Name: Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu PilG de Xylella fastidiosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Öğrenin Xylella fastidiosa bakterisinin seğirme hareketliliğini nano-mikroakışkan akış odası kullanarak görselleştirmeyi ve karakterize etmeyi. Bu yöntem, bakteri patojenezindeki hareketlilik mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma ABD Tarım Dairesi, Tarımsal Araştırma Servisi tarafından desteklenmiştir. Bu yayındaki ticari adlar veya ticari ürünler belirli bilgi vermek amacıyla sadece belirtilen ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.

1. Bakteriyel Colony Periferik Fringe <ol><li> X büyümek fastidiosa (Xf) Temecula yabani tip 22, pilG silme mutant PD2 orta agar plakaları 25 ° 28 ° üzerinde (daha önce kromozom tabanlı genetik tamamlama stratejisi 24 tarif kullanarak) (daha önce açıklanan silme stratejisi 23 kullanarak) Xf ΔpliG ve onun tamamlayıcı XfΔpliG -C 5-7 gün bekletilmiştir. </li><li> 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de (249 ° F) su içinde Otoklav selofan (1 x 1 cm2). , Selofan tek parça Pick up boş bir Petri kabı selofan bir köşesini dokunarak su tahliye dikkatle agar yüzeyi ve kuru hava% 15 üzerinde selofan yatıyordu. </li><li> Bireysel X Pick up aseptik agar plakaları agar yüzeyinin% 15 üst üste selofan bir sterilize levha üzerine yuvarlak kürdan ve spot hücreler steril ile fastidiosa koloniler. plaka inkübe2-3 gün 28 ° C &#39;de s. </li><li> 2X objektif lens ile diseksiyon mikroskobu ve 10X oküler lens kullanarak kolonilerin kenar morfolojisi inceleyin. kolonilerin etrafında çevresel saçak fotoğraf. </li></ol> 2. Mikroskopi ve mikroakışkan Akış Odaları <ol><li> Benzer fotoğraf litografik prosedürler kullanılarak Üretiyor mikroakışkan cihazlar önceden 5,18 nitelendirdi. Standart taşbaskı yöntemler 26 kullanarak ana silikon gofret bilgisayar destekli tasarım yazılımı ile dört paralel kanal tasarlayın. </li><li> polidimetilsiloksan (PDMS) ile silikon gofret ustadan mikroakışkan odaları oluşturun. silikon gofret ana üzerinde unpolymerized PDMS dökün ve 1 saat 60 ° C&#39;de onu tedavi. gofret PDMS kopya soyulabilir ve bir cam lamel aynı boyutu olarak 22 mm x 40 mm bir bıçak ile PDMS çoğaltma kırpın. </li><li> PDMS çoğaltma bir cam lamel (22 x 40 mm2) ve Microsc Açığa2 dakika 27 30 W hava plazmaya ope slayt (51 x 76 mm 2). Sandviç cam lamel ve mikro fl uidic odasını oluşturmak için cam mikroskop arasında PDMS gövde. </li><li> desenli kanal her bir ucunda PDMS bir delik (5.5 mm çap) delin. 12-20 cm uzunluğunda içine silikon kauçuk tüp kesti. PDMS yineleme kanalların her biri açılış ucuna silikon kauçuk hortumun bir ucu (dış çapı 5,1 mm, iç çap 2.1 mm, 0.8 mm duvar) ekleyin ve 1 saat boyunca 60 ° C&#39;de polimerize edilmemiş PDMS ile kapatın. </li><li> plastik luer konnektörleri dikenli sonuna kadar boru başka ucunu. Alüminyum folyo ile monte mikroakışkan odaları sarın ve 20 dakika boyunca her otoklav. </li><li> X bakteriler hücreleri toplayın kazıma yoluyla fastidiosa yabani tip mutant Xf ΔpliG ve tamamlayıcı XfΔpliG -C, tek aşılamak kullanarak PD2 orta plakalar döngüler. Hücre yoğunluğunu ayarlayınPD2 suyu 600 nm&#39;de 0.05 bir optik yoğunluğa kadar daha önce tarif edildiği gibi 23. 1 ml gaz geçirmez şırınga içine bakteriyel hücre çözeltisi toplayın. </li><li> ters bir mikroskop sahnede mikroakışkan cihaz monte edin. PD2 suyu içeren 5 ml gaz geçirmez şırınga bir giriş borusunu bağlayın. şırınga pompaları ile 5 ml Gaz Geçirmez şırınga takın. </li><li> Bir atık haznesine çıkış borusunu bağlayın. 0.2 ul dk orta akış hızını korumak -1 30 dakika sistemini stabilize etmek için. </li><li> bakteriyel hücre çözeltisi ihtiva eden bir 1 ml&#39;lik gaz geçirmez şırınga ile yandan giriş tüpleri bağlayın. Kanal ulaşılana kadar kauçuk tüp aracılığıyla bakteriyel hücre çözümü yıkayın. Bölmeden önce, görüntü yakalama, bağlanmamış hücreleri temizlemek için 0.2 ul dk&#39;lık bir araç akış hızı -1 30 dakika boyunca muhafaza edilir. </li><li> ışık kontrol etmek mikroskop alan düzeltilmiş bölümü altında mikroskop deklanşör monte edin. deklanşör co deklanşör bağlayınntrol sistemi ve bilgisayara kapı kontrol sistemini bağlayın. </li><li> mikroskop video portuna dijital bir kamera monte ve bilgisayara bağlayın. Menüden &quot;deklanşör&quot; işlevini seçin, time-lapse kayıt yazılımını çalıştırın ve yazılım ile çekim bağlantı kurmak için yazılımda otomatik olarak varsayılan olarak yüklenir deklanşör tanır. </li><li> yazılım otomatik olarak varsayılan yakalama aygıtı olarak dijital fotoğraf makinesi tanımak ve yazılım ile dijital kamera ile iletişim kurmak için time-lapse kayıt yazılımı menüden &quot;dijital fotoğraf makinesi&quot; işlevini seçin. </li><li> 20X faz-kontrast optikler kullanılarak kanalların birinde bakteri hücreleri bulup görüntü yakalama önce 40X objektif lens geçin. </li><li> mikroskop görüntüleri elde etmek için menüden varsayılan parametreleri kullanarak &quot;görüntü elde etme&quot; işlevini seçin, time-lapse kayıt yazılımı çalıştırın.Sonra, &quot;time-lapse Edinme&quot; fonksiyonunu açın ve 6-24 saat X&#39;in seğirmesi hareketliliğini gözlemlemek için gerekli deney bağlı süresince 30 sn 5,18,28 zaman aralığını ayarlamak fastidiosa 5,18,28. time-lapse kayıt başlatmak için &quot;Tamam&quot; a tıklayın. seçmek kayıt bittikten sonra bilgisayardaki hedef klasördeki görüntüleri yığını &quot;farklı kaydet&quot; menüden &quot;Yığın fonksiyonunu&quot; tıklayın. </li><li> birden fazla kanal için, 6 saat boyunca birinci kanaldan her 30 saniye zaman atlamalı çekim. hedef hücreleri bulmak için bir sonraki kanala mikroskop objektif lens taşıyın. Deney dört kanal kullanmak üzere ayarlanmış ise dört kanal sırayla her görüntü yakalamak için yukarıda anlatıldığı gibi zaman atlamalı fonksiyonunu tekrarlayın. sürece üç ardışık gün boyunca zaman atlamalı görüntü yakalama devam edin. Bütün deneyler oda sıcaklığında (23 ± 2 ° C) gerçekleştirilmiştir. </li><li> Bir içine zaman atlamalı görüntüleri derlemektime-lapse kayıt görüntüleme yazılımı kullanarak video dosyası. Run time-lapse kayıt yazılımı, menüden &quot;Yığın işlevi&quot; tıklatın ve bilgisayardan yığılmış dosyaları açmak için &quot;openstack işlevini&quot; seçeneğini seçin. </li><li> tüm görüntüleri seçip &quot;AVI&quot; çıkış biçimi seçerek, yığın modülünden &quot;filmi olun&quot; fonksiyonunu başlatın. bilgisayardaki Hedef klasördeki video dosyasını saklamak için &quot;farklı kaydet&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> bilgisayardaki hedef klasörün derlenen film seçin ve onları oynatmak. Sonra, oluşturulan video dosyaları bakteri hücrelerinin seğirmesi motilite aktivitesinin ortaya çıkan görselleştirme yoluyla tek hücre hareketliliğini gözlemlemek. </li></ol>

<ol><li>Purcell, A. H., Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastidious+xylem-limited+bacterial+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).</li>
<li>Purcell, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%2C+a+regional+problem+or+global+threat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat.</a> J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).</li>
<li>Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%3A+Xylem-limited+bacterial+pathogen+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).</li>
<li>Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+and+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili and twitching motility.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+migration+of+Xylella+fastidiosa+via+pilus-driven+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility.</a> J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+affect+twitching+motility%2C+biofilm+formation+and+cell-cell+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation.</a> Microbiology. 153, 719-726 (2007).</li>
<li>Simpson, A. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+plant+pathogen+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa.</a> Nature. 406, 151-157 (2000).</li>
<li>Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pilus+motor+forces+exceed+100+pN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single pilus motor forces exceed 100 pN.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).</li>
<li>Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+characterization+and+determination+of+adhesion+forces+of+Pseudomonas+aeruginosa+pili+by+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy.</a> J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).</li>
<li>Skerker, J. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+extension+and+retraction+of+type+IV+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct observation of extension and retraction of type IV pili.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9(2001).</li>
<li>Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+%27stick-and-roll%27+adhesion+of+type+1+fimbriated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli.</a> Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion%2C+biofilm+formation+and+motility+of+Acidovorax+citrulli+using+microfluidic+flow+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers.</a> FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).</li>
<li>Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).</li>
<li>Fuente, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion+forces+of+type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+bacteria+by+use+of+a+microfluidic+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).</li>
<li>DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PilJ+localizes+to+cell+poles+and+is+required+for+type+IV+pilus+extension+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa.</a> Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).</li>
<li>Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+type+I+and+type+IV+pilus+biosynthetic+genes+affect+twitching+motility+rates+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa.</a> J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).</li>
<li>Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+II+che+genes+from+Pseudomonas+aeruginosa+are+required+for+an+optimal+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response.</a> J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).</li>
<li>Cursino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Operon%2C+Pil-Chp%2C+That+Controls+Twitching+Motility+and+Virulence+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).</li>
<li>Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemoreceptors%3A+High-performance+signaling+in+networked+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays.</a> Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).</li>
<li>Costa, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+hosts+of+Xylella+fastidiosa+in+and+near+southern+California+vineyards%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards.</a> Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).</li>
<li>Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+pathways+in+Xylella+fastidiosa%3A+genes+and+phenotypes+controlled+by+algU%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).</li>
<li>Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-Based+Genetic+Complementation+System+for+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).</li>
<li>Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+Media+for+the+Pierce%27s+Disease+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium.</a> Phytopathology. 70, 425-429 (1980).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Mater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).</li>
<li>Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interfacial+interactions+between+semispherical+lenses+and+flat+sheets+of+poly-%28dimethylsiloxane%29+and+their+chemical+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives.</a> Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).</li>
<li>Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-enhanced+twitching+motility+in+Xylella+fastidiosa+is+linked+to+a+single+PilY1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Bu çalışmada, biz X&#39;in hareket davranışını karakterize fastidiosa PilG mutant Xf ΔpilG ve yeni tasarlanmış çoklu paralel nano-kanal mikro fl uidic odalarında tamamlayıcı XfΔpilG- C suşları. Yeni tasarlanan mikro fl uidic odaları tek bir 50 mikron genişliğinde kanal 18 ile daha önceki tasarımlara göre genişliği 100 mikron nano-kanal ile en fazla dört paralel odaları olabilir. geliştirilmiş geniş nano-kanal medyanın akan bakteri hücrelerinin giriş kolayl...

Xylella fastidiosa Grapevine Pierce hastalığı (Vitis vinifera L.), 1,2, 3 dahil olmak üzere ekonomik olarak önemli bitkisel hastalıkların bir dizi neden olan bir Gram-negatif olmayan kamçılı, patojen bir bakteridir. Bu bakteri su ileten ksilem sınırlıdır gemiler. Asmanın Enfeksiyon ksilem gemi ve su stresi sonuçları ve beslenme yetersizlikleri 3 tıkanmasına neden olur. Başarılı kolonizasyon tesisi 3 geri kalanına enfeksiyon ilk siteden taşımak için bakterinin yeteneğine bağlıdır. X özelliği olan polar tip IV Pili 4 uzatılması, bağlanma ve geri çekme yoluyla flagellar bağımsız bakteriyel hareketi için bir araç motilitesini olan seğirmesi fastidiosa 5,6,7. Seğirmesi motilite lazer cımbız ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 8,9,10 tarafından gözlenmiştir. Bu teknikler kullanılarak, twitching motiliteler N. tip IV pilus tarafından oluşturulan gonorrhoeae ve S. aeruginosa fl uorescently etiketleme pili ve mikroskopik hareketlerini yakalayarak ile karakterize edildi. Her iki yöntem bireysel bakterilerin yapışkan kuvveti ayrıntılı olmasına rağmen, prosedürler karmaşık ve zaman 9,10 alıcıdır. Mikro fl uidic odalar uzun mesafe, tek tek hücrelerin göçünü ve bakteri hücreleri 5,6 küçük agregalar gözlemlemek için kullanılmıştır. Bu odalar bir time-lapse görüntü kayıt sistemi 11,12,13,14 ile entegre bir tabak içinde bir microfabricated-nano-kanal olarak dizayn edilmiştir. Mikro uidic odacık cihazlar bakteri hareketi davranışı ve hücre-hücre etkileşimleri incelemek için çeşitli avantajlar sunar fl: (i) bir çok kanallı yetenekleri ile entegre bir platform sağlar; (Ii) hareketler ve bakteri nano ölçekli özellikleri tek hücre toplamlar inceleyebilirsiniz; (Iii) doğrudan m sağlarbakteriyel hücrelerin ve zaman atlamalı analizi icroscopic görüntü kaydı, (iv) bir mikro-ortamda bakterilerin tek tek ve / veya popülasyonlarının uzun süreli mekansal ve zamansal gözlemler sağlar; (V) bir kanalda kültür ortamının akış hızı hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve kültür ortamında (vi) sadece çok küçük bir hacmi (1 mi), her bir deney için gereklidir. Son zamanlarda, mikro fl uidic akış sistemi çeşitli mikroçevrelerde 14,15,16 altında bakteri hücrelerinin davranışlarını araştırmak için istihdam edilmiştir. Yapışkanlık ve E. yüzey eki E. coli, 15 X fastidiosa 16 ve Acidovorax cam yüzeylere 14 mikro fl uidic odaları kullanılarak değerlendirildi citrulli. Acidovorax citrulli tipi IV pili aracılığıyla toplama ve biyo fi lm oluşumu 14 analiz edildi. A. Ayrıca, hareket citrulli akış c altında gözlenenşartlarından Tip IV pili kolonizasyon önemli roller oynayabileceğini göstermiştir ve A. yayıldı sap akış koşulları altında ksilem damarlarında citrulli. Pseudomonas aeruginosa ve X&#39;in seğirmesi motiliteler fastidiosa hücreleri başarılı bir şekilde mikrofabrike akış odasının 5,6,17 bir akışkan akımına karşı gözlendi. Tip IV pilus X. pilB ve pilQ mutantlar yoksun fastidiosa derinden mikro fl uidic cihazlar 5,6,18 içinde akış koşulları altında motilite seğirmesi hızını değiştirmek için bulunmuştur. Mikro fl uidic cihazlarda bakteri yapışma ve motilitesi üzerinde yapılan çalışmalar, mikro fl uidic odaları in vitro pili aracılı bakterilerin seğirmesi motilitesini ve göç analizi için özellikle uygun olduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar hücre-hücre eki, agregasyonu ve kolonizasyonu içinde kolaylaştırır seğirmesi aracılı göç mekanizmasını açıklamakEv sahibi, sonuçta sistemik enfeksiyona yol. X. Pil-Chp operon fastidiosa kodlamak sinyal iletimi 20 yolaklarıyla pilG, pili, pilJ, hap, chpB ve chpC içerir. transmembran kemoreseptörlerin periplazmik etki kimyasal uyaranlara bağlamak ve sonuçta bakteriyel seğirmesi hareketliliğini kontrol etme sitoplazmik kısmı bir sinyal kaskad etkinleştirin. X&#39;in Pil-Chp operonunda fastidiosa, fosfo-geçiş proteini PilG Chey bir homologudur. E. E. coli ve P. aeruginosa, Chey kamçı motor proteinlerin 19, 21 ile etkileşim kemotaksis sistemlerinde yanıt düzenleyicisidir. X&#39;de virülansına doğru Pil-Chp operon katkıları olmasına rağmen fastidiosa çevresel sinyallere yanıt olarak ve X&#39;in ayarlı / motor tip IV Pili için, en son kemotaksis operonunda pilG rolü 20 incelenmiştir fastidiosa unc olduğunulear. X&#39;in seğirmesi hareketlilik aktivitesindeki kemotaksis regülatör pilG bir fikir aydınlatmak için fastidiosa, mikro fl uidic odası X&#39;in seğirmesi motilitesini değerlendirmek için kullanılır fastidiosa. X fastidiosa ve pilG bir silme mutantı Xf ΔpliG tamamlayıcı suşu XfΔpliG C ve in vitro olarak vahşi tip fenotipleri karşılaştırılması ile karakterize edilir. Sonuçlar X&#39;in seğirmesi motilite pilG rolünü vurgulamak fastidiosa.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Biyoloji malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X. fastidiosa (Xf) Temecula vahşi türü</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., et al., 2004 22</td></tr><tr><td>pilG delesyon mutantı Xf&Delta; pliG</td><td></td><td></td><td>Shi, XY., et al., 2007 26</td></tr><tr><td>pilG tamamlayıcı suş Xf&Delta; pliG-C&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Davis, MJ, et al. 1998 23</td></tr><tr><td>Fiziksel malzemeler ve ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık aşılama döngüleri</td><td>VWR international, Radnor, PA</td> <td># 22-363-607</td> bakteri toplama Polidimetilsiloksan (PDMS) <td>gibi kantitatif prosedürler</td></tr> <tr><td></td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 Silikon Elastomerik Kitler</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 dijital kamera</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>Görüntü, video kayıt ve ölçüm&nbsp;</td></tr><tr><td>Tüpler hattı</td><td>Edgewood, NY</td><td></td>#T4300 <td>Şırınga ve mikroakışkan hazneye bağlı</td></tr><tr><td>Plastik luer konektörleri</td><td>Edgewood, NY</td><td></td><td>Şırınga ve mikroakışkan hazneye bağlı</td></tr><tr><td>Şırınga pompaları</td><td>Pico Plus, Harvard Apparatus, MA</td> <td># 702209</td><td>Pompa çalışırken akış hızı ayarlanabilir.</td></tr><tr><td>Şırıngalar</td><td>Gastight, Hemilton Company, Reno, NV</td> <td># 1005</td><td>Akan suyu sağlayın</td></tr><tr><td>Ters çevrilmiş Olympus IMT-2 mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>Görüntü gözlem ve kayıt</td></tr><tr><td>SPOT-RT dijital kamera</td><td>Diagnostic Instruments, Inc., MI</td><td>RT230</td><td>Görüntü, video kaydı ve ölçümü</td></tr><tr><td>Mikroskop Deklanşörü</td><td>UNIBLITZ, US</td><td>#LS2T2</td><td>Kontrol kamerası' s pozlama süresi</td></tr><tr><td>Mikroskop Deklanşör Kontrol sistemi</td><td>UNIBLITZ, US</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 Tek Kanallı CE/UL/CSA Onaylı Deklanşör Sürücüsü</td></tr><tr><td>MetaMorph Görüntü yazılımı</td><td>Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>Gerçek zamanlı süper çözünürlüklü görüntü işleme&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rolü seğirmesi motilitesi görselleştirme ve karakterizasyonu<em&gt; pilg</em&gt; &#39;de<em&gt; xylella fastidiosa</em

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa bitkiler ekonomik açıdan önemli hastalıklara neden olan bir dizi, bir Gram-negatif olmayan kamçılı bir bakteridir. Seğirmesi motilitesi X sağlar fastidiosa uzun mesafe içi bitki hareketi ve kolonizasyonu için bir araç X patojenik doğru katkıda X&#39;in fastidiosa. seğirmesi motilite fastidiosa tip IV pili tarafından işletilmektedir. Xylella fastidiosa ve Tip IV pili pilG, sinyal transdüksiyon geçiş yolları ile ilişkili olan Pil-Chp operon&#39;u şifreleyen proteinler bir kemotaksis regülatörü tarafından düzenlenir. X&#39;in seğirmesi motilitesinde pilG rollerini aydınlatmak için fastidiosa, bir pilG -açıklı mutant Xf ΔpilG ve yerli pilG içeren tamamlayıcı suşu XfΔpilG- C geliştirilmiştir. Time-lapse görüntü kayıt sistemi ile entegre bir mikroakışkan odaları XfΔp içinde seğirmesi hareketliliğini gözlemlemek için kullanılanILG, XfΔpilG- C ve vahşi tip süzün. Bu kayıt sistemi kullanarak, uzun vadeli mekansal ve zamansal toplama gözlemlerini, tek tek hücrelerin ve seğirmesi hareketlilik yoluyla bakteri popülasyonlarının göç izin verir. X Mutant XfΔpliG seğirmesi eksik fenotip sergilenen oysa fastidiosa yabani tip ve tamamlayıcı XfΔpilG- C suşu, doğrudan mikroakışkan akış gözlerinden gözlenen tipik seğirmesi motilite özellikleri gösterdi. Bu çalışma pilG X. seğirmesi hareketliliğin artmasını göstermektedir fastidiosa. mikroakışkan akış odası seğirmesi hareketliliği gözlemlemek için bir araç olarak kullanılmaktadır.

Tip IV pilus-aracılı seğirmesi hareketlilik gösteren bir çevresel koloni saçak varlığı, X kolonileri gözlendi fastidiosa yabani tip ve tamamlayıcı Xf ΔpliG -C suşu (Şekil 1). Mutant XfΔpliG Ancak koloni çevresi etrafında bir saçak (Şekil 1) sergilemedi. Nano-mikroakışkan akış odalarına bakteri hücrelerinin Time-lapse görüntüleme seğirmesi motilite hem vahşi tip X gözlendi ortaya fastidiosa ve...

Bu çalışmada, nano-mikroakışkan akış odası görselleştirmek ve işlevsel Xylella fastidiosa, dedikodu olarak Pierce hastalığa neden olan bir bakterinin seğirmesi motilitesini karakterize etmek kullanılmıştır.

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu<em&gt; PilG</em&gt; &#39;de<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Bu protokolün genel amacı, bir zaman ayarlı görüntü kayıt sistemiyle entegre edilmiş nano mikroakışkan akış hücresi kullanarak bakterilerin twitching motilitesinden sorumlu genleri fonksiyonel olarak karakterize etmektir. Bu yöntem, bakterilerin twitching motilitesi gibi bir bakteri fenotipi ve ilişkili gen fonksiyonu hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tekil hücrelerin ve popülasyonların agregasyon migrasyonu için özel ve ayarlanmış bir gözlem imkanı sunmasıdır. Bu prosedürü laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Xiangyang Shi uygulamalı olarak gösterecektir. Standartlaştırılmış bir delesyon stratejisi kullanarak, Temecula wild-type Xylella fastidiosa'yı, pilG delesyon mutantlarını ve komplemanter suşu tamamı PD2 besiyeri agar plaklarında büyütün. Bakterileri 28°C'de inkübe edin.

visualization-twitching-motility-characterization-role-pilg-xylella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hücreli Davranış kaydetme Myxococcus xanthus</emZaman atlamalı Microcinematography kullanarak> Biyofilmler

Protein agregatlarının prion benzeri yayılımı, son zamanlarda birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu protokolün amacı, nematod C. elegans'ın protein yayılımını izlemek ve prion benzeri olayları araştırmak için bir model sistem olarak nasıl kullanılacağını açıklamaktır.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Tip III sekresyon sistemi yoluyla konak hücrelere efektör translokasyonu, gram negatif bakteriler arasında yaygın bir virülans stratejisidir. Translokasyonun kantitatif analizi için beta-laktamaz efektör füzyon bazlı bir test uygulandı. Yersinia ile enfekte olmuş hücrelerde, bir FRET raportörünün beta-laktamaz tarafından dönüşümü lazer tarama mikroskobu kullanılarak izlenir.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Son bulgular, bakteriyel kamçı motorlarının çeşitli çevresel sinyalleri algıladığını ve yanıt olarak yeniden şekillendiğini göstermektedir. Burada tartışılan boncuk tahlillerinin, çevresel stres faktörlerine hücresel adaptasyonda yeniden şekillenmenin rolünü açıklamaya yardımcı olması beklenmektedir.

Kuyruktaki Motor fonksiyonların Biyofiziksel Karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı, fluorescently etiketli T. cruzi şeffaf Zebra balığı larva enjekte ve parazit hareketliliği hafif levha Floresans mikroskobu kullanılarak vivo gözlendi.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Bakteri hücreleri son derece dağınık şekilde düzenlenir. Yavaş büyüyen Myxococcus xanthus hücreler zamanla bu organizasyonda takip etmek için bir tuzak birçok nesiller boyunca yüksek kronolojik zamanmekansal çözünürlük ile floresan canlı hücre görüntüleme için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, kromozom segregasyon ve hücre bölünmesi için önemli proteinlerin kronolojik zamanmekansal dynamics tespit edilemedi.

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'da çeşitli motilite tiplerinde yer alan genetik faktörleri tanımlamak için hızlı ve etkili bir yöntem sunar.

Pseudomonas aeruginosa'da Motilite Fenotiplerini Gözlemlemek için Yüksek Verimli Yöntem

Öğrenin Xylella fastidiosa bakterisinin seğirme hareketliliğini nano-mikroakışkan akış odası kullanarak görselleştirmeyi ve karakterize etmeyi. Bu yöntem, bakteri patojenezindeki hareketlilik mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet