik arayüz üzerinden inkübatöre tıklayın.Ardından, set değerinin altındaki bağıl nem için mevcut değere tıklayın ve 85% girin. Daha sonra, bu değeri kabul etmek için yeşil onay işaretine tıklayın. Sonrasında, tampon odalarını, işlem odasını ve bir inkübatörü, eklenen hücre tipinin gerektirdiği gaz set değerlerine göre ayarlayın. İşlem odasının yüzeyini steril gazlı bez ve benzalkonyum klorür bazlı bir ürün gibi yanıcı olmayan bir dezenfektan ile temizleyin.Ardından, eldivenleri ve kapı kolları gibi sık dokunulan yüzeyleri temizleyin. Sonrasında, Laminar Akış Kabini'nin yüzeyini ve tampon oda bölümünü %70 etanol ile temizleyip kurumaya bırakın. Bundan sonra, hücrelerin bulunduğu balonu veya plakayı kabine yerleştirin ve dış yüzeyini etanolle doyurulmuş steril bir gazlı bezle kısaca silin.Ardından, flaskı veya plakayı tampon haznesine yerleştirin ve bir Dilüsyon Faktörü (Dilution Factor) çalıştırın. İşlem tamamlandığında, flaskı veya plakayı derhal uygun inkübatöre aktarın. İnkübatör, işlem haznesinin arkasında yer aldığından, hücrelerin yerleştirilmesi için bir rafı işlem haznesine doğru çekin ve inkübatör kapılarını gereksiz yere uzun süreler boyunca açmaktan kaçının.Bu adımda, hücre kültür ortamını hazırlayın. Ortam kabının kapağını 20 dakika boyunca hafifçe açık bırakarak, ortamın sistemdeki karbondioksit ve oksijen seviyeleriyle dengelenmesini sağlayın. Ardından, kuyucuklardaki eski ortamı uzaklaştırın.Pluripotent kök hücreler için, besleme işlemi sırasında kurumayı önlemek amacıyla, geride az miktarda eski ortam kalacak şekilde eski ortamın neredeyse tamamını uzaklaştırın. Nöral kök hücreler için, eski ortamın yarısını uzaklaştırın. Ardından, hücre kültürü plakalarına taze ortam ekleyin ve plakaları tekrar kendilerine ayrılmış inkübatöre yerleştirin.Burada iPSC'lerin bir görüntüsü gösterilmiştir. Burada, besiyerinde 1:100 dilüsyonda AF594 ile işaretlenmiş Trial 160 ile canlı boyanmış iPSC'ler yer almaktadır. Tüm iPSC'ler, hücre üretim tesisinde %5 oksijen altında Sendai virüsü ile transduse edilmiştir.Burada, oda slaytlarında %5 oksijende büyütülen iPSC türevli nöral kök hücrelerin faz-kontrast görüntüsü yer almaktadır. Hücreler daha sonra %4 paraformaldehit ile fikse edilmiş ve Anti-Human Nestin primer antikoru ile Alexa Fluor 488 sekonder antikoru ile boyanmıştır. Bu teknik setine hakim olunduğunda, uygun şekilde uygulandığı takdirde işlem iki saatte tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, başlamadan önce gaz konsantrasyonlarının doğru şekilde ayarlandığını hatırlamak önemlidir. Prosedürün ardından; hipoksinin pluripotentlik veya multipotentlik üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla yeniden programlama ve diferansiyasyon gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların pediatrik nörodejeneratif bozuklukların tedavisi için klinik hücre üretimini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

, In vitro olarak insan nöral kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) manipüle etme yeteneği, tedavi amaçlı hücre nakli olarak kendi programını araştırmak için insan sinir gelişimi ve keşfetmek için sağlar. Bu protokol, insan kök hücre araştırmalarının giderek tekrarlanabilirlik umuduyla kültür ve Pasajlanması hNSPCs bir yöntem sunmaktadır.

İnsan Nöral Kök Hücreler Pasajlanması

Atılır insan fetal kortikal doku sinir kök hücrelerin izolasyonu ve kültürü üzerinde basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Bilinen insan nörolojik bozukluklar türetilen Kültürler farmakolojik etkinliğini değerlendirmek için bir platform sağlamak gibi, hücresel ve moleküler patolojik süreçleri karakterizasyonu için kullanılabilir.

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Video, nöronal kök hücrelerin büyümesi ve sürdürülmesi için bir hücre kültürü iş istasyonunda kontrollü bir ortamın sürdürülmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu prosedürler, oda koşullarının ayarlanmasını, temizleme protokollerini ve ortam hazırlığını içerir, böylece maksimum sterilite ve tekrarlanabilirliğin korunmasını ve geleneksel yöntemlerin değiştirilmesini içerir.

Bir Hücre Üretim Tesisinde Nöronal Kök Hücre Kültürlerinin İşlenmesi

Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Bu protokol, ek eksojen takviye veya hPSC'ye özgü sentetik substrat olmaksızın jelatin kaplı bir tabakta yalnızca insan plasentasından türetilen şartlandırılmış ortamı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini (hPSC'ler) çoğaltmak için basit ve etkili bir yol sağlar.

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürlerinin otomasyonu ve otomatik görüntüleme ve analiz ile uyumlu nöronal farklılasyonlar gösteriyoruz.

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Bu makalede, bir tezgah üstü 3D süspansiyon biyoreaktöründe insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronların üretimi için bir protokol açıklanmaktadır.

Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Burada, otomatik bir hücre kültürü sistemi için bir protokol sunuyoruz. Bu otomatik kültür sistemi, işçiliği azaltır ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin bakımından, çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaya kadar, indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin işlenmesine aşina olmayan araştırmacılar da dahil olmak üzere kullanıcılara fayda sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

Öğrenin, kapalı hücre kültürü sistemi kullanarak insan pluripotent ve sinir kök hücrelerini nasıl yetiştireceğinizi. Bu yöntem, maksimum sterilite ve üretilebilirlik sağlayarak klinik öncesi araştırmalarda kullanılabilir.

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

Daha fazla video keşfet