Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Optogenetiği donma-kırık replika immünoetiketleme tekniği ile birleştiren bu prosedürün amacı, fare amigdalasındaki sinapslardaki iyonotropik glutamat reseptörlerinin yoğunluğunu, tanımlanmış ön ve son sinaptik elementlerle analiz etmektir. Bu donma-kırılma replika immünoetiketleme tekniğinin yüksek tekrarlanabilirliği ve çok yönlülüğü, optogenetik ile birleştirildiğinde, sinapsların yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili analizi için çok güçlü bir yaklaşım sunar. Bu prosedürün ana avantajları şunlardır: sinaptik öncesi ve sonrası elemanların düzlemsel görünümü ve bu özel mikro alanlardaki proteinlerin kantitatif analizi.

İntegral membran proteinlerinin dağılımını ve organizasyonunu incelemek için çeşitli farklı dokulara farklı teknikler uyarlanabilir. Genel olarak, bu kombine optogenetik FRIL yaklaşımı, gereken çok çeşitli farklı aparat ve makineler nedeniyle yeni başlayanlar için zordur. Modülasyona farklı yöntemlerle başlamak, diğer bazı adımların öğrenilmesi zor olduğu için çok önemlidir.

Dondurulmuş numunelerin kırılması ve çoğaltılması gibi: Bu işleme başlamak için, fare beyninin bir koronal bloğunu vibro dilimleyicinin tutucusuna yapıştırın. Doku bloğunu, neo-korteks titreşimli bıçağa bakacak şekilde yönlendirin. Daha sonra, amigdala içeren koronal bölümleri 140 mikrometre kalınlığında sıfır nokta bir azı dişi, buz gibi soğuk PB'de dilimleyin. Ve onları aynı tamponda altı oyuklu bir tabakta toplayın.

Stereo mikroskop altında, silikon elastomer ile kaplanmış ve sıfır nokta bir molar PB ile doldurulmuş bir petri kabında dilimlerden ilgilenilen bölgeyi kesin. Ardından, kesilmiş bloğu kriyo koruma solüsyonuna aktarın ve gece boyunca altı santigrat derecede tutun. Bu adımda, bakır taşıyıcıları, leke giderici olarak sahte deri tabakası ile parlatarak FRIL prosedürünün ardışık aşamalarında kullanılmak üzere hazırlayın. Mikroskop altında, kesilmiş blok için tutma kuyusu görevi görecek olan bakır taşıyıcıya bir çift taraflı bant halkası takın.

Ardından, kesilmiş bloğu bir platin tel halka kullanarak çift taraflı bandın deliğine yerleştirin. Bir filtre kağıdı veya fırça kullanarak fazla kriyoprotektan solüsyonunu çıkarın. Daha sonra, tutma taşıyıcısını başka bir taşıyıcı ile örtün.

Böylece doku bloğu iki taşıyıcı arasına sıkıştırılır. Numuneyi dondurmak için, taşıyıcı sandviçi numune tutucuya yerleştirin. Daha sonra, numune tutucuyu yüksek basınçlı dondurma ünitesine yerleştirin.

Jet otomatik düğmesine basarak dondurma döngüsünü başlatın, numune tutucuyu hemen çıkarın ve ucu sıvı nitrojen içeren yalıtımlı bir kutuya daldırın. Ardından, taşıyıcı sandviçi numune tutucusundan dikkatlice çıkarın ve önceden soğutulmuş bir kriyoviyal içine yerleştirin. Taşıyıcıları içeren kriyoviyalleri replikasyona kadar bir kriyotankta saklayın.

Elektron ışını tabancasını takmadan önce, deflektör plakası ile kalkanı çıkarın. Filamenti ortalamak için ayar göstergesini alt katot kapağından pens aynasına yerleştirin. Ardından, basınç laminaları filamentin uçlarını sıkıştırana kadar yeni filamenti göstergenin üzerine kaydırın.

Ardından ayar göstergesini çıkarın ve karbon çubuğu yerleştirin. Evaporatör çubuk tutucusunun pens aynasını sıkarak sabitleyin. Çubuğun ucunun yüksekliğinin alttan ikinci bobinin ortasında olduğundan emin olun.

Bundan sonra, deflektör plakasını değiştirin ve elektron ışını tabancasını donma-kırma ünitesine yerleştirin. Bu prosedürde, buharlaşma için akımı ve voltajı ayarlayın. Ardından, donmuş taşıyıcı sandviçi sıvı nitrojen içindeki çift çoğaltma masasına yerleştirin.

Daha sonra, çift replika tablasını Dewar kabına aktarın ve 45 derecelik bir açıyla numune aşaması alıcısına sabitleyin. Bir masa manipülatörü ile çift kopyalı masayı alın. Donma-kırılma ünitesine soğuk aşamaya yerleştirin ve çift çoğaltma tablasının sıcaklığının eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmasına izin vermek için yaklaşık 115 dakika bekleyin.

Daha sonra, çift çoğaltma masasının üzerindeki örtüye bağlı olan tekerleği saat yönünün tersine manuel olarak çevirerek dokuyu kırın. Örtü döndüğünde, çift kopya masayı açılmaya zorlar ve bu da dokunun kırılmasına neden olur. Kırık yüzeylere 90 derecelik bir açıyla bir karbon tabakası uygulanır.

Daha sonra, çoğaltılmış örnekleri çift çoğaltma tablosundan çıkarın ve bunları TBS ile doldurulmuş seramik 12 oyuklu bir plakaya aktarın. Bir platin halkalı filmaşin kullanarak, kopyalanan dokuyu örnek taşıyıcıdan çıkarın. SDS sindirimi için, bir mililitre SDS-sindirim tamponu ile doldurulmuş dört mililitrelik bir cam şişeye bir kopya aktarın.

Çalkalayarak 80 derecede 18 saat sindirilmesine izin verin. İmmün etiketleme için, kopyayı taze SDS sindirim tamponunda 10 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, 24 ila 72 saat boyunca 15 santigrat derecede nemli bir odada% 2 BSA-TBS içinde seyreltilmiş birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edin.

Bundan sonra, replikayı form-uzak kaplamalı, 100 satırlık paralel çubuk ızgarasına monte edin. Kopyayı 80 veya 100 kilo-voltta bir transmisyon elektron mikroskobu ile görüntüleyin. Ardından, dijital görüntüleri bir CCD kamera aracılığıyla elde edin.

Çevrimdışı olduğunda, farklı yer işaretlerini kullanarak kopyadan görüntüdeki ilgili bölgeleri bulun. AAV enjeksiyonundan dört hafta sonra, posterior talamik nükleer grupta Channelrhodopsin-2'yi eksprese etmek için, Channelrhodopsin-2, amigdala interkalasyonlu hücre kütlelerine ulaşmak için talamik aksonlar boyunca anterograd olarak etkili bir şekilde taşınır. Glutamaterjik sinapsların post-sinaptik uzmanlaşması, bir kopyada, plazma zarının E-yüzünde bir zar içi parçacık kümesi olarak tanınabilir ve genellikle presinaptik elemanının P-yüzü eşlik eder.

Burada, Channelrhodopsin-2 ve glutamat reseptörleri, ikincil antikorlara konjuge edilmiş farklı boyutlarda altın parçacıkları kullanılarak görüntülendi. Postsinaptik membranın interkalasyonlu nöronlara ait olup olmadığını aynı kopya üzerinde tespit etmek için yapısal veya moleküler araçların bulunmaması nedeniyle. Karşılık gelen replika, bu nöronlar için bir belirteç olan mu opioid reseptörleri için etiketlendi.

Bu sinapslardaki glutamat reseptör yoğunluğunun kantitatif analizine bir örnek olarak, burada ampa reseptörleri için altın parçacıklarının sayısının dikenler ve dendritler üzerindeki sinaptik alana karşı dağılım grafikleri verilmiştir. Bu da her iki yapıda da pozitif bir korelasyon ortaya koymaktadır. Bu prosedürü denerken, bireysel adımların birbirine oldukça bağımlı olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, adımlardan birindeki bir hata tüm prosedürü tehlikeye atabilir. Plazma zarı uzmanlıklarının büyük bir bölümünü replikanın iki boyutlu bir yüzeyinde görüntülemek, seri artrofin kesitlerinin zahmetli ve zaman alıcı yeniden inşası olmadan ilgilenilen moleküllerin uzamsal dağılımının ve fiziksel sürekliliğinin incelenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, diğer araştırmacılar tarafından nöral devrelerdeki belirli sinapsların yapı-işlev ilişkileri hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir.

Girdilerin kökenini ve postsinaptik elementlerin doğasını çözdüğü yer. Bu çok önemli ama bir konu.