Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

LAM için hazırlanan bu protokolün genel amacı, transkripsiyonel analiz için yüksek bütünlüklü RNA üretimi amacıyla spesifik bitki hücrelerini izole etmektir. Çalışma, seksüel ve apomiktik boechera türlerindeki yumurta hücreleri gibi erişilmesi zor hücrelere odaklanmaktadır. Bu yöntem, tohum yoluyla gerçekleşen seksüel ve aseksüel bitki üremesinin temelindeki transkripsiyonel mekanizmalar gibi bitki gelişim genetiği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, belirli hücre tiplerine özgü stillerin uygulanabilmesidir. Bu sayede, aterojenez dokularının analizinde nadir hücre tiplerinin transkripsiyonlarının maskelenme etkisi aşılır. Bu prosedüre başlamak için, bloklama istasyonunu kullanarak önceden ısıtılmış, taze plastik dengeleme tepsisini 56 °C'de eritilmiş parafin mumu ile doldurun.

Parafin banyosunun kapağını kaldırın ve kasetleri tek tek alın. Bir örneği, denge tepsisindeki 56 degree Celsius sıvı parafin mumuna aktarın. Kaseti taşırken örneğin etrafındaki mumun donmasını önlemek için işlemleri hızlıca gerçekleştirin.

Ardından, bir hazırlama iğnesi kullanarak örneği deneysel tasarıma göre konumlandırın. Tüm örnekler aktarılana kadar prosedürü tekrarlayın. LAM için ince kesitler hazırlamak amacıyla, ışıklı bir masa üzerinde, plastik tepsideki örneğin parafin mumunu temizleyin.

RNaz içermeyen bir jilet kullanarak, tomurcuk veya çiçek gibi örneği içeren mum bloğu çıkarın. Ardından, bir spatulanın ucunda küçük bir parafin mumu damlasını eritin. Sıcak mumu, gömülü örneği içeren bloğu destek ünitesine sabitlemek için kullanın.

Numuneyi çevreleyen fazla mumu bir jilet yardımıyla temizleyin ve bloğun paralel kenarlara sahip kare bir yüzeye sahip olduğundan emin olun. Ardından, ısıtma plakasını 42 °C'ye ayarlayın. Numuneyi güvenli bir şekilde mikrotoma monte edin.

Boechera olgun gametofiti hücreleri için yedi mikrometre kalınlığında kesitler hazırlayın. Ardından, 10 ila 15 santimetre uzunluğundaki parafin şeritlerini, LAM lamlarına yerleştirmeden önce alt kısmı siyah kartonla kaplı plastik bir kutuya aktarın. Lamları LAM için hazırlamak için, düz yüzeyleri yukarı bakacak şekilde beş ila on adet metal çerçeveli lamı ısıtma plakasına yerleştirin.

Lamların plastik kısmına bir ila iki mililitre RNase-free su pipetleyin. Bir jilet kullanarak, parafin şeritleri yaklaşık dört ila beş santimetrelik kısa parçalar halinde kesin. Parçalar, lamların plastik pencerelerini kaplayacak yeterlilikte uzunlukta olmalıdır.

Ardından, bir cımbız ve preparasyon iğnesi kullanarak parafin şeritlerini lamların plastik penceresine birbirine paralel olacak şekilde yerleştirin. Suyu uzaklaştırmak için lamları bir uçlarından dikkatlice kaldırın ve tekrar yerine yerleştirin. Lamlara dokunmadan ısıtma plakasının üzerini plastik bir kapakla örtün ve plastik kapağın hava alışverişine izin verdiğinden emin olun.

Lamları 42 °C'de gece boyunca kurutun. Kimyasal çeker ocuk altında, lamlardaki parafini xylol içerisinde her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez temizleyin. Lamların sadece plastik kısmının daldırıldığından emin olun ve lamları kolayca çıkarabilmek için metal çerçevenin geniş ucunu kuru tutun.

LAM öncesinde lamların kimyasal çeker ocakta 10 dakika boyunca kurumasına izin verin. Bu prosedürde, LAM için bilgisayarı ve mikroskobu açın. Ardından, mikroskobu ve lazeri yöneten programı başlatın.

Lazer kontrol kutusunu açın ve kontrol kutusundaki ilgili düğmeye basarak lazeri çalıştırın. Ardından, bir kapağı kap tutucuya yerleştirin. LAM lamını bir mikroskopi cam lamı üzerine yerleştirin ve dokuların yapışık olduğu lamın düz yüzeyinin cam lama baktığından emin olun.

Ardından, lamı, altındaki cam lamla birlikte cihaza yerleştirin. Son olarak, kap tutucuyu kapla birlikte cihazda konumlandırın. 4x objektifini seçin.

Programda kapağı yukarı konumuna getirin. Ardından, lamın taramasını yapın. Lam üzerinde arama yaparak ilgilenilen yapıları belirleyin.

Kesme aşamasında tam konuma geri dönebilmek için konumlarını belirleyin ve lam üzerindeki yerlerini kaydedin. Ardından, uygun bir objektif seçin. Lazer atış düğmesine bir kez basarak lazer konumunu doğrulayın.

İdeal olarak, membranın doku bulunmayan bir kısmında gerçekleştiriniz. Kapağı aşağı konumuna getirerek, ilgilenilen hücre tipinin veya dokunun sınırlarını işaretlemek için el kalemi aracını kullanın. Örneğin, yumurta hücresi.

Kes (Cut) düğmesine basarak lazerle diseksiyonunu gerçekleştirin. Tekil hücreleri izole edebilmek için, onları doğru kesitlerde net bir şekilde tanımlamak kritik öneme sahiptir. Ayrıca, hücre tipi spesifik transkripsiyon analizini mümkün kılmak için hücrelerin çapı en az sekiz mikrometre olmalıdır.

Hücre etrafındaki sınırın tamamen diseke edilmediği durumların genellikle ekranda görülebileceğini ve bu durumda kesme işleminin tekrarlanması gerektiğini lütfen unutmayın. Bu durumda, standart olarak yazılımın kesit için otomatik olarak iki tekrar yapacak şekilde ayarlanması önerilir. Ardından kapağı kaldırın ve ilgilenilen bir yapıya sahip bir sonraki kayıt konumuna geçerek, tek bir lamdaki tüm ilgili hücreler toplanana kadar bir sonraki hücre kesitini diseke edin.

Kapağın, yeni bölümün kapaktaki boş bir konuma yapışacağı şekilde konumlandırıldığından emin olun. Tüm lamlardaki ilgili hücre tipleri izole edildikten sonra lamı cihazdan çıkarın. Kapak tutucuyu aşağı konuma getirin ve kapak yüzeyini görsel olarak inceleyin.

Numunedeki spesifik olmayan kontaminasyonları dışlamak için 4x objektifini kullanın. Ardından kapağı kapatın ve kuru kesitleri daha sonra kullanana kadar -80 °C'de dondurun.

Olgun dişi gametofitin şematik çizimi burada verilmiştir. Bunlar, dişi gametofitin karakteristik morfolojisi sayesinde yumurta hücrelerinin net bir şekilde tanımlanabildiği boechera divaricarpa'daki dişi gametofitleri barındıran tohumlara ait ince kesitlerdir. Kontrol olarak aynı lamlardan alınan daha geniş doku alanlarıyla karşılaştırıldığında, yumurta hücresi kesitlerinden analiz edilen benzer RNA kalitesi elde edilmiştir.

Elde edilen RNA kalitesi, hücre tipine özgü RNA dizileme için uygun bulunmuş ve apomiktik yumurta hücresinde eksprese edilen ancak apomiktik merkez hücrede, sinerjit hücrede veya apomiktik başlangıç hücrede eksprese edilmeyen 236 genin tanımlanmasını sağlamıştır. Bu genler arabidopsis thaliana'nın olgun seksüel gametofit hücrelerinde de tespit edilmemiştir. Gelişimsel genetikle ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla farklı türlerden diğer hücre ve doku tipleri de profillenebilir.

Bitki tohumlarının endosperm ve embriyolarındaki imprinted süreçlerin moleküler temeli gibi konular buna örnektir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, gelişimsel genetik ve bitki üremesi alanındaki araştırmacıların, Boechera cinsindeki apomiktik üremenin transkripsiyonel temelini keşfetmelerine olanak sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, lazer destekli mikro-diseksiyon kullanarak hücre tipine özgü transkripsiyon analizleri için nasıl yüksek kaliteli RNA elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.