Name: Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Öğrenin, bitki hücre duvarı heteroksilanlarının indirgen uç ve iç bölge glikozil dizilerini enzimatik hidroliz, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans teknikleriyle karakterize etme yöntemini. Bu entegre yaklaşım, polisakkarit yapısının çevresel streslere yanıtını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje, Commonwealth Bilimsel ve Araştırma Örgütü Amiral Gemisi İşbirlikçi Araştırma Programı'ndan sağlanan fonlarla desteklenmiştir ve Food Futures Flagship aracılığıyla Yüksek Lifli Tahıl Kümesine sağlanmıştır. AB ayrıca, Avustralya Araştırma Konseyi'nin (ARC) ARC Bitki Hücre Duvarlarında Mükemmeliyet Merkezi'ne (CE110001007) verdiği desteği de kabul eder.

2-aminobenzamid W-sol axs Azaltılması sonu 1. Etiketleme (RE) Şeker Kalıntı (2AB) <ol><li> Fluoresan türevleri polisakarit omurga zincirlerinin indirgeyici uçları dönüştürmek için 65 ° C &#39;de 2 saat süre ile, 1 M NaBH3CN (sodyum siyanoborohidrid) (pH 5.5) varlığında, 2AB (0.2 M) W-Sol AXS inkübe edin. DİKKAT: su ile temas halinde olduğunda, NaBH3CN zehirli siyanür gazı serbest aşağıdaki adımı davlumbaz yapılmalıdır. <ol><li> NaBH3CN (62.8 mg), tartılır ve 1 M NaBH3CN çözeltisi hazırlamak için, su içinde bir mikrosantrifüj tüpü (1.5 mL) içinde (1 mi) çözülür. 65 ° C&#39;de ısıtma ile 1 M NaBH3CN çözeltisi (1 mi) içinde 2AB ayıracı (27.2 mg) çözündürülür &#160; ° C% 10 asetik asit ile pH 5.5&#39;e Reaksiyon karışımı (0.2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) pH&#39;ının ayarlanması vb. </li><li> W, böylece reaksiyon karışımının, 200 ul (0.2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) ilavebir kapak ile bir cam tüp içinde l AXS (1 mg) ve bir girdap şeklinde karıştırıcı kullanılarak karıştırılır. 65 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe &#160; Davlumbaz ° C. Oda sıcaklığına soğutun ve süspansiyon 4 cilt ekleyin. mutlak etanol. </li><li> Bir soğuk depo polisakkaritleri çöktürmek için (4 ° C) O / N süspansiyon yerleştirin. </li><li> Santrifüj (1,500 xg, 10 dakika, RT) süpernatant kaldırmak için. Her yıkama arasında santrifüj, mutlak etanol (4 x), aseton (1 x) ve metanol (1 x) ile iyice pelet yıkayın. 40 ° CO / N vakum kuru. Not: aşın yıkama ayrıca artık 2AB kaldırır. </li></ol></li></ol> 2 AB etiketlenmiş gelen Xylo-oligosakkaritler 2. Nesil W-sol axs <ol><li> 2AB, bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir sodyum asetat tamponunun 500 ul (100 mM, pH 5) (1.5 mi) içinde B-Sol AXS (1 mg) etiketli içinde çözülür. endoksilanazın 4 adet (GH 11, [M1]) ekleyin ve 37 ° C&#39;de inkübe &#160; 16 saat ° C. </li><li> Reaksiyon Mixt ısıtılarak enzim etkinliğini yokbir kaynar su banyosu içinde 10 dakika için ure. Oda sıcaklığına soğutun ve süspansiyon bir kap ile bir cam tüpe aktarın. 4 vols ekleyin. mutlak etanol ve bir soğuk depoda süspansiyon yer (4 ° C) O / N herhangi bir sindirilmemiş polisakaritler çökeltildi. </li><li> Santrifüj (1,500 x g, 10 dakika, RT) sindirilmeyen polisakaridleri (topak) ayrılması ve endoksilanaz (süpernatant) ksilo-oligosakkaritler sağladı. Temiz bir cam tüp içine süpernatant süzün ve sıcak su banyosu (40 ° C) içine yerleştirin. </li><li> bir uç noktası hacminin (~ 500 | il) azot gazı akışı altında etanol buharlaştırın. 4 saat -80 ° C&#39;de süpernatan dondurun ve ksilo-oligosakkaritler kurtarmak için bir dondurarak kurutucu içinde dondurulmuş süpernatant kurutun. </li></ol> KOH-sol axs ve 2AB Etiketleme gelen Xylo-oligosakkaritler 3. Nesil <ol><li> (Bölümlerde 2.1-2.4) yukarıda tarif edildiği gibi ksilo-oligosakkaritler oluşturmak için endoksilanazın Koh-Sol AXS (GH, 11 [M1]) tedavisinde. </li><li> endox tedaviylanase (bölümler 1.1.1-1.1.2) yukarıda tarif edildiği gibi 2AB, reaksiyon karışımı (0.2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) ile KOH-sol AXS gelen ksilo-oligosakkaritler sağladı. </li><li> Temiz bir cam tüp içine süpernatant süzün ve sıcak su banyosu (40 ° C) içine yerleştirin. bir uç noktası hacminin (~ 500 | il) azot gazı akışı altında etanol buharlaştırın. 4 saat -80 ° C&#39;de süpernatan dondurun ve ksilo-oligosakkaritler kurtarmak için bir dondurarak kurutucu içinde dondurulmuş süpernatant kurutun. </li></ol> 4. MALDI-TOF-MS <ol><li> MALDI-matris Çözüm hazırlanması <ol><li> bir tüp (MALDI-matris solüsyon) içinde% 0.1 formik asit ihtiva eden% 50 asetonitril (500 mi) 2, 5-dihydroxbenzoic asit (DHB) küçük bir kepçe ekleyin. hızla erir eğer, DHB&#39;nin başka bir küçük kepçe ekleyin, bir vorteks ile karıştırın. Not: MALDI-matris solüsyon İdeal konsantrasyonu 10 mg olduğunu / ul -1. </li></ol></li><li> MALDI hedef Plate hazırlanması <ol><li> aqueo yatırınBize (yerli) örnekleri (5-10 ug) oligosakarit bir MALDI hedef plaka üzerine (W-sol ve / veya KOH-sol). Ayrı bir ucunu kullanarak 0.3 ul MALDI-matris çözümü ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Karışım, oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Not: Düzgün kurutulmuş numuneler nokta merkezine doğru işaret uzun iğne biçimli kristaller oluşmalıdır. yatırma yapışkan ve / veya yağlı olan numune, çok konsantre veya tuzlar oluşur olabilir, ya bu depozitlerin iyi spektrumlarını oluşturmak için olası değildir ve örnek daha arındırılmalıdır. </li><li> MS kaynağına hedef plakası tanıtılması ve pozitif (+ İVE) iyon modunda çalışır. iyon kaynağı 1&#39;de 19.0 kV ve iyon kaynağında 2&#39;de 16.3 kV hızlandırıcı voltajını ayarlamak daha fazla% 70 lazer gücünü ayarlayın. MALDI hedef plaka üzerinde örnek nokta seçin ve lazer çekim başlarsınız tıklatın. Not: Hedef tüm alanlarda sinyalleri vermez. Belirli bir nokta, sadece ya nedeniyle birkaç lazer çekimleri için bir sinyal verecekÖrnek / matriks karışımı ya da kristal özelliklerinin azalması. <ol><li> tatmin edici sinyal-gürültü elde etmek için satın alma ve ortalama sırasında yaklaşık 200 rastgele spektrumları hedefin farklı alanlarına lazer taşıyın. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. ESI-QTOF-MS <ol><li> Bir RP ile bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) çevrimiçi kromatografik ayırma ile bir uçuş (QTOF) MS aygıtının bir dört kat time ile birlikte nano HPLC kullanılarak endoksilanaz oluşturulan oligosakaritler (yerli) analiz C-18 kolonu (75 mm x 150 mm, 3.5 um kordon boyut). <ol><li> Bir şişenin içine endoksilanaz oluşturulan sulu oligosakkaritler karışımı aktarın ve HPLC oto örnekleyici içine yerleştirin. 60 dakika boyunca, sırasıyla asetonitril mobil fazlar,% 0.1 (h / h) su içinde formik asit ve% 0.1 (v / v) formik asit ile% 5-80 arasında sıyırma derecesi, program. </li><li> 0.2 ul / dk akış hızı ayarlanır. tarama aralığı olumlu-iyon modu ayarlamaperde gazı 10, GS1 4, kaynak sıcaklığı 100 ° C, iyon püskürtme gerilimi 2300 V ve potansiyel 50 de-kümeleme: 300-1,600 m / z ve aşağıdaki gibi ikinci ESI kaynak koşulları kullanılarak / 0.5 tarama tarama-oranı V. Çalışma LC kromatografik programı ve elute oligosakaritler. Elde edilen toplam iyon kromatogram (TIC) yazılımı tarafından otomatik olarak kaydedilir. </li><li> Kaydedilen TIC açın ve özü kromatogram seçin. Komut satırında beklenen kitleler (örneğin, 271, 403, 535, 667, 799 ve 931 m / z) yazın. Enter tıklayarak tarama kromatogram. Üreticinin talimatlarına 14&#39;e göre yazılımını kullanarak ESI-QTOF MS kromatogram verileri seçilen iyon taramaları işleyin. </li></ol></li></ol> 6. ESI-MS N <ol><li> Bir şırınga kullanılarak, bir nano-sprey ucu içine% 50 asetonitril örnek başına O-metillenmiş oligosakarit 1 ila 2 ul ekle (Pettolino ve ark., 1 tarafından tarif edildiği gibi metile). süsBir cam kesici kullanarak nano-sprey ucu MS bağlı ayrık nano-sprey tutucu içine sığacak şekilde. </li><li> Pozitif beklenen kütle aralığı (200-1,500 m / z) ve perde gazı 10, ionspray voltaj 1,900 V ve kutuplarına göre kitle olarak ayarlayın. </li><li> Ilgili penceresini açmak toplam iyon taraması (ESI-MS 1) elde etmek için veri dosyası adını girmek için acquire düğmesine basın. Ardından STOP tuşuna basın. </li><li> ilgi zirveye parçalara ürün iyonunun tarama türünü değiştirin. Çevrede kütlesini girin (örneğin, 885 m / z) parçalara ve kütle aralığını (200-900 m / z) ayarlamak için. Acquire düğmesine basın ve ana iyon tüm parçalanma (885 m / z) elde etmek ve bir fragmanı iyon taraması (ESI-MS 2) elde etmek için (yukarı ve / veya aşağı bileşik sekmesinde) çarpışma enerjisini ayarlayın. </li><li> Faiz (örneğin, 711 m / z) fragmanı iyonunun kütlesini girin ve kütle aralığını ayarlayın (200-720 m / z). acquire düğmesi, basınön-madde iyonu tüm parçalanma (711, m / z) elde etmek ve bir fragman iyonu tarama (ESI-MS 3) elde etmek için çarpışma enerjisi ayarlamak d. </li></ol> 7. H1 NMR Spektroskopisi <ol><li> D 2 O bir plastik deney tüpü içinde (1.0 mi, 99.9%) (15 mi) oligosakaritlerin endoksilanaz üretilen karışım (KOH-Sol, yerli biçimi) (~ 500 mg) içinde çözülür. 4 saat -80 ° C &#39;de süspansiyon bir dondurarak ve ksilo-oligosakkaritler kurtarmak için bir dondurarak kurutucu içinde donmuş süspansiyon kurutun. </li><li> Tamamen D 2 O ile H 2 O alışverişi yapmak için iki kez 7.1 tekrarlayın </li><li> D 2 O (0.6 mi,% 99.9) kurutuldu oligosakaritleri çözülür ve bir iç standart olarak aseton, 0.5 ul (D 2 O içinde% 5) ilave edilir. NMR deney tüpüne dötere oligosakkaritler aktarın. </li><li> üst tarafından NMR tüpü içeren örnek tutun ve plastik spinner olarak örnek tüp yerleştirin. Numune derinlik ölçer olarak değer değişimi yerleştirin. İrinh örnek üst ve alt derinlik göstergeleri merkez çizgisi eşit olmasını sağlamak için örnek derinliğini ayarlamak için örnek tüp çekin veya. </li><li> Derinlikölçer çıkarın ve kriyo-probu ile donatılmış bir 600 MHz NMR spektrometresi bağlı otomatik örnekleyici içine örnek yerleştirin. </li><li> Giriş ve açık spektrometre kontrol yazılımı. Örnek dosya adını girin. Varolan veri setini açın ve sonra yeni bir adla kaydetmek için &quot;EDC&quot; komutunu kullanın. otomatik numune numunenin pozisyon numarasını yazın ve &quot;Enter&quot; tuşuna basın. Not: sonda üst kısmında konumlandırılmış olan mıknatıs deliğine yavaşça örnek tüp düşecek &quot;ENTER&quot; düğmesine basılması. </li><li> Komut satırından &quot;edte&quot; yazarak istenen numune sıcaklığı ayarlayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce istenen değere ulaşmak için numune sıcaklığı bekleyin. Enter komut satırına &quot;kilit&quot; ve uygun çözücü seçin (D 2 O). &amp; # Bekleyin34; Pencerenin alt kısmındaki görünmesini bitmiş &quot;mesajı kilitleyin. </li><li> Komut satırından &quot;atmm&quot; yazın ve atmm menü çubuğunun üstünde &quot;optimize&quot; tıklayın. Seçilen kanalın (bu durumda 1 H) için ayarlama ve prob uyumu için başlangıç ​​seçin. </li><li> düzgün bir manyetik alan komut satırına &quot;zg&quot; yazıp girmek tarafından sample.Acquire etrafında sinyali elde edilinceye kadar küçük ayarlamalar manyetik alana yapılan edildiği layneri işlemi için komut satırına &quot;topshim&quot; yazın. </li><li> 2.225 ppm aseton dahili bir standart referans 1H kimyasal kaymanın olduğu, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir yazılım 15 kullanarak spektrum analizi. </li></ol>

<ol><li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).</li>
<li>Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reducing+end+sequence+of+wheat+endosperm+cell+wall+arabinoxylans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans.</a> Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).</li>
<li>Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacic%2C+A+%22The+Biochemistry+of+Plants%2C+Vol.+14%2C+Carbohydrates%22">The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates</a>. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).</li>
<li>York, W. S., O'Neill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+control+of+xylan+biosynthesis+-+which+end+is+up%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up?</a> Plant Biol. 11, 258-265 (2008).</li>
<li>Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionary+times+in+our+understanding+of+cell+wall+biosynthesis+and+remodeling+in+the+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses.</a> Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).</li>
<li>Faik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylan+Biosynthesis%3A+News+from+the+Grass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xylan Biosynthesis: News from the Grass.</a> Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).</li>
<li>Scheller, H. V., Ulskov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicelluloses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Hemicelluloses.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).</li>
<li>Bacic, A., Stone, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%281%E2%86%923%29-+and+%281%E2%86%924%29-linked+%CE%B2-D-glucan+in+the+endosperm+cell-wall+of+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat.</a> Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).</li>
<li>Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+soluble+and+insoluble+cell+wall+fractions+from+rye%2C+wheat+and+hull-less+barley+endosperm+flours%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours.</a> Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).</li>
<li>Pena, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+irregular+xylem8+and+irregular+xylem9%3A+Implicationsfor+the+Complexity+of+Glucuronoxylan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis.</a> Plant Cell. 19, 549-563 (2007).</li>
<li>Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+reducing+end-groups+in+Spruce+xylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan.</a> Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).</li>
<li>Mazumder, K., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+arabinoxylans+isolated+from+ball-milled+switchgrass+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass.</a> Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).</li>
<li>Kulkarni, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+of+land+plants+to+synthesize+glucuronoxylans+predates+the+evolution+of+tracheophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiol%22%5BJournal%5D)">The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes.</a> Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+MassHunter+Workstation+Software+-+Quantitative+Analysis+Familiarization+Guide%22">Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide</a>. , Agilent Technologies. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf</a> (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Topspin+User+Manual%22">Topspin User Manual</a>. , Bruker. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf ">http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf </a> (2010).</li>
<li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+nomenclature+for+carbohydrate+fragmentation+in+FAB-MS%2FMS+spectra+of+glycoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate.+J%22%5BJournal%5D)">A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates.</a> Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).</li>
<li>Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H-n.m.r.+spectroscopy+of+oligosaccharides%2C+derived+from+arabinoxylans+of+white+endosperm+of+wheat%2C+that+contain+the+elements+----4%29%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----+or+----4%29%5Balpha-+L-Araf-%281----2%29%5D%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----.</a> Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).</li>
<li>Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H+NMR+spectroscopy+of+enzymically+derived+oligosaccharides+from+alkali-extractable+wheat-flour+arabinoxylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan.</a> Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).</li>
<li>Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+enzymatic+cleavage+of+cellulose+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+%28PACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Çoğu matris faz hücre duvarı polisakkaritler görünüşte rastgele oldukça değişkendir bitki türlerinin, gelişim aşamasında ve doku tipi 3 bağlı (glikosil ve non-glikosil kalıntılar hem de) omurgaları ikame var. polisakaritler sekonder gen ürünleri olduğu sekans edilen şablon değildir ve nükleik asitler ve proteinler için var gibi tek bir analitik yaklaşımın dizileme için, bu nedenle bulunmaktadır. Saflaştırılmış bağlantı özgü hidrolitik enzimlerin mevcudiyeti daha sonra kromatografik olarak parçalara ayrılmış o...

Heteroksilanlar otların birincil duvar ve anjiyospermlerinde 3-6 ikincil duvar baskın selülozik olmayan polisakaritlerdir polisakaritlerin ailesidir. Ksilen omurgalar türlerine ve glikosil (glukuronik asit (GIcA), arabinoz (Araf)) ve non-glikosil (O-asetil, ferulik asit) ile doku tipi, gelişme aşaması ve türler 7 bağlı artıklar ile ikame farklılık gösteren. Buğdaydan Duvarlar (Triticum aestivum L.) endosperm esas arabinoksilanlar (AXS) (% 70) ve (1 → 3) oluşmaktadır (1 → 4) -β-D-Glukanlan (% 20) selüloz ve heteromannans küçük miktarları ile (2 her biri%) 8. ksilen omurgaya ağırlıklı (esas olarak O-2 konumu ve daha az bir ölçüde o-3 konumu) ikame edilmiş mono ve di-ikame edilmiş α-L-Ara ile (O-2 ve O-3 pozisyonları) değişik un ikame edilmiş olabilir ve F kalıntıları 9. indirgeyici uç (RE) hetero(örneğin, Ladin (Picea Abies)) (örneğin, Arabidopsis thaliana) dikotlardan ksilanlar 10 ve jimnospermler 11 karakteristik bir tetrasakarit glikosil sekansı içerir, -β-D-xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-xyl s. heteroksilan biyosentezini ve fonksiyonunu (biyolojik ve endüstriyel) anlamak için, tam türleri ve değiştirmelerin modellerini yanı sıra indirgeyici ucunda (RE) dizisini anlamak için ksilen omurgaya sırası önemlidir. ucu (RE) ve heteroksi iç bölgesi glikosil sekans (lar) ı indirgenerek yapısal karakterizasyon için kullanılan özel teknik, bu yazıda açıklanmıştır. teknikler enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce heteroksilan zincirinin indirgeyici ucunda (RE) (2 aminobenzamid (2AB)) ile etiketleme florofor kullanır. Özellikle RE dizileme için bu yaklaşım, olduİlk York laboratuvar 10,12-13 tarafından bildirilen ama şimdi izolasyon kaynağında bağımsız tüm heteroksi eşit uyarlanabilir kurulan tekniklerin bir arada iç bölge sıralama içerecek şekilde genişletilmiştir ve mesafesindedir. Bu yaklaşım, aynı zamanda (bulunan) uygun endo-hidrolazlar ile polisakaritlerin diğer sınıflara uygulanabilir. Tarif edildiği gibi, bu çalışmada, de-kolalı buğday endosperminin hücre duvarları su (W-Sol FR) ile ekstre alkol çözülmeyen tortu (AIR) ve ardışık olarak izole edilmiş ve 1 M KOH% 1 NaBH4 (KOH-Sol FR) içeren edildi Ratnayake et al. (2014) 2. W- ve KOH&#39;nin-Sol FRS hem serbest oligosakaritler HPLC ile ESI-QTOF-MS-bağlanmış MALDI-TOF-MS, bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, sonra metil ve hem doğal hem de metillenmiş oligosakaritlerin ayrıntılı yapısal analizi vardır bir RP C-18 kolonu kullanılarak çevrimiçi kromatografik ayırmave ESI-MS n. Endoksilanaz KOH-sol AXS, aynı zamanda nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilmiştir dijeste edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>2 aminobenzamid (2AB)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A89804</td><td></td></tr><tr><td>sodyum borohidrür (NaBH<alt>4</alt>)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>247677</td><td>Tehlikeli, dikkatli kullanın</td></tr><tr><td>sodyum siyanoborohidrit (NaBH3CN)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>156159</td><td>Tehlikeli, dikkatli kullanın</td></tr><tr><td>endo-1,4-&beta;-Ksilanaz M1 (Trichoderma viride'den) (120101a)</td><td>Megazyme (www.megazyme.com)</td><td>E-XYTR1</td><td></td></tr><tr><td>Döteryum Oksit (D2O)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Dondurarak kurutucu (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 Zorbax eclipse plus sütunu&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td>(2.1&kez; 100 mm; 1.8 ve mikro; m boncuk boyutu)&nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex MALDI-TOF MS&nbsp; &nbsp; (Model - MicroFlex LR)</td><td>(Bruker Daltonics, Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESI) -(QTOF) MS&nbsp; &nbsp; (Model # 6520)</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA )</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSn &nbsp;- iyon tuzağı&nbsp; (Model # 1100 HCT)</td><td>(Agilent, Palo Alto, Kaliforniya).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 600 MHz -NMR</td><td>Bruker Daltonics, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topspin (sürüm 3.0)-Biospin- yazılımı&nbsp;</td><td>Bruker&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (Model # 7890B)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enzimatik, kimyasal (metilasyon) ve fiziksel (kütle spektrometre, nükleer manyetik rezonans) teknikleri kullanarak bitki duvar heteroksilanlar sıralanması

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Bu protokol, ucu (RE) ve heteroksi iç bölgesi glikosil sekans (lar) ı indirgenerek karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri tarif etmektedir. De-kolalı buğday endosperminin hücre duvarları, bir alkol-olmayan su (W-Sol FR) ile ekstre edilmiştir (AIR) 1 ve ardışık ve Ratnayake ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi, 1 M KOH% 1 NaBH4 (KOH-Sol FR) ihtiva eden izole edildi ark. (2014) 2. İki farklı yaklaşım (Şekil 1&#39;de özet bakınız) kabul edilir. İlk olarak, sağlam B-Sol AXS, orijinal RE omurga zinciri şeker artığı etiketlemek için 2AB ile muamele edilir ve daha sonra 2AB etiketli Re ve sırasıyla oligosakaritler indirgeyici iç bölgeye bir karışımını oluşturmak için endoksilanazın ile muamele edilmiştir. İkinci bir yaklaşımda, KOH-sol Cu önce, daha sonra 2AB ile etiketlenir oligosakaritlerin karışımı oluşturmak için endoksilanazın ile hidrolize edilir. hem enzimatik serbest ((BM) etiketlendi) oligosakkaritlerW ve KOH&#39;nin-Sol Frs MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS ve ESI-MS, n bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, sonra metil ve hem doğal hem de metillenmiş oligosakaritlerin ayrıntılı yapısal analizi bulunmaktadır. Endoksilanaz KOH-sol AXS ayrıca anomerik konfigürasyonu hakkında bilgiler sağlar, nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilir dijeste edilmiştir. Bu teknikler, uygun endo-hidrolazlar kullanan polisakkaritlerin diğer sınıflara uygulanabilir.

AXS 2AB etiketli RE oligosakaritlerin bir karışımını ve ksilan zinciri (Şekil 1, içi bölgelerden türetilen un etiketli (2AB etiketi olmadan) oligosakaritlerin bir dizi üreten B-Sol endoksilanaz sindirimi 2AB etiketli; adlı Ratnayake ve ark. 2). kromatografik yöntemlerin bir dizisi, daha sonra izomerler kompleks karışımının fraksiyonlanması kullanılır. Son olarak, MS teknikleri, daha sonra MS n tekniklerle dizilir izomerik yapılarının tespit...

Bu protokol, enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce RE'yi 2 aminobenzamid ile etiketleyerek ve ardından elde edilen oligosakkaritlerin kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak analiz edilmesiyle, heteroksilanların indirgeyici uç (RE) ve iç bölge glikosil dizi(ler)inin yapısal karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri açıklar.

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Genel amaç, suda çözünür heravenaxylanların orijinal indirgen uç şeker kalıntısını etiketleyip bir endoxylanase ile işleyerek etiketli oligosakkarit karışımı oluşturmak yoluyla, heteroxylanların indirgen uç ve iç bölge glikosil dizilerini karakterize etmektir. Bu yöntem, planlı büyüme gelişiminin yanı sıra abiyotik ve biyotik stresörlere yanıt olarak oligosakkaritlerin veya polisakkaritlerin ince yapısındaki değişiklikler gibi glikomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, herhangi bir glikan veya polisakkaritin hem indirgen uç dizisinin hem de iç bölge dizisinin sekanslanmasına yönelik entegre bir yaklaşım tanımlamasıdır.Bir mililitre su içerisinde bir molar sodyum siyanoborohidrür çözeltisi hazırlayın. Ardından, 65 °C'de ısıtarak ve reaksiyon karışımının pH değerini %10'luk asetik asit ile pH 5.5'e ayarlayarak 27,2 mg 2AB reaktifini sodyum siyanoborohidrür çözeltisi içinde çözün. Kapaklı bir cam tüp içerisindeki 1 mg suda çözünür arabinoksilana 200 µL reaksiyon karışımı ekleyin ve bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın.Numuneyi bir çeker ocak içerisinde 65 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından süspansiy

sequencing-plant-wall-heteroxylans-using-enzymic-chemical-methylation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve polifenolik lignin bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol açıklar.

Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve duvar türetilen karbonhidrat bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Bir ekstrasellüler matriks polisakkaritlerin yapısına anlayışlar kazanmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Yöntemi dakika miktarda malzeme analiz edilmesi için izin kütle spektrometresi glycosylhydrolases özgüllüğü ve duyarlılığı yararlanır. Bu teknikte doku kendisini doğrudan kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Bu protokol, bitki hücre duvarlarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizi kullanılarak görselleştirilmesi için genel bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Mevcut protokol, buğday bitkilerinde başta β-1,3-glukanaz ve peroksidaz olmak üzere hücre duvarı ile ilgili enzimleri incelemek ve karakterize etmek için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. Buğday-RWA etkileşimi sırasında aktivite seviyeleri artar ve yaprak biti beslenmesini caydıran hücre duvarı takviyesi yoluyla bitki savunma tepkisinde yer alır.

Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının #946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması

Protein yapı ve dinamikleri protein yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için anahtardır. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte hidrojen alış veriş proteinlerin konformasyonel dinamiklerini incelemek ve temas arayüzler ve allosterik etkileri de dahil olmak üzere protein-ligand ve protein-protein etkileşimleri, karakterize için çok yönlü bir yöntemdir.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

Öğrenin, bitki hücre duvarı heteroksilanlarının indirgen uç ve iç bölge glikozil dizilerini enzimatik hidroliz, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans teknikleriyle karakterize etme yöntemini. Bu entegre yaklaşım, polisakkarit yapısının çevresel streslere yanıtını anlamaya yardımcı olur.

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması (Video) | JoVE Journal

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

Daha fazla video keşfet