Name: Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi İn Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, tümör ve tümör dışı hücrelerin karışık kültürlerinde antikanser ilaçların spesifitesini değerlendirmek için dijital PCR tabanlı genetik yöntemi. İlaç keşfi ve kişiselleştirilmiş tedavi için uygulama potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bayan Alster, Sayın Honrath ve Dr Jiang üstün teknik yardım için takdir edilmektedir. Ayrıca Dr Volz ve dijital PCR cihazına erişim sağlamak için Dr. Dandri araştırma grubudur takdir.

1. Malzemeler Kültür tümör hücreleri ve non-tümör hücreleri hem de içeren hazırlanması <ol><li> Kurulu hücre çizgisi MPNST S462 5 tümör hücreleri kullanır. Non-tümör hücreleri 6,7 olarak fibroblastlar kullanın </li><li> Kültür, her iki tümör hücreleri,% 10 fetal sığır serumu, standart DMEM ortamı içinde fibroblastlar (BSA), 3 mM glutamin, 0.1 mM 2-merkaptoetanol, 500 U / ml penisilin, 500 ug / ml streptomisin ve 1 mM sodyum piruvat, 37 ° C&#39;de ve% 5 CO Şubat 05-07. alt izdiham,% 0.05 tripsin ile hücreler hasat ve hemasitometre kullanarak onları saymak. </li><li> 0.2 ml ortam içinde 96 çukurlu bir kültür plakasının her bir oyuğuna birlikte 400 tümör hücreleri ve 1.600 non-tümör hücreleri karıştırın. 5 günlük tedavi süresi boyunca tümör hücrelerinin hızlı artışı göz önüne alındığında, tümör hücrelerinin başlangıç ​​oranı% 25 olarak belirlenmiştir. kurmak 4 her ilaç konsantrasyonu için çoğaltır. 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve% 5 CO2 O / N. </li></ol> 2. Drug Tedavisi <ol><li> Test ilaç olarak nilotinibin kullanın. DMSO içinde, 0, 2, 4 ve 20 mM nilotinibin stok çözelti hazırlayın. 0, 10, 20 ve 100 uM 6.7 2 kat konsantre edilmiş ilaç çözeltileri vererek, 5 mi DMEM ortamında 200-kat, her biri seyreltilir. </li><li> Her 0.1 mi orta de kaldırma ve orta ilacı içeren 0.1 ml ekleyin. nihai konsantrasyonlar 0, 5, 10 ve 50 uM bulunmaktadır. 5 gün boyunca ortam ihtiva eden bir ilaç hücrelerin inkübe edilmesi devam edin. </li><li> Tedavinin sonunda, bir faz-kontrast mikroskop kullanılarak ekli hücreleri incelemek ve fotoğraf çekmek. Uzak orta aspire 0.2 ml PBS ile bir kez hayatta yapışkan hücreleri yıkayın. </li></ol> 3. Dijital PCR için DNA hazırlanması <ol><li> HotShot 8 kullanarak lyse hücreleri. <ol><li> her bir oyuğa 50 ul alkalin liziz çözeltisi (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA) ekleyin. folyo ile kuyu Seal. bir fırın içinde ya da 30 dakika için bir ısıtma plakası üzerinde 95 ° C&#39;de inkübe plakası. Bir MICR altında edinOscope daha sağlam hücreler kuyu yüzeyinde kalan olduğundan emin olmak için. durumunda hücreler tamamen lyse ısıtma süresini artırmak veya deterjan eklemek vermedi. -20 ° seferde Freeze da hücrelerin kırma artırır C. </li><li> Her kuyucuğa çözeltisi (40 mM Tris-HC, pH 4.0) nötralize 50 ul ekle. 10 ila 30 dakika süreyle 95 ° C de bir PCR döngü bir PCR plaka ve kuru U biçimli kuyular içine tüm lizatları aktarın. distile su 20 ul lizatları sulandırın. </li></ol></li><li> Bırak-Diyaliz 9 kullanarak Tuzu Çöz <ol><li> ortalama gözenek boyutu 0.025 mikron membran filtreleri kullanmak. </li><li> 12-çukurlu bir levhanın kuyularında parlak tarafı yukarı gelecek şekilde damıtılmış su filtre Float. 5 dakika boyunca filtreyi ıslatın. filtre ve su arasındaki hava kabarcıklarını önlemek için dikkat edin. </li><li> Pipet dikkatle filtre 4 alanların her birinde üzerine adım 3.1.4 her numunenin yeniden lizatları. plaka kapatın ve 30 ila 60 dakika boyunca diyaliz. </li><li> Filtreyi üzerinde saygısız, ne de damla bozmadan filtrenin altında su emiciler. </li><li> yeni bir PCR-plakanın gözleri içerisine lizat damla aktarın. Bir PCR döngü 10 ila 30 dakika 95 ° C&#39;de ısıtılarak DNA damla kuru. 10 ul su içinde lizatları sulandırın. </li></ol></li></ol> 4. Dijital PCR <ol><li> Bu DNA, tampon ve oda sıcaklığında tahlil karışımı olarak çözülme dondurulmuş parçalar, (örneğin, VWR Mini santrifüjü) mevcut herhangi bir santrifüjün yüksek kuvvette 10 saniye boyunca aşağı doğru döner ve daha sonra buz üzerinde tutun. </li><li> DNA (Tablo 1) dışındaki tüm bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlayın. Ölü hacim düşünün ve gereken miktardan daha yaklaşık% 10 daha fazla ana karışımı hesaplayın. NOT: ticari kit kullanılan primerler ve problar kullanın. </li><li> Vortex ana karışımı, (örneğin, VWR Mini santrifüj) herhangi bir kullanılabilir santrifüj maksimum kuvvette 10 saniye boyunca aşağı doğru dönmeye ve her 15 ul dağıtmak96 PCR plaka de. ana karışım ihtiva eden çukurlara, her numunenin (DNA içeren) tüm lizat ekleyin. Aktarım oda sıcaklığında bir kartuş örnek tarafında iyi olarak her bir reaksiyon karışımının, 20 ul. </li><li> Bir kartuşun yağ tarafındaki her bir kuyunun içine damla üreteci yağı 70 ul koyun. conta ile kartuşu kapatın ve bir damlacık jeneratör içine bütün ayar yerleştirin. Damlacık oluşturma başlatın. </li><li> 96-çukurlu bir PCR plaka oyuklarına Aktarım 40 ul damla çözeltisi. Bir folyo ile plaka Seal ve PCR cycler içine plaka yerleştirin. 105 ° C&#39;de kapak sıcaklığını ayarlamak ve 2 ° C / sn hızı rampa. Tablo 2&#39;deki ayarları kullanarak PCR yürütmek. PCR, bir damlacık okuyucu plaka transfer ve okumaya başlayın sonra. Alternatif olarak, en fazla 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de plaka saklayın. </li></ol> 5. Tümör Hücrelerinin Oranı Hesaplama <ol><li> Dijital PCR verileri yüklemek ve otomatik analys gerçekleştirmekolduğunu. </li><li> elle pozitif ve negatif damlacıkların tek boyutlu ve 2 boyutlu dağılımını inceleyerek her testin sonuçlarını kontrol ve onlar iyi ayrılır ve eşik çizgileri doğru pozisyonlarda vardı emin olun. Sonuçlar, örneğin kriterlere uymayan dışlamak, daha fazla analiz olumlu ve olumsuz damlacıkların net bir ayrım. Bir excel sayfasında içine çıkan oran NF1 / RPP30 kopyalayın. </li><li> 2 x (1-NF1 / RPP30): tümör hücrelerinin oranını hesaplar. </li></ol> Tümör hücrelerinin oranını 6. Doz-bağlı değişimini <ol><li> Her bir ilaç-konsantrasyonu için, 4 kez tekrarlanmış olan deneyin ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. araç ve uyuşturucu konsantrasyonlarına karşı standart sapma çizilir. </li></ol>

<ol><li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li>
<li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li>
<li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li>
<li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li>
<li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography-Methods%22%5BJournal%5D)">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li>
<li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome%3A+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li>
</ol>

Prosedür patent korumalıdır (10 2013 221 452, Almanya)

In vitro ilaç özgüllük değerlendirmek için Genetik-ve hücre tabanlı bir araç anahtar aşama bir veya daha fazla tümör spesifik genetik özellikleri kullanılarak tümör hücrelerinin oranının belirlenmesidir. Geleneksel fenotipik özellikleri 7 aksine, genetik özellikler, özel bir kararlı ve ölçmek için kolaydır. Örneğin, bir tümör spesifik mutasyon ya da kopya sayısı varyasyonu non-tümör hücreleri, sadece tümör hücrelerinde değil, mevcut bulunmaktadır. Bu tür genetik leke hassas ve güvenilir şekilde bu çalışmada gösterildiği gibi, dijital, PCR kullanılarak, örneğin, belirlenebilir. Dijital PCR için DNA yüksek saflıkta gerekli değildir. Ancak, tuz giderme ve inhibitör molekülünün çıkarılmasıyla, uygun bir filtre kullanılarak bir damla diyaliz ile elde edilebildiği gereklidir. Kombine parçalama ve açılan diyaliz, basit ve hızlı özel araçlar gerektirir ve bu nedenle herhangi bir standart laboratuarda yapılabilir. Hücreler brea yoksade k, ilave işlem örneğin, -20 ° C &#39;de hücreler dondurma deterjan eklenmesi ve / veya proteaz kullanılarak olarak kabul edilebilir. Bu çalışmada, NF1 geninin heterozigot silinmesi ölçümü için tümöre özel bir özellik olarak kullanılır. Benzer şekilde, diğer genler ya da mahallerinin silmeler de kullanılabilir. Ayrıca, mutasyonlar ayrıca tümör hücrelerinin miktarının belirlenmesi için kullanılabilir. Böyle bir durumda, mutant için dijital PCR ve normal alleller yoğun bunların her biri için kendi özgüllüğü sağlamak için valide gerekmektedir. Tümör hücrelerinin doza-bağımlı bir oranda ilaç spesifikliği veya seçicilik açısından bir gösterge sağlar. Ayrıca, aynı zamanda, bir ilaç (Şekil 4) karışık bir kültür toplam hücrelerin tepkisinden tümör hücrelerinin ekstre cevabı sağlar. Bu çıkarma stratejisi olmayan tümör ve her ikisini de içerir birincil kültürlerin kullanıldığı teknik sorun için bir çözüm sağlar (uyuşturucu testi için n-tümör hücreleri). Genetik-ve bu nedenle uygulama potansiyeline sahip olabilir Bu çalışmada gösterilmiştir in vitro aracı hücre tabanlı (1) in vitro ilaç özgüllük veya seçicilik değerlendirilmesi ve bir platform sağlar ilaç keşif (2) kişiselleştirilmiş kanser bakımında nerede birincil kültürler test ilaçları sağlar ve sonuç olarak adjuvan kemoterapi 4 ilaç seçimi katkıda bulunabilir. Belirli genetik değişim ya da birden fazla genetik değişiklikler, ilaç-tedavi sırasında takip edilebilir Dahası, bir ilacın farmakolojik mekanizma, bu aracı kullanarak ele alınabilir. bireyselleştirilmiş birincil kültürleri kullanılarak bir zorluk olmaması tümör hücrelerinin ölçümü için evrensel bir genetik özelliktir. Ancak, tam genom dizileme bugünün peşin ile, en sık değişmiş genler ve bölgeler ortak tümörler için bilinir. Örneğin, baş ve boyun arasındatümörler,% 71,% 23 ve% 22 TP53, FAT1 mutasyonu CDKN2A genleri ve% 60,% 34 ve% 26 CDKN2A, STK11 ve PTEN, sırasıyla 10 gen bölümlerde silmeler sahip bulunmaktadır. hedeflenen-dizisi ve / veya dijital PCR vasıtasıyla 5 ila 10 tür genleri ve / veya bölgeleri depolarının taranması bu nedenle muhtemelen türetilen primer kültür içinde, tümör hücrelerinin ölçümü için kullanılabilecek bir ya da daha fazla genetik değişiklik belirleyecektir. Başka bir sınırlama birincil kültürleri kurmak için rezeke tümörlerin çoğu zaman yetersiz miktarıdır. Avantajlı özellikleri ve Genetik-umut verici uygulama potansiyeli ve hücre tabanlı in vitro aracı, kendi sınırlamaları göz önünde tutulmalıdır ve in vitro doğa vurgulanmalıdır rağmen. Örneğin, tümör hücreleri üzerinde, bir ilacın etkisinin karşılaştırılması ve sitotoksisite olabilir dolayı oldukça hücre tiplerinde farkı (Schwann hücrelerinin genel fibroblastlar) ya da onların(Farklı bireylerden) farklı kökenleri. non-tümör hücreleri üzerinde daha tümör hücreleri üzerinde bir ilacın daha güçlü etkisi, önceki ikinci daha hızlı büyür gerçeği ile açıklanabilir. En önemlisi, in vitro davranış hücreler, insan vücudundaki hücrelerin daha farklıdır ve dolayısıyla, in vitro değerlendirme sonuçları genellikle gerçek klinik durumu yansıtmıyor ya da sadece kısmen yok. Bu nedenle, etkinlik, sitotoksisite ve kültürlü hücreler için elde edilen ilaç özgüllüğü yerine biyomarker nitelikte ama antibiyotik klinik öncesi ölçülen etkinliği güvenilirliğini yoktur. Bununla birlikte, karma kültürlerin ve / veya primer kültürlerinde hücre hatları hareketli in vitro ilaç etkisi ve özgünlüğü / seçicilik değerlendirirken ileri bir adımdır. Geniş çaba ile, in vitro koşullarda, en azından bazı ilaçlar için hastanın gerçek tepkiler ile in vitro verileri makul bir ilişki sağlayan bulunabilir.

Antikanser ilaçların tümör hücreleri üzerindeki terapötik etkileri, tümör olmayan hücreler üzerinde çeşitli istenmeyen toksik etkilerle ilişkilidir. Toksik etkilerin, büyük ölçüde uygun aletlerin bulunmaması nedeniyle laboratuvarda değerlendirilmesi zordur1. Hem tümör hem de tümör olmayan hücreleri içeren hücre kültürleri, klinik toksisiteye ışık tutabilecek bir ilacın özgüllüğünü veya seçiciliğini değerlendirmek için potansiyel bir in vitro kaynak sağlayacaktır. Bununla birlikte, proliferasyon veya canlılık testleri gibi geleneksel in vitro deneyler, bir ilacın toplam hücreler üzerindeki etkisini ölçer, ancak etkiyi tümör hücreleri üzerindeki kısma ve tümör olmayan hücreler üzerindeki kısma bölemez. Örneğin, %50 tümör hücresi ve %50 tümör olmayan hücrelerden oluşan bir kültürde toplam hücre sayısında %50'lik bir azalma, tüm tümör hücrelerinin ölümü, tümör olmayan tüm hücrelerin ölümü veya daha büyük olasılıkla her ikisinin parçalarının çeşitli oranlarda ölümü anlamına gelebilir. 
Ayrıca bu teknik sorun nedeniyle, tümör ve tümör olmayan stromal hücreler içeren primer kültürler genellikle ilaçların test edilmesi için uygun değildir. Öte yandan, bu hücresel heterojenlik nedeniyle, birincil kültürler, yerleşik hücre dizilerindekiklonal hücrelerden çok daha iyi orijinal tümörlerine benzer 2. Daha da önemlisi, primer kültürler hastaya özgüdür ve bireyselleştirilmiş ilaç testini mümkün kılabilir:2-4.
Bu nedenle önemli bir konu, birincil kültürler de dahil olmak üzere karışık kültürlerdeki tümör hücrelerinin oranının belirlenmesi için bir yöntemin geliştirilmesidir. Bu zorluğa yönelik olarak, tümöre özgü bir genetik özelliğin evrensel bir referans dizisine kantitatif oranının belirlenmesine dayanan bir genetik çözüm tasarlandı. Bu orandan, karışık bir kültürdeki tümör hücrelerinin oranı hesaplanabilir. 
Bu çalışma, (1) yerleşik bir hattın tümör hücrelerinden ve tümör olmayan fibroblastlardan karışık bir kültür hazırlama, (2) karışık kültürün bir test ilacı ile muamele edilmesi, (3) dijital PCR için DNA hazırlama, (4) çift problu damlacık dijital PCR testi kullanılarak tümöre özgü heterozigot bir delesyonun bir referans diziye oranının belirlenmesi, (5) her ilaç konsantrasyonunda tümör hücrelerinin oranlarının hesaplanması ve (6) tümör hücrelerinin oranının doza bağlı değişiminin hazırlanması.

<table><tbody><tr><td>25 mm çapında membran filtre</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td> NF1 için <td>damla diyalizi</td></tr><tr><td>için ddPCR testi</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td> RPP30 BioRad dHsaCP2500350 için <td>FAM etiketli</td></tr><tr><td>ddPCR testi</td><td></td><td></td><td>HEX etiketli</td></tr><tr><td>QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>Çalışmada artık mevcut olmayan önceki sürüm QX kullanılmıştır. Yedek QX200</td></tr><tr><td>Damlacık yağı</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartriges&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Contalar</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>Kartuş tutucu</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Pierceble folyo</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi<em&gt; İn vitro</em

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Tümör olmayan Tümör hücreleri ihtiva eden kültürler kullanılarak in vitro anti-kanser ilaç özgüllüğünü belirlemek için kullanılan prosedür gösterilmektedir. Anahtar elemanı çift sonda, dijital PCR deneyi ve tümör hücrelerinin oranı daha sonra hesaplama kullanılarak evrensel sekansına ilişkin olarak, bir tümör-spesifik genetik değişiklik kantitatif belirlenmesidir. Deney Tümör kurulu bir hattın hücreleri ihtiva eden bir kültürün üzerinde gerçekleştirilmektedir katkılı olmayan tümör hücreleri. karışık kültür çeşitli konsantrasyonlarda test ilacı ile muamele edilmektedir. muameleden sonra, DNA, bir basit ve ucuz bir yöntemi kullanarak 96-çukurlu tablalara, hayatta yapışkan hücreler tarafından doğrudan hazırlanır ve tümöre spesifik genetik değişiklik ve bir referans genel sekansı ölçmek için bir çift sonda, dijital PCR analizine tabi . Bu gösteri NF1 geninin heterozigot silinmesi tümör spesifik genetik değişiklik olarak kullanılır veReferans gen gibi bir RPP30 geni. Oranı NF1 / RPP30 ile tümör hücrelerinin oranı hesaplanmıştır. Tümör hücrelerinin oranının doza bağımlı bir değişiklik ilacın özgüllüğü için bir in vitro gösterge sağlar çünkü bu, genetik ve hücre bazlı in vitro deney muhtemelen ilaç keşfi uygulama potansiyeline sahip olacaktır. Bundan başka, kişiselleştirilmiş kanserine bakımı için, bu Genetik-ve hücre tabanlı bir araç tek tek tümörler birincil kültürleri kullanılarak etkisini test etmek ve aday ilaçların spesifite ile adjuvan kemoterapi optimize katkıda bulunabilir.

DNA&#39;nın kalitesi kombine HotShot / Bırak-Diyaliz tatmin edici dijital PCR (Şekil 1B) için yeterlidir kullanılarak hazırlanan. 2.000 fibroblastlar için, yaklaşık 3.000 ± 500 pozitif damlacıklar beklenen 4000 kopya (bir hücrede iki kopya)% 75 tekabül eden, elde edilmiştir. Bu çalışmada, tümör hücreleri NF1 geninin 5 bir heterozigot delesyon bilinen kurulu bir hat MPNST S462 geliyordu. Bu% 50 gen dozaj azaltılması açıkça çift dijital PCR yöntemi (Şekil 1B) tarafından tespit edildi. Buna karşılık, bu genin iki kopyası fibroblast ölçüldü. Tümör ve non-tümör hücreleri arasındaki bu genetik farklılık karışık kültürlerde tümör hücrelerinin (Şekil 2) oranının hesaplanmasını sağlar. RPP30 için NF1 göreceli gen dozajı ölçerek, karışık bir kültüründe tümör hücrelerinin oranı belirlenebilirHer bir ilaç-konsantrasyonunda (Şekil 3). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Prensip Şekil 1. Dijital PCR. (A) resimde. (B) çift prob deneyi referans (RPP30) gen ile ilgili olarak tümör hücreleri MPNST S462 bir hedef (NF1) geni azaltılmış miktarda ortaya koymaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Şekil 2. Tümör Hücreleri hesaplanan oranı. Tümör hücreleri ve non-tümör hücreleri çeşitli oranlarda karıştırıldı ve 96 plakasının her oyuğuna tohumlandı. Ek O / N, hücreler lize edildi wit sonraH HotShot / Bırakma Diyaliz ve tuzdan arındırılmıştır lizatlar NF1 / RPP30 oranı verdi dijital PCR&#39;ye tabi tutulmuştur. Bu oran Baz, her bir oyuk, tümör hücrelerinin oranı hesaplanmıştır. Ve ortalama 4 adet kurulum oranda tekrarlanmış olan tümör hücrelerinin oranı standart sapması hesaplandı. Tümör hücrelerinin (Y ekseni) hesaplanan oranlar kurulum oranlarda (X ekseni) karşı grafiğe geçirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Şekil Tümör hücrelerinin oranını 3. Doz bağımlı değişiklikler (A). Doza bağımlı görünür yaşayan hücrelerin azalma. (B) tümör hücrelerinin oranı (ortalama 4 suretin standart sapma) hesaplanan<html> NF1 oranı: - 10 uM RPP30, 0 ila azalmıştır. En yüksek doz 50 uM&#39;de, birkaç önemli hücreler nedeniyle tüm hücrelere toksik etkisi, muhtemelen kalmıştı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Non-tümör hücreleri bu tümör hücrelerinin Şekil 4. Ayırma Yanıt (A) canlılık ve / veya toplam hücrelerin çoğalması geleneksel deneyler kullanılarak ölçülebilir; Tümör hücrelerinin oranı, bu çalışmada ortaya prosedür kullanılarak belirlenebilir. İki parametre kullanarak (B), bir ilaca, bir karışık kültür toplam hücrelerin tepki, tümör hücreleri ve tümör olmayan hücre tepkisinin karşılık ayrılabilir..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Tepki </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR Supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> NF1 için tahlil karışımı </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> RPP30 için deney karışımı </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> Haelll </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> ara toplam </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> usta karışımı </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Toplam </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Nihai PCR Karışımı </td></tr></tbody></table> Tablo 1 Çift ddPCR Reaksiyon Kurma <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Aksiyon </td><td> sıcaklık </td><td> Zaman </td><td> Bisikletler </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymaktivasyon silmek </td><td> 95 ° C </td><td> 10 dakika </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> DNA denatürasyonu </td><td> 94 ° C </td><td> 30 sn </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Tavlama / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td> 4 </td><td> polimeraz devre dışı bırakma </td><td> 98 ° C </td><td> 10 dakika </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Tut (isteğe bağlı) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2 PCR Cycler Ayarları

Bu protokolün amacı, tümör ve non-tümör hem hücreleri içeren karışık kültürleri kullanılarak in vitro antikanser ilaçların özgüllüğünü değerlendirmektir.

Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Bu prosedürün genel amacı, hem tümör hem de tümör dışı hücreler içeren bir kültürdeki tümör hücrelerinin doz bağımlı oran değişimini değerlendirmektir. Bu yöntem, antikanser ilaçların in vitro etkisini ve özgüllüğünü değerlendirmek için genetiğe dayalı bir araç sunmaktadır. İlaç keşfi ve kişiselleştirilmiş kanser bakımı alanlarında uygulama potansiyeline sahiptir.Bu yöntemin temel avantajı, anti-kanser ilaçları hem tümör hem de tümör dışı hücreler içeren bir kültürde test edildiğinde, tümör hücrelerinin yanıtının tümör dışı hücrelerin yanıtından ayrıştırılabilmesidir. Bu prosedürü laboratuvarımdan teknisyen Eena gerçekleştirecektir. Bu prosedüre, hem tümör hücrelerini hem de fibroblastları standart DMA ortamında, 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca kültürleyerek başlayın.Hücreler alt-konfluens aşamasına geldiğinde, %0,05 trypsin ile toplayın ve bir hemositometre kullanarak sayın. Ardından, 96 kuyucuklu bir kültür plakasına, her kuyucuğa 0,2 mL besiyeri ile birlikte 400 tümör hücresi ve 1.600 tümör dışı hücreyi karıştırarak ekleyin ve her ilaç konsantrasyonu için dört tekrar oluşturun. Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin.Ardından, DMSO içerisinde 0, 2, 4 ve 20 mM konsantrasyonlarda Nilotinib stok çözeltilerini hazırlayın. Her birini, 0, 10, 20 ve 100 uM konsantrasyonda iki kat yoğunlaştırılmış ilaç çözeltileri elde edecek şekilde 5 mL DMA ortamında 200 kat seyreltin. Daha sonra, her kuyucuktan 0,1 mL ortamı uzaklaştırın.İlacı içeren 0,1 mL besiyeri ekleyin ve hücreleri beş gün boyunca inkübe etmeye devam edin. Tedavi sonunda, tutunmuş hücreleri faz kontrast mikroskobu kullanarak inceleyin ve fotoğraflarını çekin. Besiyerini aspire edin ve hayatta kalan yapışkan hücreleri 0,2 mL PBS ile bir kez yıkayın.HotSHOT yöntemini kullanarak hücreleri liz etmek için, her kuyucuğa 50 uL alkali liz çözeltisi ekleyin. Kuyucukları folyo ile kapatın. Ardından plakayı, bir fırında veya ısıtıcı plaka üzerinde 95 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.30 dakika sonra, kuyucukların yüzeyinde hiç sağlam hücre kalmadığından emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. Hücrelerin tamamen liz olmaması durumunda ısıtma süresini artırın veya deterjan ekleyin. Hücreleri bir kez 20 Celsius degrees derecede dondurmak da hücrelerin parçalanmasını kolaylaştırır.Ardından, her kuyucuğa 50 uL nötralizasyon çözeltisi ekleyin, ardından tüm lizatları bir PCR plağının U Form kuyucuklarına aktarın ve bunları bir PCR döngüleyici cihazda 95 °C'de 10 ila 30 dakika boyunca kurutun. Sonrasında, lizatları 20 uL distile su ile yeniden çözün. Damla diyalizi kullanarak DNA'yı tuzdan arındırmak için 25 mm çapındaki bir membran filtreyi dört alana ayırın ve alanları numaralandırın.Filtreleri, parlak yüzeyleri yukarı bakacak şekilde 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarındaki distile su üzerinde yüzdürün. Ardından, 20 uL yeniden konstitüe edilmiş lizatı dikkatlice filtrenin üzerine damlatın. Plakayı kapatın ve 30 ila 60 dakika boyunca diyalize bırakın.Ardından, filtreyi ters çevirmeden veya damlacıkları rahatsız etmeden filtrenin altındaki suyu çekip alın. Lizat damlacıklarını yeni bir PCR plakası kuyucuklarına aktarın. Sonrasında, plakayı bir PCR döngüleyici cihazda 95 °C'de 10 ila 30 dakika ısıtarak DNA damlacıklarını kurutun.Ardından lizatları 10 uL su ile yeniden çözün. Sonra, çift prob dijital PCR reaksiyonu için DNA hariç tüm bileşenleri içeren ana karışımı (master mix) hazırlayın. Ana karışımı santrifüjde maksimum hızda 10 saniye boyunca vorteksleyip çöktürün ve karışımın 15 uL'sini 96'lı bir PCR plakasının her kuyucuğuna dağıtın.Her örneğin lizatını, master karışım içeren kuyucuklara ekleyin. Her bir reaksiyon karışımından 20 uL'yi, oda sıcaklığında bir kartuşun örnek tarafındaki kuyucuğa aktarın. Ardından, kartuşun yağ tarafındaki her bir kuyucuğa 70 uL damlacık oluşturucu yağ dağıtın.Damlacık oluşturma işlemine başlamadan önce kartuşu bir conta ile kapatın ve tüm düzeneği bir damlacık oluşturucuya yerleştirin. Ardından, her bir damlacık çözeltisinden 40 uL'yi 96 kuyucuklu bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna aktarın. Plakayı bir folyo tabakasıyla mühürleyin ve plakayı bir PCR döngüleyiciye yerleştirin.Ardından, kapak sıcaklığını 105 °C'ye ve ramp hızını saniyede 2 °C'ye ayarlayın. İşlem tamamlandığında, plakayı bir damlacık okuyucuya aktarın ve okuma işlemini başlatın. Alternatif olarak, plakayı 24 saate kadar 4 °C'de saklayın.Şimdi dijital PCR verilerini yükleyin ve otomatik analizi gerçekleştirin. Pozitif ve negatif damlacıkların iyi ayrıldığından emin olmak için örnekleri manuel olarak inceleyin. Pozitif ve negatif damlacıklar arasında net bir ayrım bulunmayan örnekleri sonraki analizlerin dışında tutun.Elde edilen NF1/RPP30 oranını bir Excel sayfasına kopyalayın. Ardından, tümör hücrelerinin oranını hesaplayın. Her ilaç konsantrasyonu için, dört tekrardan ortalama ve standart sapmayı hesaplayın, ardından ortalamaları ve standart sapmaları ilaç konsantrasyonlarına karşı grafikleyin.Burada, canlı hücrelerin doz bağımlı azalması gösterilmiştir. NF1'in RPP30'a oranından hesaplanan tümör hücresi oranı, 0 ila 10 uM aralığında azalmıştır. 50 uM'lik en yüksek dozda, muhtemelen tüm hücreler üzerindeki toksik bir etki nedeniyle çok az canlı hücre kalmıştır.Toplam hücrelerin canlılığı ve proliferasyonu geleneksel analizler kullanılarak ölçülebilir, ancak tümör hücrelerinin oranı bu çalışmada gösterilen prosedür kullanılarak belirlenebilir. Bu iki parametre kullanılarak, karışık bir kültürdeki toplam hücrenin bir ilaca verdiği yanıt, tümör hücresi yanıtı ve tümör dışı hücre yanıtı olarak ikiye ayrılabilir. Beş günlük tedavi süresi dahil olmak üzere tüm test prosedürü bir hafta içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, hedef gen ile tersine çevirme geni arasındaki oranın değişkenlik gösterdiğini unutmak önemlidir. 0 ile 1 arasında olan çok dar bir aralık gördüğümüz için kesinlik esastır. Örnekler arasındaki ve işlemlerdeki değerlendirme farkları mümkün olduğunca azaltılmalıdır.Bu prosedür takip edilerek, hem tümör hücrelerini hem de tümör dışı hücreleri içeren primer kültürler, antikanser ilaçların etkisini ve özgüllüğünü test etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, bir ilacın tanımlanmış genetik değişikliğe sahip belirli bir hücre alt popülasyonu üzerindeki etkisi spesifik olarak değerlendirilebilir. Bu videonun, hem tümör hücreleri hem de tümör dışı hücreler içeren bir örnekteki veya kültürdeki tümör hücresi oranını belirlemek için genetik özelliklerin nasıl kullanılacağını anlamanıza yardımcı olacağını umuyorum.

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Havaya duyarlı bir titanyum ve vanadyum anti-kanser ajanlarının sentezi için bir yöntem olup, MTT testi ile insan kanser hücre çizgisi karşı sitotoksik aktivitenin değerlendirilmesi ile birlikte tarif edilmiştir.

MTT deneyi ile sentez ve Sitotoksisite Değerlendirilmesi: Anticancer Metal Kompleksleri

Burada, tümör hücresi metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi, in vivo tavuk embriyosu koryo-allantoik membran (CAM) metastaz modeli ile birleştirildiğinde, tümör hücrelerini DNA'ya zarar veren kemoterapötiklere duyarlı hale getirme yetenekleri açısından yeni anti-kanser hedeflerini/ajanlarını değerlendirmek için kullanılır.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hedefli tedavilere karşı duyarlılığı incelemek için biyolojik bir kollajen iskelesine dayalı üç boyutlu (3D) bir akciğer kanseri modeli sunuyoruz. Proliferasyon indeksi, apoptoz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) durumunu belirlemek için farklı okuma teknikleri gösteriyoruz. Toplanan veriler, ilaç duyarlılığının tahmini için in silico bir modele entegre edilmiştir.

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Burada, antikanser coumarins 3D kültür ve zebra balığı kullanarak preklinik tarama mevcut.

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı, antikanser bir antikor ve antineoplastic ilaçlar içinde Preklinik modelleri arasında synergism Chou ve Talalay birlikte Dizin denklemi kullanarak değerlendirmek açıklar.

Antikanser antikor etkinliğinin Antineoplastic uyuşturucu tarafından kullanılmasının muhtemelen: antikor-uyuşturucu Synergism kombinasyon Dizin denklem kullanılarak tespiti

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Kanser dokularına benzer ancak 96 kuyulu ve 384 kuyu plakalı in vitro yüksek verimli tahlil sistemleri için uygun olmayan, hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO) kullanan antikanser ilaçları değerlendirmek için son derece hassas bir in vitro yüksek verimli tahlil sistemi geliştirilmiştir.

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

Antikanser aptamer gelişiminde gerekli bir adım, hedefe bağlanmasını test etmektir. Bu bağlanmayı incelemek için akış sitometrik tabanlı bir tahlil gösteriyoruz ve negatif bir kontrol aptamer ve bu belirli protein için pozitif veya negatif olan kanser hücrelerinin dahil edilmesinin önemini vurguluyoruz.

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Öğrenin, tümör ve tümör dışı hücrelerin karışık kültürlerinde antikanser ilaçların spesifitesini değerlendirmek için dijital PCR tabanlı genetik yöntemi. İlaç keşfi ve kişiselleştirilmiş tedavi için uygulama potansiyeli sunar.

Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet