Name: Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin fare amigdalasında iyonotropik glutamat reseptörlerinin yoğunluğunu optogenetik ve donma-fraktür çoğaltma immün etiketleme ile analiz etme yöntemini. Bu teknik sinaptik yapı ve fonksiyon ilişkilerini nicel olarak incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman, Avusturya Bilim Fonu FWF hibe No. P-22969-B11 tarafından F. Ferraguti'ye, Charitable Hertie Vakfı ve Werner Reichardt Bütünleştirici Sinirbilim Merkezi ve DFG (CIN-Exc. 307) tarafından I. Ehrlich'e sağlanmıştır.

<ol><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes%3A+practical+procedure%2C+interpretation+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li>
<li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li>
<li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver%2C+brain%2C+and+spinal+cord%3A+factors+limiting+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li>
<li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li>
<li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li>
<li>Rollenhagen, A., Lübke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+excitatory+central+synapses%3A+from+structure+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li>
<li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li>
<li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li>
<li>Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li>
<li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure%2C+size%2C+ionotropic+receptor+expression%2C+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li>
<li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li>
<li>Jüngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction%3A+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628(2016).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li>
<li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li>
<li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li>
<li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li>
<li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li>
<li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFukazawa%2C+Y+%22Handbook+of+Cryo-Preparation+Methods+for+Electron+Microscopy%22">Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy</a>. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li>
<li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Freeze-kırık elektron mikroskobu 40 yılı aşkın bir süredir ultrastrüktürel araştırma önemli bir teknik olmuştur. Ancak, membran moleküler kompozisyon çalışmak için etkin araçların eksikliği kullanımında önemli bir düşüş üretti. Son zamanlarda, bağlı immünolojik etiketleme 1, 2, yani FRIL tekniği ile yekpare zar proteinleri ortaya çıkarmak için etkin yolların geliştirilmesi için donma-fraktür elektron mikroskopisi büyük bir canlanma olmuştur. FRIL teknik diğer immünolojik ultrastrüktürel metotlardan fazla birkaç avantaj sahiptir. İlk olarak, proteinler, duyarlılığı artırmak antikorlara kolaylıkla temin edilebilir. İkincisi, çoğaltma iki boyutlu yüzey üzerinde böyle postsinaptik membranın olarak plazma zarı uzmanlık, büyük kısmının poz seri &#39;zahmetli ve zaman alıcı yeniden olmadan ilgi moleküllerin mekansal dağılımı ve fiziksel bitişiklik denetlenmesine izin veriral ince kesitler. Üçüncü olarak, plazma zarının iki yarısı mevcudiyeti, her bir yapı için etiketlenebilir proteinlerin sayısı, Resim uygun antikorlar mevcuttur arttırır. kırılma üzerine bölme zarın hidrofobik yüzü kırık yüzey üzerinde kalan protein etki güçlendirmektedir karbon platin ile kaplanır. Bu durum, bu etki antijenlerine karşı antikorların erişimi engeller. Bir yineleme P-yüzünde Örneğin protoplazma alan bakan tek epitopu ise, sadece antikor ile bağlı olabilir exoplasmic alan bakan epitoplar e-yüzünde, antikorlar ile tespit edilebilir (bakınız Şekil 2). Öte yandan, FRIL tekniği de bazı sınırlamalar 2 uğrar. kırıklar rasgele olarak belirli hücreler ya da yapıların hedef zor olabilir. Bu aynı zamanda fra farklı olasılık verilen, sinaps koleksiyonunda, örneğin bir örnekleme yanlılığı, yol açabilirFarklı eğrilik (milleri karşı örneğin, dikenler) yapıların zar boyunca cturing. Ayrıca, iki yüzlerinden birine zar proteinlerinin ayırma tahmin edilemez. Bu nedenle, P-yüze ya da E-yüzüne bir protein dağılımı, özellikle de niceliksel çalışmalar için, dikkatle hücre içi ve hücre dışı etki reaktif antikorları kullanılarak incelendi gerekir. sadece morfolojik özelliklere dayalı Son olarak, bu tür presinaptik akson terminalleri gibi bazı yapıların yinelemedeki tanımlanması zor olabilir. Bununla birlikte, işaret proteinleri için spesifik antikorların kullanımı veya etiketli integral membran proteinleri ya da ek araçlar viral vektörler sunar kullanılarak kanalların iletim kırılan membran belirlenmesini kolaylaştırmak için. Örneğin, bu çalışmada, postsinaptik Beni ortaya μ-opioid reseptörleri için amigdala ve etiketleme aksonal eferent nöronları tespit etmek talamik nöronlarda ChR2 YFP transdüksiyonu yararlandıITC nöron mbranes. başarılı bir şekilde FRIL tekniği gerçekleştirmek için, özellikle dikkat doku fiksasyon ilgili alınmalıdır. Güçlü doku fiksasyonu (&gt;% 2 paraformaldehid) çapraz kırık yüksek oranda ve etiketleme duyarlılığında azalmaya neden olabilir. Öte yandan, zayıf tespitler doku işleme ve hazırlama (bölümlerin örneğin, kesme) zorlaştırır. Kesilmiş blok kalınlığı çift taraflı bant kalınlığını eşleştiğini kontrol etmek de önemlidir. Numunenin kalınlığı bandının daha düşük ise, doku yüzeyleri iki metal taşıyıcı yüzeyine bağlanır olabilir, buna bağlı olarak, dondurulmuş numune parçalanmış değildir. Doku kalın ise iki bakır taşıyıcıların sandviç yapıldığında, bu kaçınılmaz yapısal bozukluklar ile sıkıştırılmış olacaktır. Numune kırılmış olan sıcaklık (Bu protokol, -115 ° C), aynı zamanda önemli bir rol oynamaktadırçoğaltma yapısı. Daha yüksek sıcaklıklar, bu tür önceki ya da buharlaşma sırasında doku yüzeyi üzerinde su buharının yoğunlaşması eserler daha yüksek bir oranı üretebilir. Düşük sıcaklıklar (&lt;-125 ° C) kırılma sırasında malzemenin kapalı bölme riskini artırabilir. Bu malzeme numune yüzeyi üzerine düşmesine ya da ona bağlı kalabilir. Malzemenin bu pulları da kaplanmış ve görüntü üzerinde koyu lekeler üreten tezat vardır. Daha düşük sıcaklıklarda, özellikle kırılma dendritik dikenler küçük ince yapılar için enine kırık sıklığını etkileyebilir. kopyaları hazırlanmasında bir başka kritik bir adım deterjan sindirim olduğunu. sindirim eksik ise, sindirilmemiş doku TEM de yapının analizini karıştırıcı, çoğaltma koyu lekeler belirir. Ayrıca, sindirilmemiş doku arka plan etiketleme artan non-spesifik tuzak veya bağlanan antikorlar olabilir. deterjan Diğer yandan, kullanımıDoku sindirimi için s ikincil ve üçüncül yapıları değiştirerek çoğaltma ilişkili molekülleri denatüre olabilir. Bu nedenle, bazı antijenler için yavaş yavaş ilave yıkama adımları ile SDS seyreltilmesi için gerekli olabilir. immunolabeling, ikincil antikorlara konjuge altın partikülü farklı boyutlarda mevcudiyeti, aynı zamanda tespit sağlar, ama sadece nitel, hatta postsinaptik uzmanlık olarak plazma zarının spesifik mikro bölgeler çok sayıda proteinler. Ancak, sterik engel nedeniyle, sayısal çalışmalar genel olarak tek bir molekülün saptanması ile sınırlıdır. altın parçacığı boyutu da markalama etkinliğini etkileyebilir. FRIL etiketleme yorumlanması için, bunun nedeni esnek karmaşık forma immunogold parçacık antijen 20-25 nm yarıçaplı bir hemisfer içinde herhangi bir yerde bulunabilir akılda tutulmalıdırBirincil ve ikincil antikor 26 ile ed. Teori ve FRIL ve ilgili tekniklerin uygulamaya hakkında daha fazla bilgi için, diğer metodolojik makaleler 27, 28&#39;e de okuyucu bakın. FRIL tekniği son zamanlarda 30. Ayrıca, AMPA-R için FRIL tekniğinin algılama hassasiyeti bir işlevsel AMPA başına bir immunogold parçacık olarak yüksek olarak tahmin edilmiştir çeşitli sinaps popülasyonlarında 29, glutamat reseptör lokalizasyonu yüksek çözünürlüklü sayısal analizler için kullanılmıştır -R kanal 29. Böylece, bu yaklaşım ölçmek ve merkezi sinapslarda AMPA-R ve NMDA-R postsinaptik ifade desen analiz etmek genel olarak çok faydalıdır. Burada, PIN / MGN-ITC sinaps uygulanabilirliğini, korku klima sırasında ABD bilgi geçişi için büyük olasılıkla önemli bir site gösterdi. AMPA reseptör alt birimlerinin Glu yüksek derecede korunmuş hücre-dışı amino asit kalıntıları karşı artan bir antikor kullanılarakA1-GluA4, biz postsinaptik membran uzmanlık karşılık gelen IMP kümeler içinde altın parçacıkları eşit dağılımını bulundu. ITC dikenler AMPA-R yoğunluğu PIN / MGN talamik afferentleri tarafından hedeflenen şaft sinaps göre anlamlı derecede yüksek bulundu. Her iki omurga ve şaft sinaps, AMPA-R için etiketleme ve postsinaptik alanı arasında pozitif bir korelasyon, diğer glutamat sinaps 25 ortak bir özellik tespit edildi. PIN / MGN-ITC sinapslarda AMPA-R yoğunluğu düşük varyans kortikal sinaps 25 den talamik efferentler 7 tarafından oluşturulan diğer sinaps benzer, ancak farklı bir homojen dağılımını göstermektedir. Tersine, NMDA-R yoğunluğu daha değişken ve AMPA-R farklı bir düzenleme düşündüren omurga ve mil sinaps arasında fark yoktu. Gelecekte, FRIL tekniği yüksek tekrarlanabilirliği sadece merkezi sinaps bazal molekül bileşimi değerlendirmek için izin vermez, ancak c saptanmasını kolaylaştırabilirkorku öğrendikten sonra iyonotropik glutamat reseptör numaraları ve subsynaptic dağılımındaki Hanges, bu girdilerin öncesi ve postsinaptik özellikleri ex-vivo kayıtları tamamlayan. girdilerin kökeni ve postsinaptik unsurların doğa ve kompozisyon disentangling önemli ama sorunlu olduğu Sonuç olarak, bu yaklaşım diğer birçok nöral devrelerde giriş özgü uyarıcı sinaps yapı-işlev ilişkilerinin içine anlayışlar kazanmak için diğer araştırmacılar tarafından kullanılabilir .

nanometre ölçeğinde biyomembranlar fonksiyonel mimarisi tanımı transmisyon elektron mikroskobu için uygun immün bir takım teknikler geliştirilmesi ile son yıllarda öne sürülmüştür. Bununla birlikte, bu teknikler, örneğin, ön ve son gömme immünolojik, antijenlere ve / veya zar-bağlı protein sınırlı kantitatif bir değerlendirme zayıf algılama dahil önemli sınırlamalar, bir dizi vardır. Bu sınırlamalar, hücre çeşitliliği ve sinaps heterojen yüksek derecede ile karakterizedir sinir sistemi, ince yapısı soruşturma özellikle kritik hale gelir. Ön ve postsinaptik elemanları ya da diferansiyel ekspresyonu, zenginleştirme veya bu reseptörlerin taşıyıcılar ve efektör molekülleri olarak sinyal proteinleri arasındaki etkileşim tarafından dikte yapısal ve işlevsel farklılıklara bu heterojenite sonuçlanır. Doğrudan immunolabe için yeni bir yaklaşımDeterjan-çözünür donma-fraktür kopyaları (FRIL) integral ya da çapraz-bağlanmış membran proteinlerinin Ling ilk iki yıl önce 1 Fujimoto tarafından ortaya atılmıştır. Bu orijinal bir yöntem vardı, ancak, çeşitli sınırlamalar, yani beyin gibi karmaşık dokularda ayrı ayrı eşlenen hücreleri ile etiketlenmiş moleküllerin anlamlı korelasyon engel kopyaları, şiddetli parçalanması. Yaklaşık 10 yıl önce, Shigemoto ve Fukazawa giderek tekniği 2 düzeldi. Bu da önemli ölçüde gap junction 3 çalışması için, özellikle tekniği geliştirilmiş Colorado State University Boulder laboratuarlarında, bilim adamları başka bir grup çabaları paralel edildi. dondurularak kırılma protokolleri ve makinelerde iyileştirme, hem de (yüksek basınç altında) Hızlı dondurma giriş, Hi araştırmacılar nispeten büyük boyutta ve örneklerin kesintisiz kopyalarını üretmek için izin verirsınırlamaları ve güçlü kimyasal tespitler tarafından üretilen eserler olmadan en hücresel bileşenlerin gh kaliteli görüntüler. FRIL tekniği öncesi ve postsinaptik bir plan görünüşüdür ek avantajı, beyin gibi, karmaşık doku içinde bir ya da daha fazla eşleştirilmiş histolojik olarak (aynı anda) protein ve sitolojik tanımlanan hücrelerin in situ tespiti bir yüksek kantitatif büyük avantajı sunar tek bir çoğaltma unsurları. Bu nedenle, FRIL tekniği, birçok teknik engellere rağmen, özellikle bireysel sinapsların yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin korelasyonu için, çok önemli bilimsel buluşlar bir dizi için umut vaat ediyor. Son birkaç on yılda, büyük bir bilgi anlaşma moleküler makyaj, yapısı üzerinde elde edilmiştir, ve sinapsların fizyolojik fonksiyonu; Henüz sinaps morfolojik ve moleküler oldukça çeşitli öncesi ve postsinaptik pa bağlı olankira nöronlar 4. Sadece sinaps türleri bir avuç yapı-fonksiyon şimdiye kadar yapılan çalışmalar 5-7 başarılı idi. Bu durum öncesi ve postsinaptik unsurların doğa kesin bir kimlik engelledi teknik kısıtlamalar çoğunlukla oldu. Ultrastrüktürel analiz sinaptik iletim gücü ve plastisite üzerinde büyük bir etkisi vardır nörotransmiter reseptörleri 6 farklı sinaptik kişileri arasında hem sinaptik boyutu ve içeriği bakımından postsinaptik membran uzmanlık değişkenliği, içine kritik bilgi sağlamaktadır. Bundan başka, bir araştırma büyük bir gövde sinaps farklı ifade iyonotropik glutamat reseptörlerinin sayısının afferent- ve hedef-bağlı bir şekilde 7-10 düzenlendiğini gösterir. Burada, bir yöntem define postsinaptik membran uzmanlık yapısı ve reseptör kompozisyon analizi izin veren ana hatlarıylad presinaptik elemanları ve işlevi. Bu yaklaşım, Channelrhodopsin2 (CHR2) geliştirilen yeni ışığa duyarlı alg proteinler, presinaptik ifade yararlanır ve FRIL tekniğin α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionic postsinaptik sentezleme modelini analiz asit (AMPA-R) ve N-metil-D-aspartat (NMDA-R) glutamat reseptörleri. Bu amigdala (ITC) ve interkelatlaşmış hücre kütlelerinin nöronlar üzerine arka talamik-medial genikülat çekirdekleri (PIN / MGN) kaynaklanan aksonlar oluşturduğu sinaps gösterilmiştir. ITC nöronlar bazolateral amigdaloid kompleksi (BLA) 11, 12 çevreleyen kümeler düzenlenen küçük dikenli GABAerjik hücrelerdir. ITC nöronlar BLA ana nöronlardan eksitatör sinyaller almak ve (CEA) merkez çekirdeğini hedef bilinmektedir, bu nedenle bir inhibitör kapısı olarak işlev bilgi için BLA ve CEA 12-15 arasında akar. Son zamanlarda, biz IT gösterdiBLA ve CEA arasında medio-dorsal kümede bulunan C nöronlar da korku Pavlovian işitsel korku klima 16 sırasında öğrenme üzerine değiştirilmiş duyusal talamik ve temporal kortikal bölgelerde, direkt ve yakınsak eksitatör sinyaller alırlar. Korku şartlandırma beyin mekanizmaları açısından birleştirici öğrenme en iyi anlaşılan biçimlerinden biridir. Korku klima, başlangıçta nötr koşullandırılmış uyaran (CS, örneğin, bir ton) bir CS-ABD dernek sonuçlanan bir caydırıcı koşulsuz uyarıcı (ABD, örneğin, bir hafif ayak şoku) ile eşleştirilmiş ve korku tepkisi 17, 18 şartına bağlıdır. Eksitatör CS ve ABD temsil eden bilgiyi taşıyan talamik ve neokortikal alanlar, hem giriş, sırasıyla, amigdala (LA) yanal çekirdeğin piramidal nöronlar üzerine yakınsama ve plastisite 19 geçmesi biliniyordu. Bizim önceki çalışma duyusal giriş bilgileri ITC nöronlar geçirilen paralel de olduğunu ortaya koydu <s&gt; 16 kadar. Bireysel duyusal girdi mekanistik moleküler analiz doğru bir ilk adım ITC nöronlar üzerine sinapsların, biz ChR2 sarı floresan protein (YFP) ile etiketlenmiş ifade etmek için bir adeno-ilişkili virüs (AAV) kullanılır. AAV PIN / MGN enjekte edildi ve akson terminalleri ChR2 YFP bunların ifadesi ile belirlenmiştir. Biz PIN / MGN akson terminalleri tarafından ITC nöronlar ile oluşturulan sinaps postsinaptik AMPA-R ve NMDA-R yoğunluğunu değerlendirmek için FRIL tekniği ile üretilen, her iki yüzü kullanılır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Cerrahi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktik çerçeve</td><td>Stoelting, ABD</td><td>51670</td>, <td>fareler için başka bir stereotaktik çerçeve ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Stereotaktik çerçeve fare adaptörü</td><td>Stoelting, ABD</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Fareler için gaz anestezi maskesi</td><td>Stoelting, ABD</td><td>50264</td><td>artık mevcut değil, ürün no. 51609M</td></tr> <tr><td>ile değiştirildiBasınçlı enjeksiyon cihazı, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, ABD</td><td>T25-2-900</td><td>diğer basınçlı enjeksiyon cihazları (örneğin Picospritzer) kullanılabilir</td></tr><tr><td>Kwik Dolgu cam kılcal damarları</td><td>Dünya Hassas Aletler, Almanya</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anestezi makinesi, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Almanya</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Sıcaklık Kontrol Edici ve ısıtma yastığı</td><td>FHC, ABD</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Yatay Mikropipet Çektirme Modeli P-1000</td><td>Sutter Instruments, ABD</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi alet sterilizatörü, Sterilizatör 75</td><td>Melag, Almanya</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotip 2/9)</td><td>Penn Vector Core, ABD</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>hızlı yeşil</td><td>Roth, Almanya</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran Anestezik, İzofuran CP (1 ml / ml)</td><td>CP Pharma, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptik, Betadine (providon-iyot)</td><td>Purdure Ürünleri, ABD</td><td>BSOL32</td><td>diğer dezenfektanlarla değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Analjezik, Metacam Solüsyonu (5 mg/ml meloksikam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Almanya</td><td></td><td>diğer analjeziklerle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Bepanthen göz merhemi</td><td>Bayer, Almanya</td><td>0191</td><td>diğer göz merhemleri ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Matkap NM3000 (SNKG1341 ve SNIH1681)</td><td>Nouvag, İsviçre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Sütür İğnesi</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Almanya</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Örgülü İpek Sütür</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Almanya</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>İsim<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası<</td><td>strong> Yorumlar< / güçlü></td></tr><tr><td><güçlü>Doku hazırlama< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit EM sınıfı</td><td>Agar Scientific Ltd., İngiltere</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Doymuş pikrik asit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H20</td><td>Merck Millipore, Almanya</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-2H2O&nbsp;</td><td>Merck Millipore, Almanya</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Almanya</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Tiyopental</td><td>Sandoz, Avusturya</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure ultra saf su sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific, ABD</td><td></td><td></td>50131235</tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>ISMATEC, Almanya</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Kağıdı</td><td>MACHEREY-NAGEL, Almanya</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Avusturya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oftalmik neşter</td><td>Alcon Laboratories, ABD</td><td></td><td>diğer oftalmik neşterlerle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Perfüzyon kanülü</td><td>Vieweg, Almanya</td><td>F560088-1</td><td>, diğer şirketlerden benzer ürünlerle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Yüksek basınç&nbsp; Dondurucu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bakır taşıyıcılar</td><td>Mühendislik Ofisi M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polonya</td><td>Henkel, Almanya</td><td></td><td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Chamois cilt</td><td>Ev gereçleri mağazası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delgeç, 1,5mm</td><td>Stubai, Avusturya</td><td></td><td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Denatüre etanol</td><td>Donauchem, Avusturya</td><td></td>, <td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Roth, Almanya</td><td>9372.5</td><td>DİKKAT!</td></tr><tr><td>Yüksek Basınçlı Dondurma Makinesi HPM 010</td><td>BalTec, CH; şimdi Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>artık üretilmiyor, LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-mikroskop</td><td>ile değiştirildi Olympus, Japonya</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td>DİKKAT!</td></tr><tr><td>Cryo-flakonlar</td><td>Roth, Almanya</td><td>E309.1</td>, <td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International, ABD</td><td>5015-0001</td>, <td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International, ABD</td><td>5016-0001</td>, <td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen depolama kabı</td><td>Cryopal, Fransa</td><td>GT38</td><td>başka şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>İyonik olmayan deterjan (Lavocid)</td><td>Werner & Mertz Professional, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Donma-kırılma ve Replikasyon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten & Kettenbaum, Almanya</td><td>SANDURET 2-K</td>, <td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, tane boyutu 25 - 21 & mikro;</td><td>ŞAKA Joisten & Kettenbaum, Almanya</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Donma Kırılma Sistemi BAF 060</td><td>BalTec, CH; şimdi Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Seramik 12 kuyulu plaka</td><td>Gr&ouml; pel, Avusturya</td><td>14511</td><td>diğer şirketlerden aynı ürün ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, ABD</td><td>T1503</td><td>diğer şirketlerden aynı ürün ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>SIGMA, ABD</td><td>T3253</td><td>diğer şirketlerden aynı ürün ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Merck, Almanya</td><td>1.064.041.000</td><td>diğer şirketlerden</td></tr> <tr><td>aynı ürün ile değiştirilebilirSDS, Sodyum lauril sülfat</td><td>Roth, Almanya</td><td>5136.1</td><td>DİKKAT! ; &nbsp; diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Almanya</td><td>1.076.871.000</td><td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Almanya</td><td>5429.3</td><td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Evrensel Hibridizasyon Fırını Bağlayıcı</td><td>, Almanya</td><td>7001-0050</td><td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Ad</güçlü</td><td>>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, ABD</td><td>A9647</td>, <td>diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antikor</td><td>Moleküler Problar, ABD</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antikoru</td><td>Sınır Enstitüsü, Japonya</td><td>pan AMPAR-GP-AF580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Antikoru, klon 54.1</td><td>Merck Millipore, Almanya</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioid Reseptörü-Mu (MOR) Antikoru</td><td>ImmunoStar, ABD</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM keçi anti-kobay, 5 nm; ikincil antikor</td><td>BBInternational, İngiltere</td><td>EM. GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM keçi anti-tavşan, 15 nm; ikincil antikor</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM. GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan, 10nm, ikincil antikor</td><td>AURION, Hollanda</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Bakır ızgaralar, 100 Paralel Çubuk</td><td>&nbsp; Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, ABD</td><td>MO-RC</td><td>, diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&nbsp; Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Almanya</td><td>3313.1</td><td>DİKKAT! ; &nbsp; diğer şirketlerden aynı ürünle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EM analizi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips / FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD kamera</td><td>Yumuşak Görüntüleme Sistemleri, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, görüntüleme yazılımı</td><td>Soft Imaging Systems, Almanya</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-kırık elektron mikroskobu 40 yılı aşkın bir süredir ultrastrüktürel araştırma önemli bir teknik olmuştur. Ancak, membran moleküler kompozisyon çalışmak için etkin araçların eksikliği kullanımında önemli bir düşüş üretti. Son zamanlarda, immünolojik etiketleme ile yekpare zar proteinleri ortaya çıkarmak için etkin yolların geliştirilmesi için donma-fraktür elektron mikroskobu sayesinde önemli bir canlanma olmuştur. Bu yöntemlerden biri, deterjan-çözünür donma-fraktür çoğaltma immün (FRIL) olarak da bilinir. optogenetics ile FRIL tekniğinin kombinasyonu merkez sinapsların yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili analiz sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, tespit ve etiketli channelrhodopsin ilgili ifadesi ve özel moleküler belirteçleri ile öncesi ve postsinaptik nöronların iki karakterize edilmesi mümkün olur. glutamat postsinaptik membran uzmanlık ayırt edici bir görünümerjik ölçmek ve bu reseptörlerin intrasynaptic dağılımının analizi için, daha sinapsların iyonotropik glutamat reseptörlerinin etiketlenmesi üzerine verir. Burada, eşleşmiş kopyaları ve bunların nasıl immunolabel hazırlamak için gerekli prosedürlerin adım adım tanımını verir. Biz de, potansiyel örnekleme önyargıları ile ilişkili özellikle de FRIL tekniğinin uyarılar ve sınırlamalar ele alınacaktır. optogenetics ile kombine edildiğinde FRIL tekniği yüksek tekrarlanabilirlik ve çok yönlülük, beyinde tespit nöronal mikrodevreler sinaptik iletim farklı yönlerini karakterizasyonu için çok güçlü bir yaklaşım sunuyor. Burada, bu yaklaşım fare amigdala interkalar hücre kütlelerinin nöronlar da uyarıcı sinaps yapı-işlev ilişkilerinin içgörü kazanmak için nasıl kullanıldığını bir örnek oluşturmaktadır. Özellikle, belirlenen girişlerin iyonotropik glutamat reseptörlerinin ekspresyonunu araştırdık veyatalamik arka intralaminar ve medial genikülat çekirdeklerine iginated. Bu sinapslar korku öğrenme için uygun duyusal bilgiyi röle ve korku klima üzerine plastik değişikliklere gösterilmiştir.

FRIL tekniği, mikrobiyal orijinli 21, örneğin, plazma membranında entegre ve etkili aksonları boyunca anterogradely taşınan kanallar Optogenetic aktüatörlerin ifadesi ile bir araya getirildiğinde, belirli bir alt grup niceliksel olarak AMPA-R ve NMDA-R postsinaptik ifade incelemeye olanak sağlar sinaps. Bu amigdala ITC nöronlar üzerine (örneğin, PIN / MGN) farklı talamik çekirdeklere kaynaklanan aksonlar için burada gösterilir. Bu yaklaşım, ITC nöronlar, şimdiye kadar ayrıntılı bir anatomik ve moleküler karakterizasyonu dirençli olan hücrelerin bir grup üzerinde ayrı ayrı duyusal girdi sinaps moleküler analiz edilmesini sağlar. Dört hafta PIN / MGN içine rAAV-ChR2 YFP stereotaktik enjeksiyonundan sonra, ChR2 YFP pozitif aksonlar yoğun LA, amygdalostriatal geçiş alanı (Astria) ve medial paracapsular I inerve<html> Amigdala TC küme, önceki izleme ile tamamen uyumlu bir desen 22, 16 inceler. Biz de rAAV-ChR2 YFP- gelen donma-kırık çoğaltma akson ve terminallerin P-yüzünde ChR2 YFP için immün yoğun altın tespit enjekte edilen fareler (Şekil 5A), ancak olmayan enjekte edilmiş farelerden alınan yinelemede. Bir yineleme glutamaterjik sinaps postsinaptik membran uzmanlık plazma zarı 2, 23 E-yüzünde zar içi parçacıklar (IMPS) bir küme olarak görülebilir ve sıklıkla presinaptik plazma zarı 7 P yüze eşlik ediyor (Şekil 5B-C). PIN / MGN akson terminalleri tarafından oluşturulan glutamaterjik sinaps postsinaptik uzmanlık belirlemek için izin Bu özellikler (Şekil 5 ve 6). Bu NMDA Rs esas NR1 alt birimine karşı bir antikor kullanılarak tespit edilmiştir, oysa tüm dört alt birimden (GluA1-4) tanıyan bir antikor ile AMPA-R etiketli. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; ntent 1 &quot;&gt; Bu sinapsların dendritik dikenler veya ITC nöronların milleri ile yapılmış olup aynı çoğaltma tespit araçlarının eksikliği nedeniyle, biz u için gelen çoğaltma yüzünü etiketli ITC nöronlar bu reseptörlerin 24 postsynaptically yüksek seviyelerde ifade şekilde -opioid reseptörleri. Bu yerler kullanan bir strateji kullanarak iki yineleme (Şekil 5C-F Şekil 6A-B) &#39;de, aynı postsinaptik profillerin tespit gerekir (Şekil 4E) . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Şekil 5. immunogold Parçacıklar tarafından Replica üzerinde ChR2 YFP ve iyonotropik glutamat reseptörlerinin, algılama. (A) çapraz kırık akson terminali (açık mavi) ve ChR2 YFP tespit 15 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş olan P-yüzünün küçük porsiyonlarda. terminal içinde membran Of sayıda sinaptik kesecikler gözlenebilir (SV). plazma membran ile sınırlı büyük ölçüde immunolabeling özgüllüğünü edin. ChR2 için Etiketleme PIN / MGN oluşan en terminali tanımlar. Terminal bir omurga ile asimetrik sinaps oluşturur. E-yüzünde postsinaptik zar uzmanlık (PSD) zar içi parçacıkların karakteristik kümesini gösterir ve AMPA-R ortaya 5 nm altın parçacıkları ile etiketlenir. (B) (15 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş), bir ChR2 ifade akson p-yüzü, iki dendrit onları NMDA Rs ortaya 5 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş iki PİO&#39;ların sahip birini çevreleyen gösterilmiştir. (CD) PIN / MGN-ITC sinaps öncesi ve postsinaptik membran Karşısı yüzleri. (C) terminalinin P-yüzü (15 nm altın parçacıkları ile etiketli) ChR2 ifade ve iki dendritik milleri, onları AMPA-R (5 nm altın parçacıkları) için etiketli iki PSDS içeren birinin e-yüze boyunca uzanır. ( <strong&gt; D) iki dendritler karşılık gelen P-yüz μ-opioid reseptörlerin (10 nm altın parçacıkları) etiketlenmiştir. (EF) kesik çizgilerle belirtilen alanların Genişletilmiş manzarası. Ölçek çubukları:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> PIN / MGN-ITC sinapslarda AMPA-R için İmmün parçacıklar postsinaptik uzmanlık (Şekil 5E) içinde homojen bir dağılım düşündüren, tüm IMP küme üzerinde bulundu. Bir anlamlı olarak daha yüksek (eşleşmemiş t-testi p &lt;0.018) AMPA-R etiketleme yoğunluğu PIN / MGN gözlendi ITC dikenler üzerine sinapsların (715 ± 38 altın parçacıkları / mikron 2, n = 32) ITC dendritler üzerine sinapsların karşılaştırıldığında (590 ± 44 altın parçacıkları / um 2, n = 32). Genel olarak, PIN / MGN-ITC sinapsların AMPA-R yoğunluğu nispeten düşük gösterdiVaryans (varyans katsayısı, CV = 0.37) homojen bir dağılım tutarlı. PIN / MGN-ITC sinapslarda NMDA Rs İmmün genellikle düzensiz postsinaptik IMP kümeleri (Şekil 5B) içinde dağıtılan gözlenmiştir. NMDA-R etiketleme yoğunluğu (eşleşmemiş t-testi, p = 0.39) PIN / MGN ITC dikenler üzerine sinapsların arasında benzerdi (1070 ± 153 altın parçacıkları / mikron 2, n = 8) ve ITC dendritler (812 ± 183 altın parçacıkları / um2, n = 9). AMPA-R gözlendi aksine ne PIN / MGN-ITC sinapsların NMDA-R yoğunluğu (CV = 0.54) çok değişken oldu. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Belirlenen PIN / MGN-ITC Sinapslar de Şekil 6. AMPA-R ve NMDA-R ile immün. (AB) PIN / MGN-ITC öncesi ve postsinaptik membran Karşısı yüzleriTerminalin P-yüzü ChR2 ifade eden bir dendritik omurga üzerine yapılan sinaps (15 nm altın parçacıkları ile etiketli) ve dendritik omurga üzerine PSD AMPA-R (5 nm altın parçacıkları) etiketlenmiştir. (CD) kesikli çizgi ile belirtilen alanların Genişletilmiş manzarası. Bu alanlar PSD daha iyi bir görünüm sağlamak için yaklaşık 45 ° saat yönünün tersine döndürülmüş edilmiştir. (E) ITC omurgada ve dendrit sinaptik alanına karşılık AMPA-R parçacıkların sayısının saçılım. Her iki yapılarda, pozitif bir korelasyon gözlenmiştir. (F) ITC omurgada ve dendrit sinaptik alanına karşı NMDA R parçacıkların sayısının saçılım. Anlamlı bir pozitif korelasyon sadece dendritik dikenler tespit edildi. Ölçek çubukları:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> çünkügenellikle kısmen postsinaptik IMP küme üste presinaptik plazma zarı P-yüz, biz sinapsların sadece% 30 sinaptik alanını tahmin olabilir (dikenler: parkı 0.032 mikron 2, aralık ortalama: 0.007 mikron 2 0.063 n = 8; dendritler: 0.047 mikron 2, aralığı: 0.024 11 mikron 2 0.166 kadar, n =). Daha önce analiz telencephalic glutamaterjik 25 sinapsların Bunlar benzer bir aralıkta idi. Her iki dikenler ve dendritler, bireysel sinapslarda AMPA-R için altın immün parçacıkları sayısının pozitif sinaptik alanı ile korelasyon (Spearman, dikenler: r = 0.88, dendritler: r = 0.60, p &lt;0.0001) (Şekil 6E). Ancak dendritler (r = 0.21, p = 0.29) (Şekil 6F içinde: Tersine, NMDA-R altın immün parçacıkları sayısını dikenler (r = 0.90, p &lt;0.002 Spearman, dikenler) sinaptik alanı ile ilişkili olduğu bulunmuştur ).

Bu makale, nörotransmitter reseptörlerinin ekspresyonunun nasıl ölçülebileceğini ve optogenetik araçların viral transdüksiyonu ve donma-kırık replika immünoetiketleme tekniğinin bir kombinasyonu kullanılarak tanımlanmış presinaptik ve postsinaptik elementlerle sinapslarda analiz edilen modeli göstermektedir.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Optogenetiği dondurma-kırılma replika immünlekeleyim tekniği ile birleştiren bu prosedürün amacı, fare amigdalasındaki sinapslarda, tanımlanmış pre ve postsinaptik elementlerle birlikte ionotropik glutamat reseptörlerinin yoğunluğunu analiz etmektir. Dondurma-kırılma replika immünlekeleyim tekniğinin yüksek tekrarlanabilirliği ve çok yönlülüğü, optogenetikle birleştirildiğinde, sinapsların yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin korele analizi için çok güçlü bir yaklaşım sunar. Bu prosedürün temel avantajları; pre ve postsinaptik elementlerin düzlemsel görünümü ve bu özel mikro-domainlerdeki proteinlerin kantitatif analizidir.İntegral membran proteinlerinin dağılımını ve organizasyonunu incelemek için çeşitli farklı dokulara farklı teknikler uygulanabilir. Genel olarak, bu kombine optogenetik FRIL yaklaşımı, gereken çok çeşitli cihaz ve makineler nedeniyle yeni başlayanlar için zorlayıcıdır. Bazı diğer adımların öğrenilmesi güç olduğundan, modülasyona farklı bir yöntemle başlamak kritiktir.Donmuş örneklerin kırma ve replikasyonu gibi işlemler için; bu prosedüre başlamak için, farenin beyninden alınan koronal bir bloğu vibro-slicer tutucusuna yapıştırın. Doku bloğunu, neokorteks titreşen bıçağa bakacak şekilde yönlendirin. Ardından, amygdala içeren koronal kesitleri 0,1 M, buz gibi soğuk PB içerisinde 140 µm kalınlığında kesin. Bu kesitleri aynı tampon çözelti içeren altı kuyucuklu bir plakada toplayın.Stereo-mikroskop altında, silikon elastomer ile kaplanmış ve 0.1 M PB ile doldurulmuş bir petri kabı içerisinde, ilgilenilen bölgeyi kesitlerden kırpın. Ardından, kırpılan bloğu kriyokoruma solüsyonuna aktarın ve altı derece Celsius'ta gece boyunca bekletin. Bu adımda, bakır taşıyıcıları şamuar derisi parçasıyla parlatarak kararmaları giderin ve FRIL prosedürünün sonraki aşamalarında kullanılmak üzere hazırlayın. Mikroskop altında, kırpılan blok için tutucu hazne görevi görecek olan çift taraflı bir bant halkasını bakır taşıyıcıya sabitleyin.Ardından, kırpılmış bloğu platin tel loop kullanarak çift taraflı bandın deliğine yerleştirin. Fazla kriyoprotektan çözeltiyi filtre kağıdı veya bir fırça yardımıyla temizleyin. Daha sonra, tutucu taşıyıcıyı başka bir taşıyıcı ile örtün.Doku bloğu iki taşıyıcı arasında sandviç şeklinde kalacak şekilde yerleştirin. Numuneyi dondurmak için taşıyıcı sandviçi numune tutucuya yerleştirin. Ardından, numune tutucuyu yüksek basınçlı dondurma ünitesine yerleştirin.Jet-auto düğmesine basarak dondurma döngüsünü başlatın, numune tutucuyu hemen çıkarın ve ucunu sıvı azot içeren yalıtımlı bir kutuya daldırın. Ardından, taşıyıcı sandviçi numune tutucudan dikkatlice çıkarın ve önceden soğutulmuş bir kriyotüpe yerleştirin. Taşıyıcıları içeren kriyotüpleri, replikasyona kadar bir kriyotankta saklayın.Elektron ışın tabancasını yerleştirmeden önce, deflektör plakalı kalkanı çıkarın. Filamanı merkezlemek için kullanılan ayar mastarını, alt katot kapağı aracılığıyla pens başlığına yerleştirin. Ardından, basınç laminaları filamanın uçlarını sıkıştırana kadar yeni filamanı mastarın üzerine kaydırın.Ardından, ayar mastarını çıkarın ve karbon çubuğu yerleştirin. Buharlaştırıcı çubuk tutucusunun pens başlığını sıkarak çubuğu sabitleyin. Çubuğun ucundaki yüksekliğin, alttan ikinci bobinin ortasında olduğundan emin olun.Bundan sonra saptırıcı plakayı yerine takın ve elektron demeti tabancasını dondurarak kırma ünitesine yerleştirin. Bu işlem sırasında, buharlaşma için akımı ve voltajı ayarlayın. Ardından, dondurulmuş taşıyıcı sandviçi sıvı azot içerisindeki çift replika tablasına yerleştirin.Ardından, çift replika tablasını Dewar kabına aktarın ve numune tablası alıcısına 45 derecelik bir açıyla sabitleyin. Çift replika tablasını bir tabla manipülatörü ile kaldırın. Tablayı dondurarak kırma ünitesindeki soğuk tablaya yerleştirin ve çift replika tablasının sıcaklığının negatif 115 °C değerine uyum sağlaması için yaklaşık 20 dakika bekleyin.Ardından, çift replika masasının üzerindeki kılıfa bağlı olan tekerleği manuel olarak saat yönünün tersine çevirerek dokuyu kırın. Kılıf döndüğünde, çift replika masasını açılmaya zorlar ve bu da dokunun kırılmasıyla sonuçlanır. Kırılan yüzeylere 90 derecelik bir açıyla karbon tabakası uygulanır.Ardından, replike örnekleri çift replika tablasından çıkarın ve TBS ile doldurulmuş seramik 12 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Bir platin loop-telli çubuk kullanarak, replike dokuyu örnek taşıyıcısından ayırın. SDS sindirimi için, bir replikayı bir mililitre SDS sindirim tamponu ile doldurulmuş dört mililitrelik bir cam şişeye aktarın.Sallama eşliğinde 80 °C'de 18 saat boyunca sindirilmeye bırakın. İmmün markalama için, replikayı taze SDS sindirim tamponu ile 10 dakika boyunca yıkayın. Ardından, %2 BSA-TBS içinde seyreltilmiş primer ve sekonder antikorlarla, nemli bir inkübasyon kabında 15 °C'de 24 ila 72 saat boyunca inkübe edin.Ardından, replikayı form-far kaplı, 100 çizgili paralel çubuk ızgarası üzerine yerleştirin. Replikayı, 80 veya 100 kilo-volt değerindeki bir transmisyon elektron mikroskobu ile görüntüleyin. Sonra, dijital görüntüleri bir CCD kamera aracılığıyla elde edin.Çevrimdışı olduğunda, farklı işaretçiler kullanarak replikadan görüntü üzerindeki karşılık gelen bölgeleri bulun. AAV enjeksiyonundan dört hafta sonra, posterior talamik nükleer grupta Channelrhodopsin-2 ekspresyonu için, Channelrhodopsin-2 talamik aksonlar boyunca anterograd olarak etkili bir şekilde taşınarak amigdala interkale hücre kütlelerine ulaşır. Glutamaterjik sinapsların post-sinaptik uzmanlaşması, replikada plazma membranının E-yüzündeki intramembran partikül kümeleri olarak tanınabilir ve sıklıkla presinaptik elementinin P-yüzü ile birlikte görülür.Burada, Channelrhodopsin-2 ve glutamat reseptörleri, sekonder antikorlara konjuge edilmiş farklı boyutlardaki altın partiküller kullanılarak görselleştirilmiştir. Postsinaptik membranın interkale nöronlara ait olup olmadığını aynı replika üzerinde tespit edecek yapısal veya moleküler araçların eksikliği nedeniyle, ilgili replika bu nöronlar için bir marker olan mu opioid reseptörleri için işaretlenmiştir.Bu sinapslardaki glutamat reseptör yoğunluğunun kantitatif analizine bir örnek olarak, dikenler ve dendritler üzerindeki sinaptik alana karşı AMPA reseptörleri için altın partikül sayısını gösteren dağılım grafikleri burada sunulmuştur. Bunlar, her iki yapıda da pozitif bir korelasyon olduğunu ortaya koymaktadır. Bu prosedürü uygularken, bireysel adımların birbirine yüksek derecede bağımlı olduğunu unutmamak önemlidir.Bu nedenle, adımlardan birinde yapılacak bir hata tüm prosedürü tehlikeye atabilir; replikanın iki boyutlu yüzeyinde plazma membranı özelleşmelerinin büyük bir kısmının görüntülenmesi, seri artrofin kesitlerinin zahmetli ve zaman alıcı rekonstrüksiyonuna gerek kalmadan, ilgilenilen moleküllerin uzamsal dağılımının ve fiziksel sürekliliğinin incelenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, diğer araştırmacılar tarafından nöral devrelerdeki spesifik sinapsların yapı-fonksiyon ilişkileri hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir.Girdilerin kaynağının ve postsinaptik elementlerin doğasının çözümlenmesi kritik önem taşımaktadır, ancak bu süreç sorunludur.

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, farelerden alınan akut amigdala beyin dilimleri kullanılarak medial prefrontal korteks (mPFC) ve amigdala nöronları arasındaki sinaptik bağlantıyı analiz etmek için bir prosedürü göstermektedir. Bu farelerdeki mPFC nöronları, bir floresan proteine kaynaşmış channelrhodopsin eksprese eder. Channelrhodopsinler, ışık aktivasyonu üzerine mPFC nöronlarında iyon akışını ve aksiyon potansiyeli oluşumunu kolaylaştırır. Sonuç olarak, mPFC nöronları, postsinaptik amigdala nöronlarına bağlanan...

Amigdala Beyin Dilimindeki Nöronal Yolların Görselleştirilmesi ve Haritalanması

Kaynak: Schönherr, S., et. al. Fare Amigdalasındaki Glutamat Reseptörlerinin Girişe Özgü Düzenlemesini İncelemek için Kombine Optogenetik ve Donma Kırığı Replika İmmün Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, elektron mikroskobu için fare beyin dokusunun donarak kırılmış kopyalarının immüno-etiketlemesini göstermektedir. Kırılmış ve kaplanmış kopyalar, reseptörleri açığa çıkarmak için sindirilir. Primer ve altın etiketli sekonder antikorlar, spesifik nöronal membran reseptörlerini etiketlemek...

Fare Beyin Dokusunun Donarak Kırılmış Bir Örneğinde Nöronal Membran Proteinlerinin İmmünoetiketlenmesi

Source: Maruoka, H., et. al. uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2022) Bu video, görsel stimülasyon sırasında uyanık bir farede nöronal aktiviteyi ve mikroglial dinamikleri görüntülemek için iki fotonlu bir mikroskopi prosedürünü göstermektedir. kalsiyum geçişleri ve hücresel etkileşimler.

Uyanık Bir Farede Mikroglial Dinamiklerin ve Nöronal Aktivitenin Eş Zamanlı Görüntülenmesi

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Optogenetic yaklaşımlar yaygın nöral aktiviteyi işlemek ve beyin fonksiyonu için sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır. Burada, bir teknik optik aktivatör channelrhodopsin in vivo tanımlanması üzerine, korku ile ilgili devreler özel uzun menzilli ve yerel sinirsel bağlantılar sinaptik özellikleri ex vivo analiz için izin verdiği gösterilmiştir.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Bu iletişim kuralı, yapay mikroRNA aracılı RNA müdahale optogenetics özellikle presynaptic boutons selektif gene(s) sağlam nöronal devreler içinde azaltılmış ifade ile uyarmak için birleştirmek bir iş akışı sağlar.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

Bu eser bir optogenetic tek-unit güvenilir özel yapım cam optrode kullanarak uyanık bir fareden kayıt gerçekleştirmek için bir yöntem sunar.

Bir cam Optrode uyanık farelerde nöronal türüyle Optogenetics tanımlaması

Erişkin farelerden gelen akut dilimlerde tek kortikostatal glutamaterjik sinapslarda glutamat salınımı ile açıklık arasındaki dengeyi değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Bu protokol glutamat tespiti için floresan sensör iGluu, sinyal alımı için bir sCMOS kamera ve odak lazer aydınlatma için bir cihaz kullanır.

Normal ve Huntington Farelerden Akut Beyin Dilimlerinde Glutamat Salınımı ve Alımının Tek Sinaps Göstergeleri

Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir.

SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Davranışı Modüle Etmek Için Nöronal Aktivitenin Optogenetik Manipülasyonu

In vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntüleme, özgürce davranan hayvanlarda nöronal aktivitelerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan paha biçilmez bir araçtır. Ancak bu tekniği amigdalaya uygulamak zor olmuştur. Bu protokol, farelerde minyatürleştirilmiş bir mikroskopla amigdala hücrelerini başarıyla hedeflemek için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.

Özgürce Davranan Farenin Amigdalasında Kafaya Monte Minyatür Mikroskop ile Başarılı In vivo Kalsiyum Görüntüleme

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Öğrenin fare amigdalasında iyonotropik glutamat reseptörlerinin yoğunluğunu optogenetik ve donma-fraktür çoğaltma immün etiketleme ile analiz etme yöntemini. Bu teknik sinaptik yapı ve fonksiyon ilişkilerini nicel olarak incelemenizi sağlar.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya (Video) | JoVE Journal

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Daha fazla video keşfet