Name: qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Öğrenin, küçük hücre dışı akciğer kanseri hastalarının plazmasından ekzom izolasyonu ve enzimatik ön işlemle saf mikroRNA analizi yöntemini. Bu teknik biyobelirteç araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma aynı zamanda MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) hibesi 2014 tarafından finanse edilmiştir.

1. Exosome İzolasyonu Not: Plazma örneklerinden eksozomlann izole, üreticinin protokolüne uygun olarak ve ekleme RNAse işlenerek, ticari bir kit ile gerçekleştirildi: (bu adım biyolojik numunelerin manipülasyonu için özel yasal prosedür takip kişisel ve çevre koruma ekipmanları ile gerçekleştirilmelidir ). <ol><li> -80 ° C&#39;de saklandı Her örneğin plazma 1 ml, alın ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüjleyin; Bu pasaj hücreleri ve enkaz kaldırmak için zorunludur. </li><li> yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe temiz plazma ihtiva eden üst sıvıyı aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süre ile 10,000 x g &#39;de, yeni bir tüp santrifüjleyin. </li><li> yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe temiz plazma ihtiva eden üst sıvıyı aktarın. </li><li> 10 dakika içinde 37 ° C &#39;de tüp süpernatana RNAse 100 ng / ml ilave edilir ve kuluçkayaSipariş RNA&#39;ların dolaşan aşağılamak için. </li><li> Yeni 2 ml tüp tüm tedavi plazma aktarın ve 1x PBS 0.5 hacim kazandırmak. </li><li> çözümler karıştırmak için örnek vorteksleyin. </li><li> Örnek Proteinaz K çözeltisi (kit içine) 0,05 hacimleri ekleyin. </li><li> Girdap numune ve daha sonra 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> örnek exosome yağış tamponu 0.2 hacim kazandırmak ve tersine çevirerek çözüm karıştırın. </li><li> 30 dakika boyunca 8 ° C, 2 ° C &#39;de örnek inkübe ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika için 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aspire ve supernatant atın. Pelet izole eksozomlar içerir. </li><li> eksozomlar tekrar süspansiyon için, eksozom pelet seçili geçici bellek ekleyin. Tampon seçimi, bu durumda, planlanan alt analiz bağlıdır: <ol><li> TEM analizi gerçekleştirmek için 1x PBS 100 ul ekle. </li><li> Spesifik liziz BUF 346.5 ul ekle(Ticari kit) RNA ekstraksiyonu (: kimyasal tehlike DİKKAT) için fer. </li><li> ekstraksiyon için lizis tamponu 100 ul ekle (Tris-HCI 50 mM, pH 7.6 - NaCl 300 mM - Triton X-100% 0.5 - PMSF 1 mM - Löpeptin / Aprotinin 10 ug / ml) Western Blot analizi gerçekleştirmek için. (DİKKAT: kimyasal tehlikeler). </li></ol></li><li> -20 ° C&#39;de yeniden süspansiyon haline eksozomlar saklayın. </li></ol> Western Blot analizi ile 2. Exosome Karakterizasyonu Not: İzole nanovesicles karakterize etmek için, Alix ve TSG101 (iyi bilinen exosomal işaretleri) karşı antikorlar ile Western blot önerilir. <ol><li> Liziz tamponu eksozom pelet yeniden süspansiyon işleminden sonra, exosomal membran çözünmesi için 1 saat boyunca buz üzerine yerleştirin. </li><li> 10 dakika için 12,000 g&#39;da lizat santrifüj ile pelet bozmadan yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. </li><li> toplam exosomal protein conten ölçmekBradford tahlili ya da başka yöntemler ile T ve yük Tris / glisin SDS içinde oyuk başına proteinlerin 50 ug -% 8 poliakrilamid jeli. (DİKKAT: kimyasal tehlikeler). </li><li> kimyasal: (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS), 1 saat boyunca 120 V&#39;de 30 dakika (DİKKAT tamponu ile çalışan,% 8 SDS-PAGE jel elektroforezi proteinleri (ve uygun moleküler ağırlıklı işaretleyici) Ayrı ). </li><li> (: Kimyasal tehlikeler DİKKAT) sabit bir 50 V de 1 saat boyunca 4 ° C soğuk transfer tampon maddesi (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 20 metanol) ile yapılan elektro bir nitroselüloz membran proteini aktarın. </li><li> 1x TBS -Tween% 0.1 içinde% 5 yağsız kuru süt ile yavaş ajitasyon 1 st için membran engeller. </li><li> Tween,% 0.1 - 1 x TBS ile hızlı bir çalkalama, 5 dakika boyunca zarın 4 kez yıkayın. </li><li> Alix ve uygun tampon içinde TSG101 (membranı başına bir) karşı birincil antikor ekleyin (buna göre üreticiden antikor veri sayfasına) ve membran O / N inkübe; Yavaş ajitasyon. </li><li> Aşırı antikorları ayıklamak için Tween,% 0.1 - 1 x membrana TBS ile hızlı bir çalkalama içinde 5 dakika için 5 kez yıkayın. </li><li> Uygun tampon maddesi içinde (dolayısıyla bir üreticiden antikor veri sayfasına) uygun bir ikincil antikor ilave edin ve yavaş ajitasyon 1 st için membran inkübe edin. </li><li> Aşırı antikorları ayıklamak için Tween,% 0.1 - 1 x membrana TBS ile hızlı bir çalkalama içinde 5 dakika için 5 kez yıkayın. </li><li> Kemiluminesan analizi 11 tarafından seçilen protein algılar. </li></ol> TEM Analizi ile 3. Exosome Karakterizasyonu Not: İzole eksozomlar görselleştirmek için, TEM (Transmisyon Elektron Mikroskobu) analizi yapılmıştır. <ol><li> Talep ~ 10 ug, bir Parafilm 1x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi sağlam eksozomlann numunenin (daha önce Bradford tahlili ile nicelleştirilmiştir) ve örnek alınır, 1 saat boyunca bir formvar karbon kaplı nikel ızgara bırakın. </li> &lt;li&gt; PBS damla 1x üç 40 ul üzerine konumlandırarak grid 3 kere yıkayın. </li><li> Beş 30 ul ultra saf su damlaları üzerine konumlandırarak ızgara 5 kez yıkayın. </li><li> 10 dakika:% 2.5 gluteraldehit (kimyasal tehlike DİKKAT) bir damla ekleyerek örnek sabitleyin. </li><li> PBS damla 1x üç 40 ul üzerine konumlandırarak grid 3 kere yıkayın. </li><li> % 2 uranil asetat bir damla ekleyin (DİKKAT: kimyasal tehlikeler) ve örnek kontrast için 15 dakika süreyle bunun üstüne ızgara koydu. </li><li> % 0.13 metilselüloz damla örnek yerleştirme (DİKKAT: Kimyasal tehlikeleri) ve% 0.4 uranil asetat ve 10 dakika boyunca damla üstüne ızgara inkübe edilir. </li><li> Yavaşça bir emici kağıt sıvı aşırı kaldırmak ve kaplamalı yüzü yukarı bakacak şekilde 5 dakika süreyle ızgara kurutun. </li><li> Transmisyon elektron mikroskobu 12 tarafından ızgara inceleyin. </li></ol> 4. Exosomal RNA Ekstraksiyon ve miktarının belirlenmesi Not: yönlü kullan kararüreticinin protokolüne göre, bir ticari kit kullanılarak exosomal örneklerinden total RNA ekstraksiyonu kapatýnýz: (DİKKAT: kimyasal tehlikeler, üreticinin protokolü ve yönergeleri gözden). <ol><li> lizis tamponu 346,5 ul exosome pelet tabanda sonra β-mercaptoethanol 3.5 ul ekleyin: kuvvetlice (DİKKAT kimyasal tehlikeler) ve vorteks; Bu pasaj, lipid membranlar yok etmek için zorunludur. </li><li> 1 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de bir toplama tüpüne ve santrifüj yıkama kolonuna lizat ekleyin. Santrifüj işleminden sonra, kolon atın ve yeni bir 1.5 mL RNaz içermeyen tüp filtrat aktarın. </li><li> % 70 Etanol 350 ul ekleyin (DİKKAT: kimyasal tehlikeler) ve 5 saniye boyunca vorteks karıştırın. </li><li> 8000 x g&#39;de 30 saniye boyunca çözme sütun ve santrifüj lizat yükleyin. Santrifüj işleminden sonra flowthrough atmak ve yeni bir toplama tüpüne sütun aktarın. </li><li> tuzsuzlaştırma Buffe 350 ul yükleyin1 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de r ve santrifüj. Santrifüj işleminden sonra flowthrough atmak ve aynı toplama tüpüne sütun döndürür. </li><li> sütun silis membranı üzerinde DNaz I, reaksiyon karışımı 95 ul (yeniden DNase 10 ul I her bir örnek için, DNase tamponu 90 ul +) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. (DİKKAT: kimyasal tehlike) </li><li> 1 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de kolon ve santrifüj: (kimyasal tehlike DİKKAT) yıkama tamponu 200 ul ekleyin. Yeni bir toplama tüpüne sütun yerleştirin. </li><li> 1 dakika süre ile 11,000 x g &#39;de kolon ve santrifüj yıkama tampon 600 ul ekle. Santrifüj işleminden sonra, flowthrough atmak ve aynı toplama tüpüne sütun yerleştirin. </li><li> 2 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de kolon ve santrifüj yıkama tamponu 250 ul ekleyin. 1.5 ml RNAse ücretsiz tüp içine sütun yerleştirin. </li><li> 11.000 RNaz içermeyen su 40 ul RNA ve santrifüj Zehir<html> 5; için 1 dakika için G, bu küçük bir hacim içinde, yüksek bir RNA konsantrasyonu elde etmek için. </li><li> Hemen -80 ° C &#39;de potansiyel degradasyonu veya mağaza önlemek için buz üzerinde elüt RNA yerleştirin. </li><li> RNA içeriği ölçmek. Not: Burada, RNA nicemleme spektrofotometre ile numunenin 1 ul kullanılarak yapıldı. </li></ol> Exosomal miRNA&#39;lar 5. Retrotrascription Not: eksozom bölgesindeki miRNA&#39;ların içeriği açıklanan sınırlı miktarına, her miRNA için ayrı bir deney kullanılarak ticari bir kit ile seçilen miRNA&#39;ların ters transkripsiyon yapılmasına karar edildi nedeniyle, imalatçının protokolüne göre yöntem. Her bir örnek için, NSCLC durumuna ilişkili 8 miRNA&#39;ların (miR-30b seçilmiştir; miR-103;, miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222 ve miR-1228- miR-30 3p), endojen kontrol olarak. <ol><li> Ters transkripsiyon ana karışımı (RT mix) hazırlayın. de tarif edildiği gibi, her bir reaksiyon için, RT karışımı 7 ul hazırlanmasıhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx&quot;&gt;Table 1 (indirmek için tıklayınız) (DİKKAT: kimyasal tehlike). Not: Bu deneyde, 9 farklı RT karışımı, her bir numune için hazırlanmıştır. </li><li> İyice karıştırın ve buz üzerinde RT karışımı saklayın. Reaksiyon tüp başına RT karışımı 7 ul ekleyin. </li><li> Reaksiyon tüp başına numune RNA (toplam RNA 10 ug) 5 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> İlgili reaksiyon tüpüne set her testte: (kimyasal tehlike DİKKAT) 5x ters transkripsiyon primerlerin 3 ul ekleyin. </li><li> Yavaş karıştırın tüpü kapatmak ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> termal döngü halinde, reaksiyon tüpü yük ve 30 dakika boyunca 16 ° C &#39;de, aşağıdaki parametre değerleri (TUT ters transkripsiyon reaksiyonu başlatmak, 30 dakika boyunca 42 ° C&#39;de tutuldu; 5 dakika için 85 ° C de sabit; TUT ∞ 4 ° C). </li></ol> Exosomal miRNA&#39;lar 6. Real Time PCR Analizi Not: Bu analiz olduNumune başına üç biyolojik ve teknik çoğaltır ile Real Time PCR (qPCR) için bir ticari kit kullanılarak yapıldı. <ol><li> Her reaksiyon için, Real Time PCR karışımı 17.67 ul (PCR Master Mix + Nükleazlar içermeyen su 7.67 ul 10 ul) hazırlamak, karıştırın ve buz koymak. (DİKKAT: kimyasal tehlike) </li><li> (: Kimyasal tehlike DİKKAT) 20x qPCR primerlerin, her PCR tüpü için, 1 ul ekleyin. </li><li> Her iyi plakada qPCR karışımı 18.67 ul yerleştirin. </li><li> muhabir iyi plaka içine ters transkripsiyon ürünü 1.33 ul ekleyin. </li><li> plaka kapatın ve (300 gx 5 sn) dönerler. </li><li> Gerçek Zamanlı PCR sisteminin plaka yerleştirin ve Aşağıdaki PCR koşulları kullanılarak Çalışan: 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de sabit; 95 ° C&#39;de 15 saniye ve 60 ° C&#39;de 60 saniye 40 döngü. ΔΔct 13 - işlem, formül 2&#39;ye göre veri normalleştirmek ve. </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+patients+with+NSCLC+that+do+not+respond+to+treatment+with+EGFR+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors.</a> Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies+in+lung+cancer%3A+the+new+ambrosia+of+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers.</a> Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).</li>
<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+proteomics+to+understanding+the+role+of+tumor-derived+exosomes+in+cancer+progression%3A+state+of+the+art+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+shuttling+of+miR-126+in+endothelial+cells+modulates+adhesive+and+migratory+abilities+of+chronic+myelogenous+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells.</a> Mol Cancer. 11, (2014).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+in+vitro+and+in+vivo+chronic+myelogenous+leukemia+cells+growth%3A+a+possible+role+for+exosomal+disposal+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Garofalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+TRAIL+resistance+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+miR-1228+as+a+stable+endogenous+control+for+the+quantification+of+circulating+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients.</a> Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).</li>
<li>Alessandro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carboxyamidotriazole+on+in+vitro+models+of+imatinib-resistant+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia.</a> J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Mesenchymal+Stem+Cells+Relieve+Acute+Myocardial+Ischemic+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>Yoko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+MDR%271and+induction+of+doxorubicin+resistance+by+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+%28FK228%29+and+ATRA+in+acute+promyelocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells.</a> Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).</li>
</ol>

Tüm yazarlar rekabet eden hiçbir finansal çıkar beyan etmemektedir.

Bu kombine protokolü sayesinde KHDAK hastalarının plazmadan bir exosomal miRNA analizi gerçekleştirmek mümkün olmuştur. Bu veriler, bir hastalık durumu göstermektedir, ancak bu daha fazla çalışma ile teyit edilmesi gerekmektedir. Bu yazıda kullanılan protokol, eksozom izolasyonu için ticari bir kit dayanıyordu. Sebebi bilinen diğer izolasyon prosedürleri (örneğin., Yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon) sınırlı bir standardizasyona lider, daha fazla manuel prosedürleri gerektiren old...

KHDAK (küçük hücre dışı akciğer kanseri) hastalarında düşük sağkalım oranı ilerlemiş hastalık ve kötü erken teşhis 1 tedavilerin sınırlı etkinliği kaynaklanmaktadır. NSCLC hasta alt grubunda keşfedilmiştir EGFR gen aktive eden mutasyonu, kinaz inhibitörleri (TKİ) tirozin hassasiyet kazandırdığı bilinmektedir. Ne yazık ki, EGFR mutasyona uğramış KHDAK hastalarının çoğunluğu TKİ direncini 2 gelişir. Özellikle, bu bağlamda, bir doğru tanı zorunludur. nedeniyle tümörlerin lokalizasyonu, için, genel olarak KHDAK biyopsi dokusu elde her zaman mümkün değildir. Bu nedenle, çeşitli çalışmalar bu biyolojik veriler elde etmek non-invaziv yöntemler kullanan devam etmektedir. Eksozomlar non-invaziv tekniklerin 3 ile tanısal ve prognostik değerlerini elde etmek için incelenmiştir olabilir sıvı biyopsi bileşenler olarak tarif edilmiştir. e - (100 nm çapında 40) eksozomlar nanovesicles vardırFizyolojik ve patolojik koşullar 4 hem de farklı hücre tipleri tarafından yayımlanan ndocytic kökenli. Onlar, protein, lipidler, mRNA ve microRNA taşıyabilir. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda tümör hücreleri, anjiyogenez, stromal ve hücre dışı matriks yeniden ve ilaç direncinin 5 büyüme ve hayatta kalma etkileyebilir tümör kaynaklı Eksozomlann, bir pleiotropik rol oynadığını düşündürmektedir. MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;ların) hedef mRNA 3&#39;-UTR bağlanması ve bozunmaya karşı ya da olmayan bir çeviri 6 mRNA lider, transkripsiyon sonrası düzenleme katılan kısa kodlayıcı olmayan RNA bulunmaktadır. Eksozomlann içine miRNA&#39;ların seçici sıralama tarif edilmiştir. Bu bağlamda, son zamanlarda, in vitro ve in vivo olarak, kurkumin tedavisi 7 sonrası kronik miyelojen lösemi hücre hatları tarafından yayımlanan eksozom Mir-21 (onkogenik etkiler ile iyi bilinen bir miRNA&#39;nın) seçici bir ambalaj gösterilmiştir. exosomal miRNA profil primer tümörün miRNA profiline benzer ve bu özellik erken tanı ve prognoz 3 yararlanılabilir. Spesifik olarak, gerçek zamanlı PCR ile, karakterize etmek için bir olasılık, hastalığın moleküler profili ile ilişkili seçilen miRNA&#39;lar örn., Diğerlerinin 8 arasında EGFR mutasyonları. Burada, NSCLC dekorele miRNA&#39;ların 8-9 seçilmiş bir panelin analizi NSCLC hastaların kanında serbest eksozom izole edildi açıklanmaktadır. hastalardan onam raporu bilgilendirmek alındıktan sonra, 12 KHDAK hastalarında ve 6 sağlıklı kontrollerin plazma, analiz edildi. eksozom yalıtım üreticinin protokolüne göre, ticari kiti ile gerçekleştirildi. eksozom izolasyon önce plazma numuneleri kirletici dolaşım miRNA&#39;lar indirgeme amacıyla, RNase ile muamele edilmiştir. Biz nedeniyle diğer Techni sınırlı standardizasyona ticari kit ile bu analizi gerçekleştirmek için kararklinik örneklerden çalışırken özellikle önemlidir ques (örn., Ultrasantrifügasyon). Bu kit RNAse aşağılamak ve böylece exosome Parçalama işleminden sonra exosomal miRNA&#39;lar düşmeye riskini azaltır bir Proteinaz K tedavisi içerir. MikroRNA analizi duyarlı ve spesifik Real-Time PCR analizi ile yapıldı; mir 1228-3p, formül 2&#39;ye uygun bir endojen bir kontrol olarak kullanıldı ve veri normalleştirildi - ΔΔct. Kontrol değerleri temel olarak kullanılır ve Sonuçlar bir logaritmik skalada gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Total eksozom izolasyon kiti (plazmadan)</td><td>&nbsp; İnvitrojen</td><td>4484450</td><td>Kullanımı Proteinaz K tedavisi</td></tr><tr><td>Ribonükleaz A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ALIX Antikoru (3A9)</td> <td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>TSG-101 Antikoru (C-2)</td> <td>SantaCruz Biyoteknoloji</td><td>SC-7964 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse HRP 1 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra mini kit 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30b TaqMan MicroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30c TaqMan MikroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-122 TaqMan MikroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-195 TaqMan MikroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-203 TaqMan MicroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-103 TaqMan MicroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td>000439</tr><tr><td>has-miR-221 TaqMan MicroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-222 TaqMan MicroRNA testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td></tr></tbody></table> yok

qpcr sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (khdak) hasta plazma içinde exosomal mirna analizi: bir uygulanabilir sıvı biyopsi aracı

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

NSCLC'de diğerlerinin yanı sıra EGFR ve ALK genlerindeki değişikliklerin keşfi, seçici tirozin kinaz inhibitörleri (TKI'ler) kullanılarak hedefe yönelik ilaç tedavisinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu TKI'lerin kullanımını optimize etmek için, erken teşhis ve hastalığın ilerlemesi için yeni biyobelirteçlerin keşfi zorunludur. Bu plazma izole eksozomlar, bu biyobelirteçlerin tespiti ve takibi için non-invaziv ve tekrarlanabilir bir yol olarak kullanılabilir. Farklı mutasyonlara ve tedavilere sahip 12 KHDAK hastasından (ve kontrol olarak 6 sağlıklı donörden) bir ml plazma eksozom kaynağı olarak kullanıldı. RNAse işleminden sonra, dolaşımdaki miRNA'ları parçalamak için, eksozomlar ticari bir kit ile izole edildi ve daha fazla analiz için spesifik tamponlarda yeniden süspanse edildi. Eksozomlar, ALIX ve TSG101 için western blotlama ve bu nanoveziküllerin biyokimyasal ve boyutsal verilerini elde etmek için standart teknikler olan transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analizi ile karakterize edildi. Total RNA ekstraksiyonu, yüksek verimli bir ticari kit ile gerçekleştirildi. Eksozomlardaki sınırlı miRNA içeriği nedeniyle, seçilen her miRNA için ayrı bir test kullanarak retro-transkripsiyon PCR yapmaya karar verdik. Tümü NSCLC hastalığı ile ilişkili olan bir miRNA paneli (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), Gerçek Zamanlı PCR analizinin dikkate değer duyarlılığı ve özgüllüğünden yararlanılarak analiz edildi; Endojen kontrol olarak mir-1228-3P kullanıldı ve veriler 2-ΔΔct 13 formülüne göre işlendi. Kontrol değerleri referans değer olarak kullanılmış ve sonuçlar logaritmik ölçekte gösterilmiştir.

KHDAK hastalarının 12 plazma ve 6 sağlıklı kontrol olmak üzere toplam plazmadan exosome izolasyonu için ticari kit ile işlendi. Her bir numune, exosomal belirteçleri alix (96 kDa) ve TSG101 (43 kDa) değerlendirmek için Western Blot analizi ile işlenmiştir. Bu sonuçların bir örneği, plazma örneklerinden eksozom izolasyonu bu protokol ile mümkün olduğunu gösteren, Şekil 1 &#39;de 3 örnek için gösterilmiştir. biy...

Bu protokol, dolaşımdaki miRNA'ların kontaminasyonunu önlemek ve NSCLC'deki biyobelirteç özelliklerini değerlendirmek için NSCLC hastalarının plazmasında salınan eksozomlarda miRNA profillemesinin Proteinaz K ve RNAse tedavileri ile ticari bir eksozom izolasyon kiti aracılığıyla gerçekleştirilmesinin fizibilitesini açıklar.

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Bu prosedürün genel amacı, ekzozom izolasyonu öncesinde çift enzim uygulaması kullanarak, serbest dolaşan mikro RNAz gibi ekzozomal olmayan mikro RNA kaynaklarından arındırılmış NSCLC hastalarının plazmasında bulunan ekzozomları izole etmektir. Bu yöntem, mikro RNA lipid biyopsilerinin ekzozom kompartmanına yönelik analizine yardımcı olarak, bunların biyobelirteç olarak kullanımının aydınlatılmasına katkı sağlayabilir. Bu prosedürün temel avantajı, analizi etkileyebilecek ekzozomal olmayan mikro RNA kaynaklarını ortadan kaldıran enzimatik ön işlemdir.Başlamak için, 1 mL'lik plazma örneğini buz üzerinde çözdürün. Çözüldüğünde, oluşmuş olabilecek kriyopresipitatları dağıtmak için tüpü birkaç kez tersyüz edin. Ardından, hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak amacıyla plazmayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 2,000 G'de santrifüjleyin.Süpernatantı toplayın ve plazmayı bu kez 20 dakika boyunca 10,000 G'de tekrar santrifüjleyin. Plazma süpernatantını yeniden toplayın ve şimdi 10 µL RNase ekleyin. Plazmayı bir termoblok ısıtıcıda 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.Serbest mikro RNAz'ı degrade etmek amacıyla standart ana protokole RNaz işlemi adımını ekledik. Daha sonra, eksozomal mi

exosomal-mirna-analysis-non-small-cell-lung-cancer-nsclc-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

MicroRNA'lar (miRNA'lar), gen ekspresyonunu düzenleyen dokuya özgü, küçük, kodlamayan RNA'lardır ve akciğer kanserinin erken teşhisi için ideal adayları temsil edebilir. Öne çıkan protokolde, erken akciğer kanseri taraması için hasta kan örneklerinden mikroRNA'yı izole edeceğiz.

miRNA Ekstraksiyonu: Plazma Örneğinden miRNA'yı Çıkarmak İçin Bir Yöntem

Plazma izole eksozomlar, erken teşhis ve hastalığın ilerlemesi için biyobelirteçlerin tespiti ve takibi için invaziv olmayan ve tekrarlanabilir bir yol olarak kullanılabilir. Bu video, DNA ve protein ekstraksiyonları için kullanılabilecek küçük hücreli dışı akciğer kanseri hastalarının plazma örneklerinden eksozomların ayrılması için protokolü açıklamaktadır.

Eksozom İzolasyonu: Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Hastalarının Plazmasından Eksozomları Ayırmak İçin Bir Teknik

Bu videoda, organik ekstraksiyon kullanılarak kolorektal kanser hastalarının plazma örneklerinden dolaşımdaki mikroRNA'nın ekstraksiyonu ve ardından cam elyaf kolon zenginleştirme işlemi açıklanmaktadır. miRNA'lar serum ve plazma gibi biyolojik sıvılarda stabildir, bu da onları kanser teşhisi, prognozu ve tedavi kararı verme ve izleme için ideal dolaşımdaki biyobelirteçler haline getirir. Bu yöntem, hastalarda klinik sonuçları tahmin edebilen yeni dolaşımdaki biyobelirteçlerin tanımlanmasına...

Dolaşımdaki miRNA Ekstraksiyonu: Organik Ekstraksiyon ve Küçük RNA Zenginleştirme Yoluyla Plazma Örneklerinden miRNA'yı İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Burada, BioMILD kabul edilen detaylı Protokolü deneme erken akciğer kanseri teşhis için dolaşımdaki mikroRNA imza Sınıflandırıcısı sınama gerçekleştirmek için eleme mevcut.

MikroRNA tabanlı sıvı biyopsi: Plazma miRNA imza Sınıflandırıcısı (MSC) akciğer kanseri süzmek için bir deneyim

Algılama ribonükleik asit (cRNA) kan dolaşan bir karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis olduğunu. Burada küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda hassas ve belirli dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak üzerinden cRNA karakterize yöntemleri açıklanmaktadır. Testleri 72 saat içinde füzyon türevlerini algılamak için tasarım gereksinimlerini karşılamak.

Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

Biz mikroRNA (miRNAs) dolaşan ifade düzeylerini değerlendirmek için bir protokol kanserli hastalarda plazma örnekleri mevcut. Özellikle, biz piyasada bir kit miRNA çıkarma ve ters transkripsiyon dolaşan için kullanılır. Son olarak, gerçek zamanlı önceden benekli sonda özel plakaları kullanarak 24 seçili miRNAs oluşan bir panel analiz ettik.

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

Hastalıklı ve malign hücreler için dış türev biomarkerlerin klinik çevirisi, hızlı ve doğru ölçme yöntemlerinin olmaması ile engellenmiştir. Bu raporda, küçük hacimli serum veya plazma örneklerindeki belirli dış alt türleri ölçmek için düşük büyütme koyu alan mikroskop görüntülerinin kullanımı açıklanmaktadır.

Tümör türevi Exosomes ölçmek için Nanoplasmon-gelişmiş saçılma ve düşük büyütme mikroskop görüntüleme kullanma

Tedavi direnci genellikle ileri prostat kanseri olan hastalarda gelişir, ve bazı durumlarda, kanser nöroendokrin prostat kanseri denilen ölümcül bir alt tip ilerler. Bu geçişi kolaylaştıran küçük kodlamayan RNA aracılı moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi, daha iyi hastalık tabakalaşmasına ve nöroendokrin prostat kanserigelişimine yol açan nedensel mekanizmaların tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.

Formalin-sabit Dokulardan Küçük Kodlamaz RNA'nın ve Kastrasyona Dirençli Prostat Kanseri Hastalarından Serum Türetilmiş Ekzozomların Dizilimi

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Etiketli hücreleri çok foton mikroskobu ile dil içinde ağız kanseri ve tümör invazyonu niceliksel olarak izlenmesi bir fare modeli üreten yer alan tekniklerin kapsamlı bir bakış sunulmaktadır. Bu sistem, anti-invaziv bileşiklerin moleküler değerlendirme ve ilaç etkinliği için faydalı bir platform olarak hizmet verebilir.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Öğrenin, küçük hücre dışı akciğer kanseri hastalarının plazmasından ekzom izolasyonu ve enzimatik ön işlemle saf mikroRNA analizi yöntemini. Bu teknik biyobelirteç araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı (Video) | JoVE Journal

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı

Daha fazla video keşfet