Name: Yöntemler Fare Bcrp1 Alternatif Promoter Kullanımı ve Transkripsiyonal Yönetmeliği Discover (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Keşfedin fare Bcrp1 geninde alternatif promotör kullanımını ve transkripsiyonel düzenlemeyi. Bu yöntem, luciferaz raporlayıcı deneyleri ile promotör işlevselliğini değerlendirmeyi öğretir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Douglas D. Ross ve Gazi İşleri Bölümü&#39;nden Arif Hussain Merit İnceleme Awards tarafından desteklenmiştir.

Fare EST Veritabanı ŞOK Analizi Bcrp1 Alternatif İlk ekson Silico Tahmin 1. Not: Bu protokol tespit etmek genomik dizilere uygun EST dizileri hizalamak nasıl sonra fare ifade dizi etiketi (EST) (içeren öteleme başlangıç ​​yeri) Bcrp1 2. ekson dizisi benzerliği ile EST veritabanı arama ve açıklamaktadır onların Bcrp1 ekson 2&#39;nin 5 &#39;ucuna, fare Bcrp1 geninin konumu. <ol><li> , Ensemble&#39;da Genom Tarayıcı 17 arama penceresine mRNA referans dizisi kimliği (NM_011920.3) girerek fare Bcrp1 ekson 2 dizisini elde tıklayın &quot;GO&quot;. Sonraki ekranda, bir tam boy dizisini (16 ekzon içerir) seçin: <ol><li> Bir sonraki ekranda ( &quot;Transkript tabanlı Display&quot;) olarak, &quot;16 ekzon&quot; i seçin. Bu Bcrp1 tüm ekson dizisi içeren bir ekran belirir. Bcrp1 ekson 2 5 &quot;okuyacak9; -AAAGGC ... TATCAA-3 &#39; &quot;referans 18&#39;de gösterilenlere benzer olacaktır elde edilen sonuçlar.. </li><li> &quot;İndirme dizisi&quot; seçeneğine tıklayın. Sonraki ekranda, FASTA biçimi seçin ve ardından tıklayın &quot;Önizleme&quot;. Sonraki ekranda, panoya ekson 2 Önizleme dizisi kopyalayın. </li></ol></li><li> Biyoteknoloji Bilgi (NCBI) web sitesi 20 Ulusal Merkezi üzerinde ŞOK ana 19 gidin. <ol><li> &quot;Fare&quot; genom seçin. sorgu kutusuna panodan ekson 2 dizisini yapıştırın. </li><li> Veritabanı açılır menüsünden &quot;EST&#39;ler&quot; seçiniz için optimize &quot;son derece benzer dizilerin,&quot; ve sonra seçin &quot;BLAST.&quot; Çalışma süresi birkaç dakika sürer. ŞOK çalışma tamamlandığında, &quot;Sonuçlar&quot; sayfası görünür. </li><li> &quot;Sonuçlar&quot; sayfasının &quot;Açıklamaları&quot; alt başlığı altında (tam &quot;ALL&quot; sonra &quot;İndir&quot; daha sonra &quot;FASTA seçin&quot;Açılır ve sonra seçin&quot; dizisi) Devam &quot;Bir .txt dosyası belirir;., Açık ve panoya tüm dosyayı kopyalamak .txt dosya fare Bcrp1 exon2 yüksek sekans benzerliği ile tüm EST dizileri içerir. ancak ilgili konumları Bcrp1 geninde 2 ekson. Not: 15 Nisan 2015 tarihinde yapılan bir analiz Bcrp1 ekson 2 ile aynı hizada Bunlar Tablo 1&#39;de verilmiştir 14 kemirgen EST&#39;ler belirledi. </li></ol></li><li> Bcrp1 geninde 2 ekson 5 &#39;olan EST dizisinin konumunu belirlemek. fare Bcrp1 gen kromozom 6 contiglere NC_000072.6 (: 372099104 GI) yer almaktadır. <ol><li> &quot;İhtisas Blast&quot; alt başlığı altında ŞOK ana sayfasında, seçme &quot;BLAST (bl2seq) kullanılarak iki (veya daha fazla) dizileri aynı hizaya getirin.&quot; </li><li> sorgu kutusuna panodan metin dosyasını yapıştırın ve konu dizisi kutusuna 372099104 girin. Program kapsamında &quot;son derece benzer dizilerin&quot; için optimizeseçimi ve koşmak ŞOK. </li><li> Sonuçlar penceresi göründüğünde, grafiksel &quot;Hizalamalar&quot; penceresinde &quot;Graphics&quot; üzerine tıklayarak saflaşma görüntüleyin. Sağ ve sol okları kullanın ve Bcrp1 / Abcg2 ve dizi hizalamaları odaklanmak zoom. </li><li> dizi hizalamalarını kaydet: &quot;Açıklamaları&quot; kutusuna &quot;ALL&quot; seçeneğini, ardından &quot;indir&quot; açılır altında &quot;, tablo (CSV) Hit&quot; seçin ve sonra tıklayın &quot;devam ediyor.&quot; Bu dosya Bcrp1 ekson 2&#39;nin dizi sıralaması ve fare kromozom 6 kontigin nükleotidlerin numaralandırılması göre Bcrp1 Exon2 sekans benzerliği Tüm EST sekanslarının dizilimini içerir. Her bir tam EST sekansı Bcrp1 ekson 2 Çakışan diziler de dahil olmak üzere 2 Ekson bölge 5 &#39;ve 3&#39; kapsayan Çoklu hizalamalar oluşturabilir. </li><li> ekson 2&#39;nin 5 &#39;ucunun pozisyonu kromozom 6 kontig&#39;deki 58,655,638 nükleotit karşılık gibi, bu tayin+ 1, ve daha sonra 58,655,638 her EST 5 &#39;kısmi dizilerin konumunu hesaplar. 14 EST&#39;ler için sonuçlar Tablo 1 &#39;de verilmiştir. Not: 5 &#39;potansiyel ilk ekzon olarak (yani, var negatif nükleotid değeri) +1 olan EST dizileri analiz için dikkatli olun. Örneğin, Tablo 1 (AI647825 ve AI664571) &#39;de gösterildiği Bcrp1 ekson 2 ile uyumlu EST&#39;lerin iki kalan sekansı 3 2 Ekson&#39; idi. </li></ol></li></ol> 2. Değerlendirme Bcrp1 Alternatif promotör fonksiyonu <ol><li> Muhabir Tasarım Bcrp1 E1U, E1, E1B ve E1C rehberleri için yapıları <ol><li> EST veritabanı arama elde edilen E1U dizisi kullanarak, +1 olarak E1U ilk 5 &#39;nükleotid belirler. </li><li> bakteriyel yapay kromozom (BAC) yukarı Bcrp1 / Abcg2 konusu gen dizisi ve dizi en az 100 kb içeren fare kromozom 6 klonu eldeBcrp1 / Abcg2 geni (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız). <ol><li> Bu lusiferaz haberci plazmid pGL3-Basic gibi uygun bir raportör vektör belirlemek. </li><li> raportör vektör içinde çoklu klonlama sitesi belirler. Kpnl, Sacl, Mlu1, Nhel, Smal, Xhol, BglII ve HindIII yönlendirme &#39;ila 3&#39; 5 pGL3-Basic vektörüne çok sayıda klonlama bölgesi sınırlandırma endonükleaz bölgeleri vardır. Not: Sindirim sitelerinin dizisi sınırlama enzimleri üreten şirketlerin ürün katalogları edinilebilir. </li><li> E1U ekson tüm sindirim siteleri ve E1U gibi DNA5 gibi yazılım programları kullanarak &#39;2 kb bölgesini 5 tanımlayın. E1U veya 2 kb üst bölgesi bulunmayan pGL3-Basic çoklu klonlama bölgesinin en az iki sindirim belgelerin belirlenmesi. Not: sağlamak için ters primer için seçilen biri yukarı ileriye astar için bir çoklu klonlama sitesi kısıtlama alanı seçtiğinizden emin olun o insert will doğru konumda. </li></ol></li><li> ileri hazırlayın ve ticari gen / primer sentezi hizmetlerini veya astar seçim yazılımı (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) kullanılarak seçilir pGL3-bazik çoklu klonlama sitesi restriksiyon endonükleaz siteleri için dizileri ihtiva PCR için primerler ters. E1U sekansı ve E1U dizisi içinde bir ters primer ~ 2 kb yukanya doğru yer alan bir ön primeri seçin. Yazarların kullanılan primerler &#39;önceki çalışmalarında ileri astar Sacl sitesi ve ters primer bir Nhel sitesi dahil, ve ilk 5 ile +64 yaklaşık -1906 genomik bölgeyi amplifiye&#39; olarak belirtilen E1U ve nükleotid + 1. (yukarıdaki adım 2.1.1) ve referans 16 de verilmiştir. <ol><li> PCR 0.01 BAC ug ile 1, bu primerler kullanılarak E1U genomik bölgeyi yükseltmek ve PCR master karışımı da denatüre ile yüksek sadakat Taq polimerazları (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) içeren30 72 ° C (2 dakika) uzatma sn, PCR daha sonra 35 ila 40 döngü, ve tavlama ve kullanılan primerler erime özelliklerine göre erime sıcaklıkları 95 ° C&#39;dir. Not: yüksek kalitede Taq polimeraz kullanımı yüksek GC içeriğine sahiptir dizi yükseltici bölgeleri için önemlidir. Bu şablon olarak BAC gibi büyük genomik DNA fragmanlarının kullanıldığında, genomik DNA ikincil yapı zor PCR primerleri bağlamak için yapabilir. Bu sorun ortaya çıkarsa, uzun genomik DNA numunesi, PCR reaksiyonundan önce sonikasyon ile hafifçe kesilmiş ise, daha iyi bir PCR sonuçları elde edilebilir. </li><li> % 0.8 TAE agaroz jel elektroforez ile 1 kb DNA merdiveni karşılaştırılarak büyütülmüş PCR ürününün uzunluğunu kontrol edin. </li></ol></li><li> Elde edilen PCR ürünü ve pGL3-Basic vektör Digest, kısıtlama kullanarak ileri sokulan sınırlandırma sindirim siteleri için özel endonükleaz ve ins göre ters primerlerisınırlandırma sindirim enzimleri ile birlikte talimatların. <ol><li> Kit protokolü 21 aşağıdaki ticari SV Jel ve PCR Temizlik-Up Sistemleri kiti (Malzeme ve Ekipman Listesi bölümüne bakınız) kullanarak sindirim reaksiyonlarını arındırın. <ol><li> Agaroz jel elektroforezi kullanılarak kesilmemiş vektör mukayese edilmesi yolu ile vektörünün sindirilmesi ve lineer doğrulama sonra kesme ve sindirilmiş vektör DNA şeridi saflaştırılması. saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonu ve UV spektrometre (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) kullanılarak saflaştırılmış vektör ölçün. </li></ol></li></ol></li><li> Arıtılmış bağlanarak E1U raportör yapıyı hazırlamak, sınır enzimi ile sindirilmiş PCR ürünü ve pGL3-Basic ateşböceği lusiferaz raportör vektörü (haberci deneyi kiti içerisinde bulunan; Malzeme Listesi ve Ekipman bakınız) insert at: 11, 21 ve 31 vektör oranları, böylece E1U r üreten, kit talimatlarına 22 uyarınca &quot;T4 DNA ligaz hızlı bağlama kiti&quot; kullanılarakpGL3-E1U adlandırılan eporter yapısı. <ol><li> klonal TA klonlama kitinde pGL3-E1U aşağıdaki yönergeleri genişletmek için bakteri dönüştürmek için pGL3-E1U plazmid kullanın (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız). </li><li> dizi analizi ile ekin yönünü ve sadakat onaylayın. </li></ol></li><li> Hazırlayın muhabir E1U için benzer bir metodoloji kullanılarak E1, E1B ve E1C için oluşturur. Bölüm 2.1.5.2 olarak dizileme ile ekler doğruluğunu teyit edin. Not: E1, E1B ve E1C için yükseltici ekler olmalıdır yaklaşık -1875 / + 10, -1847 / + 60 ve E1A, E1B ve (+1 olarak adlandırılır) ilk 5 &#39;nükleotid için -1904 / + 83 akraba, sırasıyla, ya E1C. </li></ol></li><li> Haberci deneyi yöntemleri Not: raportör testleri genel bir strateji: bir genin varsayımsal promotörü (5 &#39;yukarı akış bölge), bir &quot;önce bildirilmiştir içeren boş bir&quot; raportör &quot;vektörünün çok sayıda klonlama yerine yerleştirildiğindeçoklu klonlama bölgesinin aşağı akış r geni &quot;(örneğin, ateşböceği lusiferaz). vektör daha sonra ilgili geni eksprese ökaryotik hücrelere transfekte edilir. aktif hale getirin, bu hücrelerde ilgi konusu genin ekspresyonu teşvik trans-etkiyen faktörler transfekte raportör vektör içinde promoter, kolayca ışık yayılması deneyi ile belirlenebilir ateşböceği lusiferaz ekspresyonunu neden olur. <ol><li> muhabir tahlil için kullanılacak uygun hücre satırı seçin. Not: E1U alternatif promoter raportör yapısının aktivitesinin değerlendirilmesi için, E1U promoterinin kontrolü altında Bcrp1 ifade yapısının hücreler içine transfekte etmek gereklidir. TM4 fare sertoli hücre hattı (Malzeme Listesi ve Ekipman bakınız) Bcrp1 proteini ifade ve Bcrp1 mRNA E1U yanı sıra E1, E1B ve E1C 5 içeren. Bir negatif kontrol olarak, Bcrp1 proteini veya mRNA ifade etmeyen bir hücre çizgisi kullanılarak düşünün. </li><li> TM4 ce Kültür200,000 hücrelik bir başlangıç ​​yoğunluğunda / oyuk bir 1, 24 oyuklu plakalarda LLS: Ham F12 ortamı 1.2 g / L sodyum bikarbonat ile Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı 1 karışımı, 15 mM Hepes,% 5 at serumu ile takviye edilmiş,% 2.5 Daha önce tarif edildiği gibi 5, 37 ° C,% 5 CO2 de cenin sığır serumu, penisilin (100 lU / ml) ve streptomisin (100 ug / ml),. </li><li> Altı saat kültürde hücrelerin yerleştirdikten sonra, boş bir pGL3-bazik vektörünün 0.2 ug veya -1906 / + 64 E1U ya -1875 / + 10 E1A ve -1847 / + 60 E1B ihtiva eden pGL3 vektörü 0.2 ug hücreleri transfekte ya da -1904 / + 83 E1C BCRP 1 silme ticari DNA transfeksiyon kiti ve üreticinin protokolü 23 kullanılarak, iç kontrol olarak pRL-TK (a Renilla lusiferaz ifade vektör) 4 ng ile birlikte inşa (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) . </li><li> 30 saat aşağıdaki transfeksiyon, Kültür gelen büyüme ortamı çıkarınEd hücreleri transfekte edildi. 200 ul PBS ile bir kez hücreler yıkanır, daha sonra yıkama çözeltisi çıkarın. <ol><li> Ateşböceği ölçün ve Renilla lusiferaz aktivitesi, üreticinin protokollerine 24&#39;e ait bir ticari kit kullanılarak. </li></ol></li><li> İç (Renilla lusiferaz) kontrol bölünmesiyle ateşböceği lusiferaz aktivitesi oranı olarak her bir tüp için aktivitesinin; Her raportörünün aktivitesi, 1 değeri verilir boş pGL3 basit vektör ile transfekte edilmiş olan hücrelerin edilene göre inşa Genel olarak sonuçları genellikle ifade edilmiştir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+of+transcriptional+modulation%3A+large-scale+identification+and+characterization+of+putative+alternative+promoters+of+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes.</a> Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).</li>
<li>Doyle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidrug+resistance+transporter+from+human+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).</li>
<li>Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+breast+cancer+resistance+protein+%28BCRP%2FABCG2%29+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance.</a> Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).</li>
<li>Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+resistance+protein+%28Bcrp%29+and+the+testis--an+unexpected+turn+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events.</a> Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcrp1+transcription+in+mouse+testis+is+controlled+by+a+promoter+upstream+of+a+novel+first+exon+%28E1U%29+regulated+by+steroidogenic+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).</li>
<li>Maliepaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+and+distribution+of+the+breast+cancer+resistance+protein+transporter+in+normal+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues.</a> Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).</li>
<li>Fetsch, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+ABCG2+mitoxantrone+resistance-associated+protein+in+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues.</a> Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).</li>
<li>Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+of+breast+cancer+resistance+protein+in+microvessel+endothelium+of+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain.</a> Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).</li>
<li>Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+ABCB1+and+ABCG2+in+human+placental+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue.</a> Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).</li>
<li>Xiong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2+is+upregulated+in+Alzheimer%27s+brain+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+may+act+as+a+gatekeeper+at+the+blood-brain+barrier+for+Abeta%281-40%29+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides.</a> J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).</li>
<li>Woodward, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+urate+transporter%2C+ABCG2%2C+with+a+common+functional+polymorphism+causing+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).</li>
<li>Huls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+resistance+protein+transporter+ABCG2+is+expressed+in+the+human+kidney+proximal+tubule+apical+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane.</a> Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).</li>
<li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+5%27+untranslated+region+variants+of+BCRP+mRNA+are+differentially+expressed+in+drug-selected+cancer+cells+and+in+normal+human+tissues%3A+implications+for+drug+resistance%2C+tissue-specific+expression%2C+and+alternative+promoter+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage.</a> Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).</li>
<li>Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+alternative+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by alternative promoters.</a> FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).</li>
<li>Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mouse+Abcg2+mRNA+during+hematopoiesis+is+regulated+by+alternative+use+of+multiple+leader+exons+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters.</a> J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).</li>
<li>Natarajan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+major+alternative+promoter+regulating+Bcrp1%2FAbcg2+expression+in+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine.</a> Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).</li>
<li>Ensembl Genome Browser. , 
 <a target="_blank" href="http://Ensembl.org">http://Ensembl.org</a> (2015).</li>
<li>Transcript-based Display from Ensembl. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822">http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822</a> (2015).</li>
<li>Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , 
 <a target="_blank" href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome</a> (2015).</li>
<li>National Center for Biotechnology Information (NCBI). , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov">http://www.ncbi.nlm.nih.gov</a> (2015).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wizard%C2%AE+SV+Gel+and+PCR+Clean-Up+System+-+INSTRUCTIONS+FOR+USE+OF+PRODUCT%22">Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT</a>. , (2009).</li>
<li>New_England_Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Ligation+Kit+Protocol+-+M2200S%22">Quick Ligation Kit Protocol - M2200S</a>. , (2014).</li>
<li>Roche. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22XtremeGENE+HP+DNA+Transfection+Reagent+Protocol+-+Manual+version+1.0%29%22">XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0)</a>. , (2010).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Protocol+for+the+use+of+the+Dual-Luciferase+Reporter+Assay%22">Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay</a>. , (2009).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>VanBuren, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+verification%2C+and+initial+annotation+of+the+NIA+mouse+7.4K+cDNA+clone+set%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set.</a> Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).</li>
<li>Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+and+subtraction%3A+two+approaches+to+facilitate+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery.</a> Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).</li>
<li>Okazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+mouse+transcriptome+based+on+functional+annotation+of+60%2C770+full-length+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs.</a> Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).</li>
<li>Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+controls%3A+the+role+of+alternative+promoters+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes.</a> Trends Genet. (11), 640-648 (2009).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
</ol>

Douglas D. Ross ve University of Maryland, Baltimore, insan BCRP patent haklarına sahip.

Sunulan yöntem ve Örnek sonuçların çoğu, 2013 5 yayımlanan &quot;fare testis B crp1 transkripsiyon yukan steroidojenik faktör-1 ile düzenlenir, yeni bir birinci ekson (E1U) &#39;in bir promoter tarafından kontrol edilir&quot; başlıklı daha önceki çalışmaları tarif edilmektedir . burada gösterilen Örnek sonuçlarına ek olarak, önceki kağıt 5&#39;-RACE PCR ve RT-PCR yöntemi kullanılarak, alternatif birinci ekson kullanımı tahmin sağladı. Bundan başka, in siliko yukan E1U gelen promotör bir vars...

Daha insan genlerinin yarısı alternatif rehberleri 1 düzenlenir. Her alternatif promotör alternatif rehberleri bu farklı olabilir düzenleyici unsurları içerebilir. bir doku kullanılan hızlandırıcı (lar) başka bir doku kullanılanlardan farklı olabilir. Örneğin, belirli bir sinyal yolunun aktivasyonu bir dokuda kullanılan bir genin alternatif promoter tetikler, ancak hiçbir etkisi yoktur veya başka bir dokuya kullanılan aynı geni için, ayrı bir alternatif promoter bastırmak mümkündür. Bcrp1 geninin ekspresyonu, alternatif promotörler tarafından yönetilir. Bcrp1 insan göğüs kanseri direnç proteini (BCRP) genin fare ortolog olan. BCRP ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcı, resmi olarak belirlenen ABCG2 2, 3. bir tepe plazma zar proteini olarak, BCRP / Bcrp1 fonksiyonları doğal ve ksenobiyotik alt tabakalar çeşitli akıttığı <sup&gt; 3, 4. 12 - İnsan ve farelerde, BCRP / Bcrp1 yüksek örneğin plasenta, beyin ve testis 2, 5 kan doku bariyerleri karaciğer (safra kanalcıklarının), bağırsak ve böbrek gibi organların farmakolojik olarak ilgili organlar olarak ifade edilir. Hematopoietik ve kanser kök hücreleri dahil olmak üzere diğer kök hücreler, içinde BCRP / Bcrp1 ifadesi ksenobiyotiklere ve kanser kemoterapötik ilaçları 3, bu hücrelerin direnci kazandırabilmektedir. Normal ve neoplastik hücrelerde BCRP ekspresyonunun düzenlenmesi anlamak için ilk çalışmada, cDNA uçlarının (5&#39;-RACE) BCRP mRNA analizi 5 &#39;hızlı amplifikasyonu onun tam transkripsiyon başlangıç ​​bölgesinin 13 belirlemek için yapıldı. Sadece bulundu birden transkripsiyon başlangıç ​​siteleri vardı; Ayrıca BCRP de çevrilmemiş ilk ekson, üç alternatif formları vardı karşılaştı. Bu alternatif, ilk ekson - E1 belirlenen, E1B, E1C - insan dokularının çeşitli farklı ifade edildi. İki ek birinci ekson varyantları BCRP 13 ikinci ekson kullanılarak insan EST veritabanının bir BLAST arama keşfedildi. Dört maç yukarı E1u belirlenmiştir ekson 2 birinci ekson&gt; 70 kb ortaya; diğer dört maç E1- 13 belirlenmiştir tamamen ilk ekson yoksun BCRP mRNA, ortaya çıkardı. Alternatif lider ekzon varlığı alternatif promotör kullanımı 14 bir tezahürü olarak kabul edilir. Farelerde, Bcrp1 dört alternatif ilk ekson farklı fare dokularda BCRP 1 transkripsiyonu yöneten alternatif rehberleri karşılık gelebilir o tarif edilmektedir; Bu ekzon / promoterler E1U, E1A, E1B ve E1C belirlenir ve yaklaşık olarak konumlanmış 70, Bcrp1 ekson 2 5, 15 ile üst baş 58, 15 ve 5 kb. E1A mRNA izoform murin baskın olduğu bulunmuşturE hematopoietik kök hücreler, kalp, akciğer, dalak ve beyin, E1B izoformu kemik iliği 5, 15 fare bağırsak, cenin karaciğer hücreleri ve eritrosit öncü hücrelerin ifade görülebilecektir. yukan E1B hızlandırıcıdır fosfo-siklik-AMP yanıt elemanı bağlayıcı protein (p-CREB) ve alternatif özgü bir CREB tepki elemanı, en azından kısmen regüle fare bağırsak Bcrp1 transkripsiyonu düzenleyen önemli bir alternatif promoter olduğu gösterilmiştir Bcrp1 destekleyicisi 16. E1C mRNA isoformudur Yetişkin fare karaciğer ve böbrek 5 olarak ifade edilir. E1U izoformu da 5 ifade baskın izoformdur murin testis haricinde test edilen pek çok dokuda tespit edilemez. Bcrp1 (geç evre spermatid 4 koruyabilir seminifer endotel olarak) hem somatik (endotel sıkı kavşaklar, peritübüler Miyoid hücreleri ve Sertoli hücrelerinde) ve germ hücreleri bulunan sıçan testis olarak ifade edilmiştir. regyukan E1U iyon steroidojenik faktörü-1 (SF-1) 5 için işlevsel bir tepki elemanı içerir. Bcrp1 mRNA ve protein belirgin sıçangil Sertoli hücrelerinde Bcrp1 sentezleme SF-1 5 tarafından kontrol edildiğini düşündüren, Sertoli hücreye spesifik SF-1 nakavt fareler testislerde azaltılır. Detay yöntemleri sunulan protokoller de-silisyum Bcrp1 alternatif ilk ekson tespit etmek ve yukarı tespit alternatif ilk ekzon gelen varsayılan proje sahipleri için lusiferaz tabanlı muhabiri deneyleri kurmak.

<table><tbody><tr><td colspan="4">TİCARİ BİYOLOJİK MALZEMELER VE KİTLER:</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE kiti</td><td>Ambion Inc., Austin, TX, şu anda Life Technologies</td><td>AM1700</td><td>5'-RACE PCR kiti</td>aracılığıyla temin edilebilir</tr><tr><td>TOPO TA klonlama kiti</td><td>Life Technologies</td><td>K450001</td><td>Bu kit, TOP10 kimyasal olarak yetkin E. coli bakterilerini içerir.</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz hızlı ligasyon kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart yüksek kaliteli Taq-DNA polimeraz</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>Yüksek kaliteli bir Taq polimeraz enzim karışımı içerir</td></tr><tr><td>XtremeGENE HP DNA transfeksiyon reaktifi</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Çift lusiferaz raportör tahlil kiti</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>pGL3-bazik boş raportör vektörünü (ateşböceği lusiferaz), pRLTK renilla lusiferaz eksprese eden vektörü ve diğer kontrol vektörlerini içerir.</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Plazmid miniprep için - bakteri kolonilerinden plazmit DNA'nın izolasyonu ve saflaştırılması</td></tr><tr><td>pCR2.1 vektör</td><td>TOPO TA klonlama kitinin</td><td></td><td></td>bir parçası</tr><tr><td>pGL3-bazik lusiferaz içeren vektör</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK Renilla lusiferaz ifade eden vektör</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyel yapay kromozom</td><td>BACPAC Kaynakları Merkezi, Çocuk s Hastanesi Oakland Araştırma Enstitüsü, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 ve RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">REAKTİFLER/KİMYASALLAR/MEDYA/MALZEMELER</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbazı&reg; SV Jel ve PCR Temizleme Sistemi&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Restriksiyon endonükleazları ile sindirimi takiben PCR ürünlerini saflaştırmak için kullanışlıdır</td></tr><tr><td>CRYOVIALS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl software</td><td>Ensembl projesi</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>Ensembl projesi, omurgalılar ve diğer ökaryotik türler için genom veri tabanları üretir ve bu bilgileri çevrimiçi olarak ücretsiz olarak erişilebilir hale getirir.</td></tr><tr><td>Patlama yazılımı</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Ağ& PAGE_TYPE=BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3 yazılımı</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>5'-RACE PCR</td></tr><tr><td>NCBI Nükleotid veritabanı</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CELL LINES: </td></tr><tr><td>TM4 murin Sertoli hücreleri</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715 ve ticaret;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>Bu, nispeten ucuz, manuel olarak çalıştırılan bir luminometredir. Aynı üreticiden 96 kuyulu plaka kullanan otomatik sistemler de mevcuttur.</td></tr><tr><td>NanoDrop spektrofotometreleri</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Spektrofotometre, çok küçük miktarlarda numune</td></tr><tr><td>DU 800 UV/VIS spektrofotometresi ve Nükleik Asit Analizi II yazılımı</td><td>BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr> kullanabilir</tbody></table>

yöntemler fare bcrp1 alternatif promoter kullanımı ve transkripsiyonal yönetmeliği discover

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Genellikle çevrilmemiş - - birinci ekson, farklı dokularda gen ekspresyon genellikle özgü mRNA&#39;nın sentezinde neden alternatif promotörler tarafından kontrol edilir. E1U, E1A, E1B ve E1C: Bcrp1 (Abcg2), ABC taşıyıcı Meme Kanseri direnç proteini (BCRP, ABCG2) murin ortolog üretilen karşılık gelen dört alternatif ilk ekson tarafından belirlenmiş olan en az dört alternatif promotörler vardır. Burada, içi siliko protokolleri Bcrp1 alternatif promoter kullanımı tahmin etmek için sunulmuştur. Ayrıca, haberci deneyi yöntemleri alternatif promotörleri için haberci yapıları üretmek ve yukan tanımlanan alternatif ilk eksondan putatif promoterlerin özelliğe belirlemek için tarif edilmiştir.

Lider ekson analizi ile fare testisi içinde BCRP 1 alternatif promotör kullanımının tanımlanması NCBI EST veritabanı Protokol 1 &#39;de açıklanan aşamalara göre (2015 Nisan) problanmıştır zaman, EST Genomik konumlan ile birlikte, 1 mRNA Tablo 1&#39; de gösterilmiştir BCRP ekzon 2 5 &#39;ucund...

Örneğin, kemirgen ABC transportörlerin Bcrp1 (Abcg2) ile, in-siliko protokolleri fare dokularda eksprese edilen genlerin alternatif promoter kullanımı tespit etmek için, ve raportör tahlilleri kullanılarak belirlenen alternatif promoterlerin özelliğe değerlendirmek için sunulmaktadır.

Yöntemler Fare Bcrp1 Alternatif Promoter Kullanımı ve Transkripsiyonal Yönetmeliği Discover

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Bu protokol setinin genel amacı, Bcrp1 gibi bir genin mRNA'sındaki alternatif ilk ekzonları tespit etmek ve tanımlanan alternatif ilk ekzonların yukarısındaki varsayılan promoterler için lusiferaz tabanlı raporlayıcı assayler kurmaktır. Kullanılan in-silico yöntemler, mRNA ekspresyonunun farklı dokularda nasıl kontrol edildiği gibi transkripsiyon ve regülasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgi duyulan genin mRNA'sındaki alternatif ilk ekzonları belirlemek için halka açık genetik verileri kullanmasıdır; bu durum alternatif promoter kullanımına işaret eder.Reporter konstrüktlerini hazırlayan ve reporter assay'leri gerçekleştiren bu yöntem, varsayılan alternatif promotörlerin fonksiyonel aktivitesi gibi gen düzenleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, mRNA referans dizi kimliğini Ensembl genom tarayıcısının arama penceresine girerek fare Bcrp1 ekzon 2 dizisini elde edin ve Git'e tıklayın. Ardından, 16 ekzon içeren tam uzunluktaki bir diziyi seçin. Diziyi İndir seçeneğine tıklayın.Ardından, FASTA formatını seçin ve Önizleme'ye tıklayın. Bir sonraki ekranda, ekzon 2'nin önizleme dizisini panoya kopyalayın. NCBI web sitesindeki blast ana sayfasına gidin.Mouse genomunu seçin. Panodaki ekzon 2 dizisini sorgu kutusuna yapıştırın. Ardından, Veritabanı açılır menüsünden EST'leri seçin.Yüksek derecede benzer diziler için optimize edin ve ardından BLAST'ı seçin. BLAST çalışması tamamlandığında sonuçlar sayfası görünecektir. Sonuçlar sayfasındaki Açıklamalar alt başlığı altında Tümünü seçin, ardından İndir'e tıklayın, açılır menüden FASTA'yı seçin ve ardından Devam Et'e tıklayın.Bir txt dosyası belirecektir. Dosyayı açın ve tüm içeriğini panoya kopyalayın. Bcrp1 genindeki ekzon 2'nin beş ucunda yer alan EST dizisinin konumunu belirlemek için, BLAST ana sayfasındaki Specialized BLAST alt başlığı altında, Align two sequences using BLAST seçeneğini seçin.Pano üzerindeki metin dosyasını sorgu kutusuna yapıştırın ve Konu Dizisi kutusuna 372099104 yazın. Program Seçimi kısmında Highly similar sequences seçeneği için optimize edin ve BLAST'ı çalıştırın. Sonuçlar penceresi açıldığında, Hizalamalar penceresindeki Graphics seçeneğine tıklayarak hizalamaları grafiksel olarak görüntüleyin.Bcrp1/ABCG2'ye ve sekans hizalamalarına odaklanmak için sağ ve sol okları ve yakınlaştırmayı kullanın. Ardından, Açıklamalar kutusunda Tümünü seçerek sekans hizalamalarını kaydedin. İndir açılır menüsü altından Hit Tablosu'nu seçin ve ardından Devam Et'e tıklayın.Ekzon 2'nin beşinci uç konumunun kromozom altı contig'indeki 58, 655, 638 numaralı nükleotide karşılık gelmesi nedeniyle, burayı artı bir olarak belirleyin ve ardından her bir EST'nin 58, 655, 638'den beşinci uca doğru olan kısmi dizilerinin konumunu hesaplayın. Bu prosedürdeki kritik bir adım, birden fazla ilk ekzonun tahmin edilmesidir. Böylece alternatif promotorlar burada tanımlanır.EST veri tabanından elde edilen E1U dizisini kullanarak, E1U'nun ilk beş prim nökleotidini artı bir olarak belirleyin. Bcrp1/ABCG2 gen dizisini ve Bcrp1/ABCG2 geninin en az 100 kilobaz yukarısındaki diziyi içeren bir fare kromozom altı geri klonu elde edin. Ardından, lusiferaz rapor plazmidi pGL3-Basic gibi uygun bir rapor vektörü belirleyin.Reporter vektördeki çoklu klonlama bölgelerini belirleyin. KpnI, SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI, BglII ve HindIII, pGL3-Basic vektörünün çoklu klonlama bölgesindeki restriksiyon endonükleaz bölgeleridir ve beş prime'dan üç prime yönünde sıralanmışlardır. Ardından, E1U ekzonunun yukarısındaki iki kilobazlık bölgeyi seçin, diziyi DNA5'e yapıştırın ve ardından programı çalıştırın.Tekli ve çoklu kesim bölgelerinin detayları görüntülenecektir. Ardından, E1U bölgesindeki kesim bölgeleri listesini, pGL3-Basic vektöründeki MCS ile bir excel sayfasında karşılaştırın. Sonrasında, ticari gen primeri sentez servislerini veya primer seçim yazılımlarını kullanarak, restriksiyon endonükleaz bölgeleri içeren PCR için ileri ve geri primerleri hazırlayın.E1U dizisinin yaklaşık iki kilobaz yukarısında yer alan bir ileri primer ve E1U dizisi içerisinde yer alan bir geri primer seçin. Ardından, bu primerleri, 1 µg Bak DNA'sı ve yüksek sadakatli taq polimeraz içeren PCR Master Mix ile PCR 01 kullanarak E1U genomik bölgesini amplifiye edin. Sonrasında, amplifiye edilen PCR ürününün uzunluğunu, %0,8 TAE agaroz jel elektroforezi ile 1 kilobazlık DNA merdiveni ile karşılaştırarak doğrulayın.Ardından, elde edilen PCR ürününü ve pGL3-Basic vektörünü, ileri ve geri primerlere eklenen restriksiyon kesim bölgelerine özgü restriksiyon endonükleazları kullanarak sindirin. Daha sonra, PCR ürününün sindirimini agaroz jel elektroforezi ile doğrulayın. Sindirilmiş vektör DNA'sını ve iki kilobazlık PCR bandını agaroz jelden kesin.Ardından, sindirilmiş vektör DNA'sını ve iki kilobaslık PCR bandını, ticari bir SV jel ve PCR temizleme sistemleri kiti kullanarak jel dilimlerinden izole edin. Saflaştırılmış PCR ürününün ve saflaştırılmış vektörün konsantrasyonunu UV spektrometrisi ile ölçün. Sonrasında, saflaştırılmış restriksiyon enzimi ile sindirilmiş PCR ürününü ve pGL3-Basic ateş böceği lusiferaz raporlayıcı vektörünü, T4 DNA ligaz hızlı ligasyon kiti kullanarak ligleyerek pGL3 E1U olarak adlandırılan E1U raporlayıcı konstrüktünü hazırlayın.Bu adımda, TM4 hücrelerini 24 kuyucuklu plaklarda, kuyucuk başına 200,000 hücre başlangıç yoğunluğunda kültüre edin. Hücreler kültüre alındıktan altı saat sonra, hücreleri 0.2 µg MP pGL3-Basic vektörü veya 0.2 µg pGL3 vektörü ile birlikte iç kontrol olarak 4 ng pRL-TK kullanılarak transfekte edin. Transfeksiyondan otuz saat sonra, transfekte edilen hücrelerin büyüme besiyerini uzaklaştırın.Hücreleri PBS ile yıkayın ve ardından yıkama solüsyonunu uzaklaştırın. Bundan sonra, ticari bir kit kullanarak firefly ve Renilla lusiferaz aktivitesini ölçün. Her bir tüp için aktiviteyi, firefly lusiferaz aktivitesinin iç kontrole bölünmesiyle elde edilen oran olarak ifade edin.Bu adım, testis spesifik promoterin fonksiyonel aktivitesini doğrular. Burada, tamamen hücre türevli TM4 hücrelerinde Bcrp1 promoterleri E1U, E1A, E1B ve E1C için gerçekleştirilen reporter assay sonuçları yer almaktadır. Veriler, ateş böceği lusiferaz luminesansının Renilla lusiferaz değerine normalize edilmesiyle ifade edilmiştir.Yıldız işareti, MP pGL3 vektör kontrolünden anlamlı bir fark olduğunu belirtir. Bu grafik, Bcrp1 E1U raporcu yapısındaki SF-1 yanıt elementinin mutasyonunun lusiferaz aktivitesi üzerindeki etkilerini göstermektedir. Muhtemel SF-1 bağlanma bölgesine sahip Bcrp1 raporcu yapıları, SF-1'in zorunlu ekspresyonu ile veya bu ekspresyon olmadan TM4 hücrelerine transfekte edilmiştir.Şekilde, a boş vektör pGL3 kontrolüne göre anlamlı bir farkı; b ise vektör transfekte edilen hücrelerde E1U promoter yapısına kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir farkı belirtmektedir. Bu prosedür uygulanırken, reporter assay için uygun bir hücre hattı seçmenin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Hüçre hattı, reporter yapısındaki promoter kontrolü altında ilgili geni eksprese etmelidir.Bu prosedürün ardından, birden fazla doku örneğinde alternatif promotör kullanımının değerlendirilmesini kolaylaştırmak için kantitatif RT-PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen bir gen için alternatif promotör kullanımının nasıl öngörüleceği ve söz konusu promotörün işlevselliğinin nasıl belirleneceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.

methods-to-discover-alternative-promoter-usage-transcriptional

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Genetik raportör testi, DNA dizileri ve gen düzenleyici aktiviteleri arasındaki ilişkiyi incelemek için iyi kurulmuş ve güçlü bir araçtır. Aday düzenleyici elemanların, tanımlayıcı dizi etiketlerini taşıyan raportör genlere bağlanması, bu tahlillerin büyük ölçüde paralelleştirilmesini sağlar.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

DNA arttırıcılar gibi düzenleyici elemanlarının Gen ifadesinin fiziksel olarak hedef gen rehberleri, sık sık büyük genomik mesafeleri kapsayan uzun menzilli kromozom etkileşimleri aracılığıyla irtibata geçerek kontrol. Organizatörü yakalama Hi-C (PCHi-C) hedef genleri için potansiyel yasal sıralarının atama etkinleştirme rehberleri ve distal bölgeler arasındaki önemli etkileşimler tanımlar.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

Burada içinde protein var koşullu olarak ters bir baskın negatif mutant yorum overexpressing tarafından inaktive bir baskın negatif indüklenebilir sistemi geliştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA ribonükleoprotein komplekslerinin doğrudan teslimi hematopoetik hücrelerde genom düzenleme için hızlı ve etkili bir araçtır. Burada, bir RUNX1 intronic susturucu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde transkripsiyonel yanıtları incelemek için bu yaklaşımı kullanır.

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Keşfedin fare Bcrp1 geninde alternatif promotör kullanımını ve transkripsiyonel düzenlemeyi. Bu yöntem, luciferaz raporlayıcı deneyleri ile promotör işlevselliğini değerlendirmeyi öğretir.

Yöntemler Fare Bcrp1 Alternatif Promoter Kullanımı ve Transkripsiyonal Yönetmeliği Discover

Daha fazla video keşfet