Kombine bir 3D doku mühendisliği

Bu kombine In Vitro/In Silico Akciğer Kanseri Modelinin genel hedefleri, küçük hücreli dışı akciğer kanseri hedefli tedavilerin duyarlılığını incelemek ve yeni maddelerin etkinliğini tahmin etmektir. Bu 3 boyutlu model sistemi, hedeflenen tedavilere veya doğrudan kombinasyonlara hücreye özgü yanıtların izlenmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, in Silico tahminlerle kaplı, daha fizyolojik bir ortamda klinik öncesi ilaç testini kolaylaştırabilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, spesifik mutasyon arka planlarına dayalı ilaç yanıtı tahminlerini optimize etmek için kullanılabildiğinden, farklı tümör antitelerinin tedavisine kadar uzanır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Franziska Schmitt olacaktır. Dinamik bir kültür oluşturmak için, tümör modelini statik kültür koşulları altında, geleneksel bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de bir hücre tacında kültürleyerek başlayın.

Üç gün sonra, bir Otoklavlanmış Biyoreaktör monte edin ve sisteme tohumlanmış, biyolojik bir ince bağırsak submukozu artı mukoza iskelesi yerleştirin. Daha sonra, bir şişeye uygun miktarda FCS ile desteklenmiş 45 mililitre RPMI ekleyin ve iğnesiz numune alma cihazını Biyoreaktör ile ortam şişesi arasındaki boru sistemine bağlayın. Biyoreaktörü inkübatöre yerleştirin ve dakikada üç mililitrelik sabit bir orta akışla 14 gün daha tümör modelini kültürlemek için pompaya bağlayın.

Statik bir tümör modelini Gefitinib ile tedavi etmek için, geleneksel inkübatörde kültürün 11. gününde, önce eski ortamı kuyucuklardan çıkarmak için bir pastör pipeti kullanın. Daha sonra, her hücre tepesinin içine FCS ve Gefitinib ile desteklenmiş bir mililitre taze hazırlanmış RPMI ve her bir oyuğun dibine 1,5 mililitre ekleyin. Elisa'nın örneklerini dinamik bir kültürden toplamak için, kültürün 11 ila 14. günlerinde şırıngayı numune alma cihazına takın ve Biyoreaktör sisteminden bir mililitre besiyerini çıkarın.

Daha sonra numuneleri eksi 80 santigrat derecede Elisa yapılana kadar saklayın. Ki67 pozitif çekirdeklerin sayısını belirlemek için, önce numunenin örtüşmeyen bölümlerinden her koşulun 20 kat büyütmesinde 2D kültürlerin beş DAPI ve beş Ki67 boyama floresan görüntüsünü elde etmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Ki67 pozitif çekirdeklerini manuel olarak saymak için, Fiji'de ortaya çıkan görüntüyü açın ve Eklentiler ve Hücre Sayacı'nı seçin, ardından başlat'a tıklayın, bir sayaç türü seçin ve her Ki67 pozitif çekirdeğe tıklayın.

Tıklanan hücrelerin sayısı, seçilen sayaç türünün yanında görünecektir. 2D görüntülerdeki toplam çekirdek sayısının otomatik hücre sayımı için, makro kaydediciyi başlatın, bir DAPI görüntüsü açın ve görüntüye tıklayın, yazın ve 8 bit'e tıklayın, ardından kontrastı artır'a tıklayın ve doymuş parametreyi bire ayarlayın ve normalleştirin. Görüntüyü keskinleştirmek için, yarıçapı bir ve maske 60 kullanarak keskinliği azaltma maskesini ayarlayın.

Görüntüyü ciltlemek için otomatik eşiği tıklatın ve siyah arka plan üzerinde beyaz nesnelerle Reny/Entropi yöntemini seçin. Ardından, tıklayın Eklentiler, ardından BioVoxxel, ve hücreleri ayırmak için beş erozyon yarıçapı ile havza düzensiz özelliği. Analiz et'e tıklayın ve parçacıkları analiz edin ve boyutu 02 sonsuz olarak ayarlayın ve özetlemeyi kontrol edin.

Hücre sayısı, özet tablosunda sayım olarak gösterilecektir. Ardından, daha fazla 2B hücre kültürü görüntüsünde çekirdeklerin otomatik olarak sayılmasına izin vermek üzere makroyu kaydetmek için oluştur'a tıklayın. Bir tümör ağı oluşturmak için bilgi veritabanlarını kullandıktan sonra, uygun ağ analiz yazılımını açın, dosya ve yeni'ye tıklayın ve jove tümör modellerini girin.

Yeni bir ağ oluşturmak için Tamam'a tıklayın, ardından reseptörü çift zarda görselleştirmek için Kuzey'e kare yakın çekim ve tamam'a tıklayın. Düğümleri dikdörtgenler olarak görselleştirmek için genel proteine, ardından EGFR'ye tıklayın, ardından ağdaki düğümleri Ok.To etiketleyin, renk ve şekli değiştirmek için sağ tıklayın ve düğüm renk kodlarını belirtildiği gibi ayarlayın. Okuma parametrelerini altıgen olarak görselleştirmek için, fenotip'i seçin, proliferasyonu girin ve Tamam'a tıklayın.

Ardından, renk kodunu 255, 204, 204 olarak ayarlamak için sağ tıklayın ve rengi ve şekli değiştir'i tekrar seçin. Düğüm etkileşimlerinin kenarlarını görselleştirmek için, etkinleştirme okları için durum geçişi'ni ve köreltilmiş engelleme okları için engellemeyi tıklatın. Ardından, dosyaya tıklayın ve farklı kaydedin ve oluşturulan sinyal ağını jove tümör models.xml olarak kaydedin.

Sistem dengesinin kararlı durum analizi için SQUAD yazılımını açın, ağı yükle'ye tıklayın ve jove tümör models. xml dosyasını yükleyin. Tıklayın, analizi çalıştırın.

Bir simülasyon protokolü yazmak için, anit-EGFR direncini simüle etmek için gelişmiş ve pertübatöre tıklayın, ardından protokolü düzenle'ye tıklayın. Ardından, pertübasyona tıklayın ve standart başlangıç durumunu seçin ve kararlı durum dörde eşittir. Yeni sabit darbeyi eklemek için ekle'ye tıklayın, ardından durum parametresini seçin ve hedefi FLIP olarak, zamanı sıfıra ve değeri 4 olarak ayarlayın.

Tamam'a tıklayın ve c-MET ve Gefitinib durumlarını aynı şekilde ayarlayın. Etkin EGFR düğümüne bir durum değeri ayarlamak için, etkin düğüm'e tıklayın, ardından düzenle'ye tıklayın. Durumu 8 olarak ayarlayın ve Tamam'a tıklayın.

Protokolü kaydetmek için Tamam'ı tıklatın. Belirli eğrileri görüntülemek için, seçenekler panelinin altında EGF-EGFR, yıldız EGF-EGFR, yıldız Mek, kaspazlar, PI3K, Gegitinib, apoptoz, proliferasyon, MEk inhibitörü ve PI3K inhibitörü öğesini seçin. Ardından, sistem yanıtının tam bir simülasyonunu başlatmak için başlat ve çalıştır'a tıklayın.

Kombine PI3K ve Mek inhibitörü tedavisini simüle etmek için protokolü düzenle'ye tıklayın. Ardından, az önce gösterildiği gibi aynı düğüm parametresini kullanarak, yeni bir sabit darbe eklemek için pertübasyona ve ardından ekle'ye tıklayın. Ardından, bir durum parametresi seçin ve hedefi PI3K inhibitörü olarak, zamanı sıfıra ve değeri bire ayarlayın ve Tamam'a tıklayın.

Başka bir yeni sabit darbe eklemek için tekrar ekle'ye tıklayın ve durum parametresi altında hedefi Mek inhibitörü olarak ayarlayın, zamanı sıfıra ve değeri bire ayarlayın ve protokolü kaydetmek için Tamam'a ve ardından tekrar Tamam'a tıklayın. Seçenekler panelinin altında, az önce gösterildiği gibi grafiksel gösterim için aynı düğümleri kullanarak, başlat'a tıklayın ve sistem yanıtının tam bir simülasyonunu başlatmak için çalıştırın. Ardından, simülasyonu tamamlamak için sıfırla'ya tıklayın.

Bu 3D tümör test sistemi, proliferasyon indeksinin belirlenmesini kolaylaştırır. Ve M30 Elisa kullanılarak apoptozun ölçülmesi. Bu temsili deneyde, örneğin, statik kültür koşulları altında inkübe edilen sadece EGFR mutasyona uğramış HCC827 tümör hücreleri, epidermal büyüme faktörü inhibisyonuna yanıt verdi.

Tirozin-kinaz inhibitörü Gefitinib tarafından, HCC827 tümör model sisteminde gözlenen apoptozdaki artışla açıkça görüldüğü gibi. Burada, Epitelyal-Mezenkimal geçiş indükleyicisi, TGF-beta-1 simülasyonu olan veya olmayan statik 3D tümör modellerinin temsili görüntüleri gösterilmektedir. Tedavi edilen tümör hücre kültürlerinde vimentin ekspresyonundaki artışa dikkat edin.

Dinamik koşullar altında, Gefitinib, tedavi edilmemiş kontrollü kültüre kıyasla, Tirozin-kinaz inhibitörünün varlığında doku benzeri yapıların azalmasıyla kanıtlandığı gibi, EGFR mutasyona uğramış HCC827 hücreleri üzerinde sağlam bir etki gösterir. Bu grafikte, mutasyonda bilinen sürücünün simülasyonu, EGFR ve c-MET koaktivasyonu ve artan proliferasyon hızı ve HCC827 hücrelerinde zaman içinde azalmış bir apoptoz oranı gözlenmiştir, bu da MEK ve PI3K'nın aktivasyonu ile ilişkili olan Gefitinib kaynaklı bir direnci yansıtır. Gerçekten de, kombine PI3K ve MEK inhibitörlerinin modellenmesi, anti-EGFR direnç etkisinin tersine çevrilmesine, proliferasyonda bir azalmaya ve apoptozun indüksiyonuna neden olur.

Bu prosedürü takiben, Western Blot veya aşağı akış sinyalizasyon yollarını araştırmak için diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Ayrıca, tümör mikro ortamındaki çeşitli hücreler arasındaki çapraz konuşmayı analiz etmek için farklı hücre tiplerine sahip ko-kültür sistemleri de kullanılabilir. Bu teknik, ilaç geliştirme alanındaki araştırmacıların in Silico ilaç etkinliğini keşfetmelerinin önünü açmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, sinyal değişikliklerini simüle ederek ve farklı mutasyon ve arka planlarda ortaya çıkan sistem yanıtlarını analiz ederek, tabakalı hasta gruplarında ilaç etkinliğinin nasıl tahmin edileceğini iyi anlamış olmalısınız.