Kanser kurulması İnsan Konvansiyonel Osteosarkom Hücre Kültürleri Kök

Bu makalenin genel amacı, kanser kök hücrelerini insan osteosarkomlarından elde edilen sonlu bir hücre hattından izole etmektir. Bu çalışmanın temel avantajı, onkoloji alanındaki diğer kişilere in vitro kanser kök hücrelerinin nasıl izole edileceğini açıkça göstermektir. Bu hücreler daha sonra osteosarkom ve diğer katı tümörlere karşı tedavileri araştırmak için kullanılabilir.

Genel olarak, bu konuda yeni olan bireyler, sarkom kolonilerini nasıl izole edeceklerini bilmiyorlarsa mücadele edeceklerdir. İzolasyon adımının gerçekleştirilmesi ve anlaşılması zor olduğu için bunun görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir. Bu teknik için ilk olarak, küre oluşumu makalesini okuduğumuzda aklımıza geldi.

Alçı ve işbirlikçileri tarafından tanımlayın. Prosedürü gösteren, doktora öğrencisi Dr.Gaia Palmini ve laboratuvarımdan bir teknisyen olan Dr.Roberto Zonefrati olacak. Başlamak için gerekli tüm kültür ortamını hazırlayın.

Sindirim tamponları ve prosedür için ihtiyaç duyulacak diğer çözeltiler. Daha sonra, osteosarkomu onaylanmış bir iğneden veya cerrahi biyopsiden izole ederek bir osteosarkom sonlu hücre hattı oluşturun. Ve ekteki metin makalesinde açıklandığı gibi elde edilen hücrelerin alt kültürlenmesi.

Osteosarkom hücre kültürü kurulduktan ve plaka birleşmeye yakın olduğunda. Ortamı aspirasyon ile çıkarın ve hücreleri plakadan serbest bırakmak için tripsinize edin. Hücreleri yeni bir tüpe aktarın ve herhangi bir hücre kümesini dağıtmak için hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.

Daha sonra, hücre süspansiyonunun on mikro litresini toplayın ve bir hemositometre odasına aktarın. Hemositometre odasını bir faz kontrast mikroskobu altına yerleştirin ve süspansiyondaki hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın. Daha sonra, metoselüloz içeren 35 mililitre sarkosfer büyüme ortamına 280.000 hücre ekleyin ve herhangi bir topaklanmayı dağıtmak için çözeltiyi bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın.

Hücre karışımının beş mililitresini altı kuyulu ultra düşük bağlantı plakasının her bir oyuğuna aktarın. Kaplandıktan sonra, hücrelerin nasıl göründüğünü ve iyi izole edilip edilmediklerini gözlemlemek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Hücreleri 37 santigrat derece, yüzde beş karbondioksit inkübatörde inkübe edin.

Her üç günde bir, büyüme faktörlerinin konsantrasyonunu yenilemek için her bir oyuğa taze beta FGF ve EGF alkolatları ekleyin. Mikroskop altındaki hücrelere yedi, 14, 20, 21 ve 28 günde bakarak sarkosfer testinin ilerlemesini inceleyin. Kuyunun merkezinde bir arada bulunan büyük siyah sarkosferlerin varlığını gözlemlediğinizde, kültürlenmeyi bırakın ve ıssızlık sürecine başlayın.

Sarkosferi izole etme zamanı geldiğinde, sarkosferleri içeren ortamı steril bir membran filtre tutucusu olan bir şırıngaya aktarmak için steril bir 1.000 mikrolitrelik pipet kullanın. Sarkosferleri içeren ortamı tamamen çıkardıktan sonra, kuyuya beş mililitre büyüme ortamı ekleyin ve emin olmak için durulayın. Ve kalan küreleri toplayın.

Ardından, tüm sarkosferlerin kurtarılıp kurtarılmadığını doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Aksi takdirde, kürelerin toplanması tamamlanana kadar kuyuyu tekrar yıkayın. Ardından, kürelere zarar vermemek ve filtreden sarkosfer geçmediğinden emin olmak için süspansiyonu membran filtre tutucusundan yerçekimi ile süzün.

Bu işlem sırasında, steril bir cam mera pipeti kullanarak hava kabarcıklarını nazikçe çıkarın. Tüm sarkosferler filtrelendikten sonra, filtrasyon ünitesini doğrudan şırıngaya on mililitre büyüme ortamı ekleyerek ve tek hücreleri ortadan kaldırdığınızdan emin olmak için basınçsız filtrelemeye izin vererek yıkayın. Sarkosferlerin süspansiyonu filtrelendikten sonra, sıvının filtresini atmak ve ağ filtreye dolanan sarkosferlerin geri kazanılmasına ciddi şekilde dikkat etmek gerekir.

Bu noktada, filtre ünitesinin bir parçasını şırıngadan çıkararak alın. Ve 100 milimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Bir çift steril peri cımbız kullanarak ağ filtreyi membran filtre tutucusundan çıkarın.

Ve filtreyi yeni bir 60 milimetre petri kabına aktarın. Ardından file filtreyi hafifçe sallayarak yıkayın. Sarkosferleri zarın arapsaçından serbest bırakmak için beş mililitre büyüme ortamı eklerken.

Daha sonra, zarı bir kuyuya yerleştirin ve mikroskobik gözlemle zarda daha fazla küre dolaşmadığını onaylayın. Membranı tekrar yıkayın ve ardından membranda hala dolaşmış küreler varsa zarı mikroskop altında tekrar kontrol edin. Zarda daha fazla küre kalmadığında, sarkosferleri tek bir tabaka halinde büyütmek için onları büyüme ortamında inkübe edin.

Sarkosferlerden elde edilen osteosarkom kanseri kök hücrelerinin büyümesini izleyin. Hücreler yaklaşık% 90'a ulaşana kadar60 milimetrelik bir petri kabında. Bu makalede bulunan çok sayıda daimi protokole ek olarak, farklılaşma kapasitesini, ALDH aktivitesini, akış sitometrisini, immünofloresan ve RTPCR analizini değerlendirme yöntemleri, ekteki metin protokolünde ayrıntılı olarak yer almaktadır.

Osteosarkom örnekleri iğne aspirasyonu veya cerrahi kesit ile elde edilir. Ve uygun şekilde tedavi edilirse, birincil kültürlerin 100 milimetrelik bir petri kabında birleştiği yere ulaşması yaklaşık bir ay sürer. Genleşmeyi takiben, hücreler sarkosfer tahliline başlamak için altı kuyulu ultra düşük bağlantı plakasında kaplanır.

Bu plaka, hücreleri askıda tutar ve substrat yapışmasını önler. Yedi gün sonra, tek hücrelerle çevrili birkaç küçük küresel koloni gözlenir. Ve 28 gün sonra, birkaç büyük sarkosfer gözlenir.

Küresel koloniler izole edildikten sonra, kök benzeri kanser hücreleri, normal bağlantı plakalarına yerleştirilerek tek sarkosferlerden genişletilebilir. İmmünofloresan boyamalar, genişlemiş hücrelerin CD105 için CD44 için pozitif ve Stro-1 için orta derecede pozitif olması nedeniyle mezenkimal kök hücre benzeri fenotipi göstermiştir. RTPCR, ayrıca üç embriyonik kök hücre işaretleyici geninin ekspresyonu ile embriyonik kök hücre fenotipini pozitif olarak gösterdi.

Nanog, Ekim 3/4 ve Sox2. Ve osteosarkom kanseri kök hücreleri için bir belirteç olan CD133 geni. Bu videoda gösterdiğimiz ayrıntılı izolasyon tekniği, küre oluşumu testinin en kritik adımlarını nasıl anlayacaklarını ve yeniden üreteceklerini göstererek diğer araştırmacıların kanser kök hücrelerini incelemelerinin önünü açacaktır.

Bu modifiye edilmiş tahliller, kanser kök hücrelerini izole etmek ve biyolojilerini incelemek için iyi bir tekniktir. Bu madde, ek adaptasyonlarla, kanser kök hücrelerini diğer sonlu kanser hücre hatlarından izole etmek için de kullanılabilir. Katı tümörlerin biyopsileri ile elde edilir.

Sonuç olarak, kanser kök hücrelerinin çeşitli tümör türlerinden izole edilmesi, biyolojilerinin incelenmesine izin verecektir. Nihai hedef, moleküler hedefler bulmak ve belirli hücresel alt gruplara yönelik çok spesifik anti-kanser tedavileri geliştirmektir.