Name: Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Öğrenin, ışık sac floresan mikroskobu kullanarak Danio rerio embriyolarında göz gelişimini canlı görüntüleme ve çoklu görünüm veri setlerini Figi ile işleme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve nörobilim araştırmalarında morfogenetik olayları yüksek çözünürlükle gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tobias Pietzsch'e güçlü açık kaynak yazılımı BigDataViewer'ı sağladığı için teşekkür etmek istiyoruz. Max Planck Moleküler Hücre Biyolojisi ve Genetik Enstitüsü'nün (MPI-CBG) Işık Mikroskobu Tesisi'ne, yani Jan Peychl, Sebastian Bundschuh ve Davide Accardi'ye teknik yardımları, çalışmada kullanılan mikroskopların mükemmel bakımı ve el yazması hakkındaki yorumları için ve BigDataServer için H. Moon'a (MPI-CBG Scientific Computing Facility) teşekkür ederiz. Film 1'i bir araya getirdiği için Julia Eichhorn'a teşekkür ederiz. Norden laboratuvar üyeleri ve Svea Grieb, el yazması hakkında birçok yararlı yorum yaptılar. Jaroslav Icha, Christopher Schmied ve Jaydeep Sidhaye, TU Dresden'de Uluslararası Max Planck Hücre, Gelişim ve Sistem Biyolojisi Araştırma Okulu'nun üyeleri ve doktora öğrencileridir. Pavel Tomancak, ERC Başlangıç Hibesi: Gelişimin Evrimi Kum Saati Modelinin Kantitatif Analizi ve İnsan Sınırı Bilim Programı Genç Araştırmacı hibesi RGY0093/2012 tarafından desteklenmektedir. Caren Norden, Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) ve Alman Araştırma Vakfı (DFG) [SFB 655, A25] tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high-content%2Fhigh-throughput+imaging+and+analysis+of+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis.</a> Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Morphogenesis%3A+Technological+Advances+and+Biological+Insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).</li>
<li>Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).</li>
<li>Chen, B. C., Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Whole-Brain+Activity+and+Development+at+the+Single-Cell+Level+Using+Light-Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy.</a> Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29+for+the+quantitative+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues.</a> Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+M+%22Quantitative+Imaging+in+Cell+Biology%22">Quantitative Imaging in Cell Biology</a>. , Elsevier Inc. 193-215 (2014).</li>
<li>Strobl, F., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+long-term+fluorescence+live+imaging+of+Tribolium+castaneum+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos.</a> Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+live+imaging+of+plant+growth+in+near+physiological+bright+conditions+using+light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy.</a> Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).</li>
<li>Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Wu, Y., Ghitani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li>
<li>Sarov, M., Barz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> bioRxiv. , 028308(2015).</li>
<li>Amat, F., Lemon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicing+of+single+plane+illumination+microscopy+images+using+groupwise+registration+and+fast+content-based+image+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22SPIEMed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion.</a> SPIEMed Imaging. 6914, 69140E(2008).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Scanned+Laser+Light-Sheet+Fluorescence+Microscopy+%28DSLM%29+of+Zebrafish+and+Drosophila+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).</li>
<li>Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair-cell+development+and+regeneration+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish.</a> Front Neuroanat. , (2013).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish embryogenesis.</a> METHODS. , 1-11 (2013).</li>
<li>Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+an+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSpinMicroscopy%3A+an+open-source+integrated+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform.</a> Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ojoplano-mediated+basal+constriction+is+essential+for+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis.</a> Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).</li>
<li>Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+Nuclear+Migration+Is+Centrosome+Independent+and+Ensures+Apical+Cell+Division+to+Maintain+Tissue+Integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity.</a> Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).</li>
<li>Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+SPIM+to+track+the+development+of+the+focal+power+of+the+zebrafish+lens%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+BiOS%22%5BJournal%5D)">Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens.</a> SPIE BiOS. 9334, 933408(2015).</li>
<li>Preibisch, S., Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Bayesian-based+multiview+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient Bayesian-based multiview deconvolution.</a> Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).</li>
<li>Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).</li>
<li>Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+volume+reconstruction+from+series+of+ultra-thin+microscopy+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections.</a> Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).</li>
<li>Fischler, M. A., Bolles, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+sample+consensus%3A+a+paradigm+for+model+fitting+with+applications+to+image+analysis+and+automated+cartography%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+ACM%22%5BJournal%5D)">Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography.</a> Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1 (1), 2(2006).</li>
<li>Stepanova, T., Slemmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+Mounting+for+Long-term+Light+Sheet+Microscopy+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).</li>
<li>Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+quantitative+analysis+of+gastrulation+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy+and+3D+tracking+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools.</a> Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).</li>
<li>Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+solutions+for+SPIMage+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open-source solutions for SPIMage processing.</a> Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).</li>
<li>Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://arxiv.org/abs/1507.08575">http://arxiv.org/abs/1507.08575</a> (2015).</li>
<li>Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+processing+and+analysis+of+large-scale+light-sheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).</li>
<li>Schmid, B., Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4, 1-10 (2013).</li>
<li>Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIM-fluid%3A+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li>
<li>McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-top+selective+plane+illumination+microscope+for+conventionally+mounted+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens.</a> Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Features+of+the+Growth+of+a+Bacterial+Species+Colonizing+the+Zebrafish+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut.</a> mBio. 5 (6), e01751-14-8(2014).</li>
</ol>

Bu video-makale yayınlanması Zeiss tarafından desteklenmektedir.

Morphogenesis embriyoyu şekillendiren ve birlikte büyüme ve farklılaşma ile olgun ve çok hücreli organizma içine döllenmiş yumurtadan ontogenezini sürücüler süreçtir. Hayvan gelişimi esnasında morfogenetik işlemler sağlıklı bir canlı örneklerin 1-3 görüntüleme iyi analiz edilebilir. Böyle bütün embriyo görüntüleme sürücü ve sinyal molekülleri degradeler, ekstraselüler matriks, damarsal, innervasyon yanı sıra çevredeki dokuya mekanik özellikleri de dahil olmak üzere gelişimini düzenleyen tüm bileşenleri korur olmasıdır. morphogenesis meydana geldiği terazi, köprü, hızlı hücre içi olaylar saatler ya da günler boyunca tüm doku gelişimi bağlamında bir dakikalık bir zaman ölçeğinde ele gerekir. Bütün bu ihtiyaçları karşılamak için dik düzlem aydınlatma mikroskobu 5 modern bir uygulama 4 geliştirildi. Başlangıçta, bu Seçici Düzlem Aydınlatma Mikroskobu (SPI seçildiE) 4; Şimdi bir all-kucaklayan vadeli Işık Sac Flüoresan Mikroskobu (LSFM) genellikle kullanılır. Lazer tarama veya eğirme disk konfokal mikroskoplar 6,7 daha az fototoksisite uyaran ederken LSFM, yüksek zaman çözünürlükte görüntüleme sağlıyor. Günümüzde, zaten orada temel ışık levha aydınlatma ilkesinin birçok uygulamaları vardır ve görüntü araştırmacılara 8-11 daha önce erişilemeyen örneklerin ve süreçlerin büyük bir çeşitlilik kullanılmıştır. Biz ilk geleneksel konfokal mikroskopi yaklaşımlar üzerinde LSFM birkaç önemli avantajlar vurgulamak istiyorum: Canlı görüntüleme mikroskobik deneylerden anlamlı sonuçlar elde etmek için, gözlem sadece minimal örneği etkiler önemlidir. Ancak, zebrafish dahil olmak üzere birçok organizmalar fototoksisite ef olmadan yüksek zaman çözünürlüğü ile konfokal mikroskop görüntü için onları zorlu hale lazer ışığına maruz kalınmasına çok duyarlıdırdurmuş veya gecikmiş gelişme 6,7 gibi kusurlarından. LSFM şu anda numune 7 üzerinde en yıkıcı etkilere sahip floresan görüntüleme tekniğidir. ince lazer ışığı levha, belirli bir zaman noktasında görüntülü numunenin sadece bir kısmını aydınlatan bu yana, ışık levha mikroskobu çok verimli fotonları kullanıyor. Sonuç olarak, düşük ışık pozlama sağlıklı örneklerin uzun zaman atlamalı gözlemler, örneğin 12-17 sağlar. Ayrıca, LSFM minimal invaziv sayesinde, elde edilen görüntü sayısı artık değil, işlenmiş ve saklanabilir ne kadar veri numune tahammül ne kadar ışık tarafından belirlenir. yakın fizyolojik koşullarda numune tutmanın aynı çizgide, LSFM canlı embriyoları için uygun bir alternatif örnek montaj stratejileri ile birlikte geliyor. LSFM teknikleri, embriyolar genellikle düşük yüzde agaroz ince bir sütun içinde gömülürler. mountinve aynı anda birden fazla görüşlerinden (LSFM görünümü olarak işaret edilmektedir) agaroz silindirlere g dönme özgürlüğü için sağlar, böylece örnek mükemmel bir açıdan görülmektedir. Multiview görüntüleme ve sonraki bakıslı füzyon büyük, saçılma örnekler için özellikle yararlıdır ve yüksek, izotropik çözünürlük ile yakalamak sağlar. Diğer olası LSFM montaj stratejilerinin bir özeti E. Reynaud ve laboratuvarı tarafından yazılı numune hazırlama bölümünde, resmi mikroskop kullanma kılavuzunda bulunabilir. Burada açıklanan daha gol görüntü farklı örnekler, özellikle önerilen bir okuma olduğunu. LSFM görüntü elde etme lazer tarama konfokal mikroskop karşı, geniş bir alan kamera bazlıdır. Bu daha yüksek bir sinyal-edinilen görüntüler için gürültü oranı (SNR) ile sonuçlanır ve (on saniye başına kare yüzlerce) son derece hızlı olabilir. LSFM yüksek hassasiyet daha zayıf floresan samp görüntülenmesine olanakles yakın gelecekte endojen seviyeleri 18 veya ifade transkripsiyon faktörü gibi, endojen proteinler / Cas9 CRISPR kullanılarak etiketlendi. yüksek SNR de başarılı alt görüntü analizi için önemlidir. yüksek hız yeterince hızlı birden çok kez gelen bütün embriyo sadece hızlı hücre içi süreçleri yakalamak için gerekli olan, ama aynı zamanda görüntü edilir. gözlenen fenomen ayrı görünümlerde gelen bu birkaç z yığınlarının satın alma sırasında değişmez birden çok görüş kusursuz birleşimini sadece elde edilebilir. LSFM avantajları genellikle görüntü kalitesi pahasına gelmiyor. LSFM yanal çözünürlüğü konfokal mikroskop çözünürlüğü biraz daha kötüdür. LSFM kullanılan algılama hedefleri alt sayısal açıklık standart konfokal kurulumları su veya silikon daldırma hedeflerinin 1.2-1.3 göre (genellikle 1.0 veya daha az) var olmasıdır. Buna ek olarak, bağlı LSFM geniş alan algılama (kadar AbsenBir iğne deliğinin ce), bir konfokal mikroskop göre daha out-of-odak ışık yoktur. -dışı odaklanan ışık miktarı, ışık tabaka kalınlığına göre belirlenir. Bununla birlikte, bu dezavantajları LSFM yüksek SNR tarafından telafi edilir. Uygulamada, bu örneğin disk konfokal edinimi 15 iplik ile karşılaştırıldığında benzer kaliteli görüntüler elde edilir. Sonuç olarak, bu hücre soyu 15,19 izlemek için, hücre zarlarının veya çekirdekleri, örneğin gibi özelliklerin güvenilir okunmasını sağlar. LSFM eksenel çözünürlük ışığı tabaka kalınlığı ile, bulgulama hedefi ek olarak belirlenir. Bazı durumlarda LSFM can eksenel çözünürlüklü konfokal mikroskoplar çözünürlüğünü aşacak. Işık tabaka genellikle düşük büyütme amacı ile görüntülenmiş büyük örnekler için meydana algılama hedefi, eksenel çözünürlüğü daha ince olduğunda ilk olarak, çözünürlük iyileştirme geliyor. LSFM ach nasıl ikinci yol,daha eksenel çözünürlük ieve, farklı görünümler yüksek xy çözünürlüklü bilgileri bir görüntü yığını haline kombine edildiği Multiview füzyon vardır. Elde edilen birleştirilmiş yığın yanal yönde 20,21 çözünürlük değerlerini yaklaşan bir izotropik çözünürlüğe sahiptir. Bu makalede açıklanan birbirinin üzerine birden çok kez kayıt için strateji numunesinin 20,21 civarında agaroz gömülü mutemet belirteç olarak floresan polistiren boncuklar kullanarak dayanmaktadır. LSFM ticarileştirme bir sonucu olarak, bu teknik, bilim adamları 22 geniş bir topluluğa kullanılabilir. Bu nedenle, bu protokolü yazma motivasyon LSFM pratik deneyim eksik gelişimsel biyologlar için bu teknoloji erişilebilir hale getirmek ve bu bilim adamlarının örnekleri ile bu teknolojiyi kullanmaya başladı elde etmektir. Bizim protokol kavramsal olarak basit mikroskop t oluşturan hafif ticari levha mikroskobu kullanırşapka kullanımı kolaydır. Biz ayrıca, belirli sorulara 23-25 ​​cevaplamak için uygun olabilir ev inşa LSFM kurulumları ile zebrafish görüntülenmesi için diğer son protokolleri bahsetmek istiyorum. LSFM başka giriş seçeneği daha geniş bir topluluğa ışık sac mikroskobu getirmek için açık erişim ilkeleri kullanmak açık platformlar 26,27 vardır. donanım ve yazılım yönlerini hem dokümantasyon http://openspim.org ve https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ bulunabilir. Bu protokol, biz LSFM ile gelişim süreçlerini incelemek için bir model sistem olarak teleost zebrafish kullanın. zebra balığı göz morfojenezini LSFM yararlarının çoğu altını bir örnektir. LSFM zaten Medaka 28 ve Zebra balığı 29,30 göz gelişimini araştırmak için geçmişte kullanılan olmuştur. Göz gelişiminin erken aşamada geleneksel mikroskopi için doğru embriyo yönlendirmek için karmaşık,hantal sarısı olarak embriyonun göz hedefini bakacak şekilde yan yatmak izin vermez. Bununla birlikte, LSFM bir agaroz kolonuna montaj, örnek yeniden üretilebilir konumlandırılabilir. Ayrıca, optik fincan sahneye optik vezikül geçiş sırasında, göz, büyük z yığını ve bakış büyük bir alanı yakalama gerektirir büyüme ile birlikte önemli morfogenetik düzenlenmeleri uğrar. Ayrıca bu sorunlar için LSFM geleneksel konfokal görüntüleme üstündür. optik fincan oluşumu süreci nedenle anlamak ve bir görünümden görüntüleme ile sadece görselleştirmek için zor, üç boyutludur. Bu izotropik çözünürlük ile çok bakıslı görüntüleme yararlı hale getirir. optik fincan oluşumundan sonra, retina lazer maruz giderek duyarlı hale gelir. Bu nedenle, LSFM ile bağlantılı düşük fototoksisite uzun süreli görüntüleme için önemli bir avantajdır. Burada eski Zebra balığı bir embriyolar bir ila üç gün görüntüleme için optimize edilmiş bir protokol mevcutgöz gelişimi odaklı nd larva. Bizim yöntem yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip 12-14 saat kadar kapsayan time-lapse video kaydı yapabilirsiniz. Bu teknik kaçınılmaz sık terabayt aralığında, büyük veri kümelerini oluşturur da önemlisi, biz de LSFM önemli bir adımdır veri işleme için bir boru hattı göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Mikroskobu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Sigma</td><td>A4018 veya A9414</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (MESAB / MS-222 / Trikain)</td> <td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td> N -Feniltiüre (PTU)</td> <td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm kırmızı floresan boncuklar F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 & mu; l (1&nbsp; mm iç çap, siyah işaretli) kılcal damarlar</td><td>Marka</td><td>701904</td><td>transferpetör için yedek parça olarak satılmaktadır</td></tr><tr><td>Teflon uçlu pistonlar 20&nbsp; &mu; l kılcal damarlar</td><td>Marka</td><td>701932</td><td>transferpetör için yedek parça olarak satılmaktadır</td></tr><tr><td>Dairesel cam lamel çapı 18 mm, seçilen kalınlık 0.17&nbsp; mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oda pencereleri için O-ringler 17 ve kez; 1,5 mm</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cımbız, stil 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock şırıngalar</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock şırıngalarla uyumlu infüzyon için 150 cm uzatma kablosu</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bağlantı 1 Çoklu görüntü yeniden yapılandırma uygulaması</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>Bağlantı 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer"> https://github.com/bigdataviewer</a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer</a></td></tr><tr><td>Link 4 Çoklu görünüm yeniden yapılandırma uygulama sorunları</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</a></td></tr><tr><td>Bağlantı 5 BigDataViewer sorunları</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr><td>Bağlantı 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

görüntü zebra balığı göz geliştirme işık sac floresan mikroskobu kullanarak

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), embriyonik gelişimi görüntülemek için bir yöntem olarak giderek daha fazla popülerlik kazanıyor. LSFM'nin konfokal sistemlere kıyasla başlıca avantajları, düşük fototoksisitesi, nazik montaj stratejileri, yüksek sinyal-gürültü oranı ile hızlı elde etme ve numuneleri uzun süreler boyunca çeşitli açılardan (görünümlerden) görüntüleme olasılığıdır. Birden çok görünümden görüntüleme, LSFM'nin tüm potansiyelini ortaya çıkarır, ancak aynı zamanda terabayt boyutunda veri kümeleri oluşturabilir. Bu tür veri kümelerini işlemek, LSFM kullanmanın en büyük zorluğudur. Bu protokolde, bu soruna bazı çözümler sunuyoruz. Yakın zamana kadar, LSFM çoğunlukla kendi ışık tabakası mikroskoplarını oluşturma ve çalıştırma uzmanlığına sahip laboratuvarlarda gerçekleştiriliyordu. Bununla birlikte, son üç yılda, herhangi bir gelişimsel biyolog için çok amaçlı ve kullanımı kolay olan LSFM'nin birkaç ticari uygulaması kullanıma sunuldu. Bu makale öncelikle LSFM teknoloji geliştiricisi olmayan, ancak LSFM'yi belirli gelişimsel biyoloji sorularını yanıtlamak için bir araç olarak kullanmak isteyen araştırmacılara yöneliktir. 
Burada, okuyucuyu LSFM teknolojisiyle tanıştırmak için zebra balığı gözü gelişiminin görüntülemesini örnek olarak kullanıyoruz ve LSFM'nin çoklu uzamsal ve zamansal ölçeklerdeki uygulamalarını gösteriyoruz. Bu makale, LSFM için zebra balığı embriyolarının montajı ile başlayan eksiksiz bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Daha sonra, ticari olarak temin edilebilen ışık tabakası mikroskobunu kullanarak görüntüleme seçeneklerini özetliyoruz. Daha da önemlisi, Fiji eklentisi olarak uygulanan açık kaynaklı bir çözüm kullanarak çoklu görüntüleme veri kümelerinin müteakip kaydı ve füzyonu için bir boru hattını da açıklıyoruz. Bu protokol, gelişmekte olan zebra balığı gözünü görüntülemeye ve belirli bir görüntüleme kurulumundan elde edilen verileri işlemeye odaklanırken, burada sunulan içgörülerin ve sorun giderme önerilerinin çoğu genel kullanımdır ve protokol, çeşitli ışık tabakası mikroskobu deneylerine uyarlanabilir.

LSFM ölçekler arasında gelişimsel süreçleri görüntülenmesi için ideal bir yöntemdir. Çeşitli uygulamalar, hücre içi yapılarda, hem de hücre ve tüm dokuların hem kısa hem de uzun dönem görüntü elde etmeyi gösteren Burada derlenmektedir. Bu örnekler aynı zamanda LSFM retina nöron optik fincan oluşumu göz gelişiminin çeşitli aşamalarında yararlı bir araç olduğunu göstermektedir. Film 1 ilk sağlam bir embriyonun bir uzaklaştırdınız görünümünü gösteren, genel LSFM yaklaşımının bir örneği olarak hizmet vermektedir aydınlık agaroz silindir gömme ve daha sonra floresan kanal retinanın ayrıntılı bir görünüm gösteren. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Film 1:. Zebra balığı retina LSFM LSFM yaklaşım göstermek için, bu film embriyo a içinde bozulmadan görüntülü aydınlık ilk gösteriyorfloresan geçmeden önce silindiri garose. Daha sonra görüş büyük bir alan bütün retinanın gözlem sağlayan gösterilmiştir. Sonraki film iyi hücre içi çözünürlük vurgulamak için retinanın büyütülmüş küçük bölgesini gösterir. Bir Ath5 GAP-GFP 37 transgenik zebrabalıkları embriyo görüntüleme için kullanılmıştır. Bu transgen retina (özellikle ganglion hücrelerinin ve fotoreseptör öncüleri) farklı nöronlar etiketler. Filmin floresan kısmı 5 dk aralıklarla 40X / 1.0 W objektif kullanarak çift taraflı aydınlatma ile kayıt tek bir görünümde olarak ele geçirildi. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Film 2 çok hızlı hücre içi olaylar yüksek çözünürlüklü yakalanabilir nasıl gösteriyor; Mikrotübüllerin büyümesi bu durumdaonların artı retina nöronal progenitör hücrelerin biter. Filmde yer alan bilgiler mikrotübül artı uç büyüme takibi ve ölçümü için izin verir. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Film 2:. Tek bir hücrede Mikrotubul dinamikler Bu film artı uç işaretleyici protein EB3-GFP 38 etiketli mikrotübül artı ipuçları büyüyen yakalar. proteinin tek retina projenitör hücrede ifade edilir. mikrotübül bazal apikal yönden ağırlıklı olarak büyüyen (yukarıdan aşağıya). EB3 kuyruklu ortalama hızı 0.28 ± 0.05 mm / sn olarak ölçüldü. yüksek mikrotübül çekirdeklenme etkinliği arzeden hücrenin apikal tarafında parlak nokta sentrozom olduğunu. vahşi tip embriyo hsp70 enjekte edildi: EB3-GFP plazmid DNA. Film, yaklaşık 28 hrpost fertiliz ısı şoku (37 ° C&#39;de 15 dakika) sonra, 4 saat satın alındıtirme 63X / 1.0 W objektif ve 1 sn zaman aralıkları kullanılarak tek taraflı aydınlatma ile kayıt tek bir görünümde olarak (hpf). Tek hücre retinanın çoğunluğu kapsayan bir görüş alanından kırpılmış. İki dilim projeksiyon gösterilmiştir maksimum yoğunluğu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Şekil 3, ne hücre içi yapıların uzun saatler boyunca takip edilebilir. Burada, retina ganglion hücrelerinin (RGCs) translocating içinde sentrozom yakalanır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Şekil 3:. Retina ganglion hücre translokasyonu sırasında Sentrozom yerelleştirme time-lapse deney Bu montaj retina ganglion hücre (RGC) olgunlaşma boyunca sentrozom konumunu gösterir.nöronal atalarıdır içinde sentrozom apikal süreci (1:00) en ucunda lokalize olur. hücre bölünmesi sırasında, iki sentrozomlar mitotik (2:25) için kutuplar olarak hizmet vermektedir. Bu bölünme, bir RGC ve fotoreseptör hücre öncülü olan bir ikinci kızı hücre içine ayıran bir kızı hücrede sonuçlanır. apikal süreç apikal tarafında bağlı kaldığı sürece ikiye ayrılmasından sonra, RGC hücre gövdesi, retinanın bazal tarafına translocates. RGC bazal tarafı ulaştığında, onun apikal süreç ayırır ve sentrozom o (06:15) ile hareket eder. kademeli apikal işlem (06:50, 07:20, 08:10) ile birlikte geri çekme sırasında sentrozom takip edilebilir. sentrozom hala apikal lokalize iken son karede yer (08:55) ganglion hücre, kendi bazal taraftan bir akson büyüyor. mozaik ifadesi, bir hücre aşamasında vahşi tip embriyo plazmid DNA enjeksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Hücreler Ath5 tarafından görüntülenmiştir: GFP CAAX (yeşil) constRGCs ve diğer nöronlar etiketler dürme. Sentrozomlar (ok başları) fotoseli-tdTomato 29 ifadesi (kırmızı) ile etiketli. retinanın apikal yan altındaki görüntünün üst ve bazal tarafında yer almaktadır. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. görüntüler tüm retina kapsayan bir filmden kırpılmış edildi. Film yaklaşık 34 saat sonra döllenme (hpf) başlar. Bir z yığını 40X / 1.0 W amacı ile her 5 dakikada bir satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 10 mikron temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 4&#39;te görüntülendiğinde, bu tür Movie 1 deki gibi tüm doku yakalama veri elde edilebilir nasıl tek bir hücre davranışı. Bir RGC Translokasyon kolaylıkla takip ve apikal ve bazal süreç olabilires izledi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Şekil 4:., Şekil 3&#39;te açıklandığı gibi, tek bir retinal ganglion hücre Translokasyon retina taban tarafına apikal arasında RGC translokasyon terminali mitoz sonra ortaya RGC Ath5 sentezlenmesiyle etiketlenmiştir. Boşluk GFP 37 transgen. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. görüntüler tüm retina kapsayan bir filmden kırpılmış edildi. Film yaklaşık 34 hpf başlar. Bir z yığını 40X / 1.0 W amacı ile her 5 dakikada bir satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 5 doku sc yakalamak için Multiview LSFM yeteneğini gösteriroptik vezikül bir optik fincan dönüşür sırasında optik fincan morfolojilerinden örnek hücresel çözünürlük ile bira morfogenetik süreçler. Görüntü kalitesi büyük ölçüde son görüntüyü izotropik çözünürlükte bir z yığını içine (bu durumda) 5 farklı görüşlerin dışında bilgilerden birleştirilir çok bakıslı görüntüleme, geliştirilebilir. Bu rakam Multiview Dekonvolüsyonun sonrası ağırlıklı ortalama füzyon ve görüntü aksine daha fazla kazanç ve çözünürlük sonra görüntü kalitesinde iyileşme göstermektedir. Şekil veri kümesi aracılığıyla farklı yönlerde iki optik dilimleri gösterir. Ayrıca, deconvolved veri kümesinden bir montaj zamanla optik fincan morfolojilerinden gösterir. Tüm zaman noktaları daha sonra Film 3&#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Şekil 5: tek bir görünümde ve multiv iki yöntem arasındaki görüntü kalitesi karşılaştırılmasıiew füzyon. (A) yan görünümü ve (B) dorsal görünümünden gösterilen tek görünüm verilerinin Bir adet optik dilim. Şerit eserler ve örnek içindeki derin sinyal bozulması belirgindir. Ayrıca kaynaşık verileri (CF) görünür resmin bir bölümü bu farklı görünüşünde yakalanan değildi. (C) aynı optik dilim, Multiview kaynaşmış veriler Lateral görünümde ve (D) dorsal görünümünde gösterilen şimdi. şerit eserler bastırılmış ve numune derin yapıların daha iyi çözülmesi olduğunu unutmayın. (E) aynı optik dilim şimdi Multiview Lateral görünümde ve (F) dorsal görünümünden gösterilen veriler deconvolved olarak. Bireysel hücre zarları ve çekirdekleri de ayırt edilebilir, böylece artan kontrast ve çözünürlük unutmayın. çözünürlük numune içinde özellikle derin bozulmaz. veri kümesi yaklaşık 20 derece dışında 5 görüşlerinden çift taraflı aydınlatma ile elde edildi. ab z yığınları1.5 mikron adım boyutu ile 100 mikron 20X / 1.0 W amacı ile 10 saat boyunca 10 dakika aralıklarla her bakışta elde edildi dışarı. Multiview füzyon ve Dekonvolüsyonun için giriş görüntüleri aşağı görüntü işleme hızlandırmak için 2 × örneklenmiştir. Multiview Dekonvolüsyonun 15 tekrarlamalar çalıştırmak. (G) montaj optik fincan aşamasına optik vezikül erken göz gelişimi sırasında morfogenetik olayları vurgulamak için deconvolved verilerden dorsal görünümü kırpılmış bir alanı göstermektedir. Başlangıçta içindeki kolon epitel olan optik vezikül iki kat, ayrı hücre popülasyonlarının farklılaşırlar. epidermis yakın uzak tabaka retina neuroepithelium (RN) ve nöral tüp yakın proksimal tabakası retina pigment epiteli (RP) dönüşür. RN uzatılmış ve invagine hücreler optik fincan (5:00 ile 1:40) oluşturmak için; Aynı anda RP hücreleri dümdüz. Yüzey ektoderm, WH bir lens (01:40) oluşturmak için indüklenirich invaginates sonra (05:00). Film 17 hpf başlar. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Tüm hücresel membranlar β-aktin ile etiketli: ras-GFP transgen ve tüm çekirdekler hsp70 tarafından etiketli: H2B-RFP transgen. Ölçek çubuğu 30 mikron temsil eder. FB ön beyin, LE objektif, OP koku plakod, RN retina neuroepithelium, RP retina pigment epiteli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Film 3: Optik fincan morfogenezisi tek bir görünümde ve Multiview füzyon iki yöntem ile gösterilen time-lapse film optik fincan aşamasına optik vezikül gelen optik fincan morfolojilerinden tam sürecini göstermektedir.. Lateral görünümde (üst) ve dorsal görüntüsü tek bir optik dilim (alt) tek bir optik dilim gösterir. Gelişmekte olan optik vezikül hücreleri nihayet iç retina neuroepithelium ve dış retina pigment epiteli ile yarım küre optik fincan oluşturmak için karmaşık düzenlenmeleri tabi. Bir lens yüzeyi ektoderm oluşturulmaktadır. Bu neuroepithelium birlikte invaginates ve optik fincan oturur. Tüm hücre zarının β-aktin ekspresyonu ile etiketlenmiştir: ras-GFP (yeşil), transgen ve çekirdekler HSP70 ile etiketlenmiştir: H2B RFP (kırmızı). Film yaklaşık 17 hpf başlar. Veri kümesi 20X / 1.0 W amacı ile her 10 dakikada elde edildi, yaklaşık 20 derece dışında 5 görüşlerinden çift taraflı aydınlatma ve yaklaşık 100 um yığınlarının az satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Işık tabakası floresan mikroskobu, embriyonik gelişimi görüntülemek için mükemmel bir araçtır. Yakın fizyolojik koşullarda canlı embriyoların uzun hızlandırılmış filmlerinin kaydedilmesine izin verir. Geniş uzaysal-zamansal ölçeklerde zebra balığı gözü gelişimini görüntüleme uygulamasını gösteriyoruz ve çok görüntülü veri kümelerinin füzyonu ve evrişiminin çözülmesi için bir boru hattı sunuyoruz.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Bu deneysel protokolün genel amacı, zebra balığı embriyosunun göz gelişimini ışık tabakası mikroskobunda görüntülemek ve Figi'de elde edilen çoklu görüntüleme veri setini çoklu görüntüleme rekonstrüksiyon uygulaması eklentisi aracılığıyla işlemektir. Bu yöntem, hayvan gelişimindeki morfogenetik olayları anlamanıza yardımcı olabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, gelişmekte olan embriyoda yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükle morfogenetik olayları gözlemleyebilmenizdir.Işık tabakası mikroskobunun en büyük avantajı, yöntemin düşük fototoksisitesi, numuneyi görüntüleyebileceğiniz hızlı alım zamanlaması ve numuneyi çeşitli açılardan, yani görünümlerden görüntüleyebilmenizdir. Numuneyi farklı görünümlerden yakalamak, sinyalin ve ayarlanan eksenin bozulmasının üstesinden gelmemizi sağlar. Bu farklı görüntüler daha sonra numunenin etrafındaki floresan mikro küreler kullanılarak kullanılabilir ve kaydedilebilir.İzotropik çözünürlüğe ulaşan üç boyutlu hacmi yeniden yapılandırabiliriz. Zebra balığı gözü gelişimi için ışık tabakası florensan mikroskobunun kullanımını göstermemize rağmen, bu yöntem aynı zamanda çeşitli model organizmalar kullanarak gelişim biyolojisi ve sinirbilimdeki çeşitli soruları yanıtlamak için de kullanılabilir. Başlamak için, aydınlatma hedeflerini kapalı tutarken algılama hedefini mikroskoba vidalayın.Ardından, objektiflerin kapağını açın ve numune odasını dikkatlice mikroskobun içine kaydırın. Vidayı sıkarak hazneyi sabitleyin. Ardından, sıcaklık probunu ve peltier bloğunu mikroskoba bağlayın.Peltier bloğu için soğutma sıvısını dolaştıran iki tüp, her iki konektörle de uyumludur ve her iki yönde de çalışabilir. Daha sonra, hazneyi şırıngadan hazne pencerelerinin üst kenarına kadar solüsyonla yüklemek için bir şırınga kullanın ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Şimdi mikroskobu, bilgisayarı ve inkübasyonu açın.Mikroskop çalıştırma yazılımını başlatın ve inkübasyon sıcaklığını 28,5 santigrat dereceye ayarlayın. Sıcaklık bir saat boyunca gerekli olduğunda, numuneyi hazırlayın. Agarozu hazırlamakla başlayın.% 1 düşük erime noktalı agarozun hazırlanmış bir mililitrelik alikotunu 70 santigrat derecede E üç ortamında eritin. Yaklaşık 15 dakika sonra, 600 mikrolitre erimiş agarozu 1.5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın ve 250 mikrolitre E üç orta, 50 mikrolitre% 0.4MS 222 ve 25 mikrolitre girdap floresan boncuk stok çözeltisi ekleyin. Agarozun jelleşme noktasına yaklaşmasına izin vermek için tüpü yaklaşık 39 santigrat derecede bir ısıtma bloğuna yerleştirin.Ardından, Teflon uçlu pistonları bir milimetre iç çaplı cam kılcal damarların altına kadar itin. Bunlardan beşini hazırlayın. Şimdi, agaroz karışımını kısaca girdaplayın ve ardından minimum miktarda sıvı ile beş embriyoyu içine aktarın.Ardından, bir kılcal damar yerleştirin ve önce bir embriyo başını aspire edin. Baş kuyruktan önce girmelidir ve herhangi bir hava kabarcığı olamaz. Embriyonun üzerinde yaklaşık iki santimetre agaroz ve altında bir santimetre agaroz olacak şekilde yeterli çözelti hazırlayın.Devam etmeden önce her kılcal damara bir embriyo çizin. Bu adımda ustalaşmak için biraz pratik yapmanız gerekir. Değerli olmayan embriyoları kullanarak buna hazırlanın.Agaroz tamamen katılaştığında, kılcal damarları, alt açıklığı çözelti içinde olacak şekilde hamuru ile bir beher duvarına destekleyerek numuneleri E üç ortamında saklayın. Şimdi numune tutucuyu monte edin. İlk olarak, gövdeye doğru boyutta iki plastik kılıfı birbirine karşı yerleştirin.Kollardaki yarıklar dışa bakmalıdır. Ardından, bir kelepçe vidası takın. Ve kılcal damarı, siyah renk bandı diğer tarafta görünür hale gelene kadar tutucunun içinden geçirin.Pistona dokunmaktan kaçının. Ardından kelepçe vidasını sıkın. Ardından, kılcal damardan bir santimetre agaroz itin ve kesin.Ardından gövdeyi numune tutucu diske yerleştirin. Örnek diski yüklemeden önce, s'nin kontrol yazılımında en üst konumda olduğunu kontrol edin. Ardından, tutucuyu kaydırmak ve örneklemeyi mikroskoba indirmek için kılavuz rayları kullanın.Şimdi, seçilen örneği metin protokolünde açıklandığı gibi görüntüleyin. Veri işleme Figi'de yapılır. ImageJ'nin bir dağıtımıdır.Başlamadan önce Figi güncellenmelidir. Alınan görüntü veri kümesini tek bir klasöre kaydedin. Görüntü işlemenin ara dosyaları aynı klasöre kaydedilecektir.Şimdi, çoklu görünüm rekonstrüksiyon uygulamasını başlatın. Ardından, yeni bir veri kümesi tanımlayın. Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats seçeneğini belirleyin ve çıktı veri dosyası için bir ad oluşturun.Ardından veri kümesinin ilk CZI dosyasını seçin. Meta veriler otomatik olarak yüklenecektir. Görüntü meta verilerinde, açı sayısının, kanalların, aydınlatmaların ve voksel boyutunun doğru ayarlandığını iki kez kontrol edin.Tamam'a basıldığında, bir günlük penceresi, görünüm kurulum gezgini penceresi ve bir konsol penceresi açılır. Görünüm kurulum gezgini, kullanıcı dostu bir arayüz sağlar. İşlenmesi gereken dosyaları seçin ve farenin sağ tuşuna basın.Yürütülürken farklı işlem adımlarını gösteren yeni bir pencere açılacaktır. Sağ üst köşede bilgi ve kaydet düğmeleri bulunur. Bilgi, kaydedilen veri dosyasının içeriğinin bir özetini görüntüler ve kaydet'e basmak işlem sonuçlarını kaydeder.Aksi takdirde program, işlem adımlarının sonuçlarını kaydetmez. Tüm veri kümesini yeniden kaydetmek için önce Ctrl+A tuşlarına basarak ve sağ tıklamayı kullanarak tüm dosyaları seçin. Ardından Veri Kümesini Yeniden Kaydet'i ve HDF5 Olarak seçin.Yeniden kaydetme eyleminin onayı daha sonra işaretlenmelidir. Birkaç dakika sonra, her zaman noktası için program yeniden kaydetme işleminin ne zaman tamamlandığını gösterecektir. Ardından, verilerdeki ilgi noktalarının tespitine devam edin.Ctrl+A tuşlarına basarak tüm zaman noktalarını seçin ve sağ tıklayın. Seçmek için ilgi noktalarını tespit edin. Seçeneklerden gauss farkı'nı seçin.Ve segmentasyondan önce örnek görüntüleri seçin. Bir sonraki pencerede, algılama ayarlarını seçin. Alt piksel yerelleştirme seçeneklerinden, 3 boyutlu ikinci dereceden uyum'u seçin.Ardından, ilgi noktası belirtiminde etkileşimli'yi seçin. Aşağı örnek XY seçeneği için Z çözünürlüğünü eşleştir'i seçin. Ve aşağı örnek Z için 1x'i seçin.Daha sonra compute on CPU Java seçeneğini seçerek işlemi yürütünüz. Açılır pencereden, parametreleri test etmek için bir görünüm seçin. Görünüm yüklendikten sonra klavyede Ctrl+Shift+C tuşlarına basarak parlaklığı ve kontrastı ayarlayın.Ayrıca, boncuk algılama için maksimum yeşil arama seçeneğini değiştirin. Şimdi segmentasyonu, algılamaların etrafında yeşil halkalar olarak gözlemleyin. Boncukları minimum sayıda yanlış pozitif ile en uygun şekilde segmentlere ayırmak için sigma bir ve eşik parametreleri için gaussien farkı değerlerini ayarlayın.Her boncuk yalnızca bir kez algılanmalıdır. En uygun parametreleri belirledikten sonra bitti'ye basın. Bilgisayar yüklendikten sonra, zaman noktasının her bir görünümü ve boncukları bölümlere ayırdıktan sonra, program, görüntüleme başına algıladığı boncuk sayısını içeren bir günlük dosyası çıkarır.Görüntüleme başına 600 ila birkaç bin boncuk olmalıdır. Aksi takdirde, algılama parametrelerinin ince ayar yapılması gerekir. Bu zor bir süreçtir.Algılama piramidi ilk denemede nadiren doğrudur ve sıfırlamalar bir filmin zaman noktaları arasında değişebilir. Tazeyi rahatlatmak, tüm gerçek boncukları algılayacak ve daha fazla yanlış pozitife izin verecektir. Piramidin hiçbir kombinasyonu işe yaramazsa, farklı floresan boncuklar kullanan yeni bir veri seti elde edilmelidir.Şimdi algılamaları kaydetmeye ve yığından çoklu görünüm evrişimini gidermeye devam edin. LSFM, hücreler arası yapılardan hücrelere ve tüm dokulara kadar çok ölçekteki gelişimsel süreçleri uzun süreler boyunca görüntülemek için ideal bir yöntemdir. Nöro progenitör hücrelerdeki mikrotübüllerin büyümesi gibi çok hızlı hücreler arası olaylar yüksek çözünürlükte yakalanabilir.Tek bir filmden bakıldığında, mikrotübül büyümesinin ölçülmesi mümkündür. Retinal ganglion hücreleri içindeki sentrozom gibi hücre içi yapılar saatlerce takip edilebilir. Tek hücre davranışı, retina boyunca bir ganglion hücresinin trans konumu gibi tüm doku görüntülerinden çıkarılabilir.Çoklu görünüm evrişimi, nokta yayılma işlevini kullanarak birkaç farklı görünümü birleştirerek bir izotropik Z yığını oluşturur. Bu, tek görüntülemelere veya ağırlıklı ortalama füzyonlara kıyasla çok daha iyi görüntüler sağlar. Örneğin, optik vezikülün bir optik kapa dönüşümü, gösterilen veri seti aracılığıyla farklı yönlerdeki optik dilimlerden incelenebilir.Ek olarak, embriyonun derinliklerinde bile genel olarak iyi görüntü kalitesi belirgindir. Optik kap morfogenezini görüntülerken olduğu gibi. Bu videoyu izledikten sonra, bir ışık tabakası mikroskobunda bir Zebra balığı embriyosunun nasıl monte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.Ve Figi'de çoklu görünüm veri kümelerinin nasıl işleneceği. Bir kez ustalaştıktan sonra, hafif levha mikroskobu üzerinde hızlandırılmış bir deney başlatmak yaklaşık iki saat sürecektir. Sonraki veri analizi önemli ölçüde daha fazla zaman alacaktır.Bu görev için bir bilgisayar kümesi kullanmak yararlı olabilir. Daha pratik ipuçları, sorun giderme önerileri ve diğer kaynaklara bağlantılar metin protokolünde bulunabilir. Deneyden önce yeterli depolama kapasitesi ve net bir veri işleme boru planı bulunmalıdır.Herhangi bir sorununuz, sorunuz veya gelecekteki istekleriniz varsa, lütfen ilgili github depolarındaki ilgili özellik web sitesine veya dosya sorunlarına bakın.

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu makalede, ışık tabakası floresan mikroskobu için numune hazırlama açıklanmaktadır. Ayrıca, uzun süreli görüntüleme için canlı zebra balığı embriyolarını monte etmek için bir yöntem gösterir, bu da canlı embriyoların uzun süreli filmlerinin kaydedilmesine izin verir.

Işık Levha Mikroskobu Numune Hazırlama: Uzun Süreli Görüntüleme için Canlı Zebra Balığı Embriyolarının Montajı

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Burada, zebra balığı 4-boyutlu (4 D) kalbimizde geliştirme görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM), üzerinden 4-D görüntüleme gelişmekte olan kalpleri yeniden oluşturmak için zaman içinde 3 boyutlu (3-D) görüntüleri alır. Nitelik ve nicelik endocardial çentik kardiyak trabeculation teşvik odası geliştirme sırasında sinyal kesme stres etkinleştirir gösteriyoruz.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Burada, elde edilen verileri analiz etmek için ticari olarak temin edilebilen bir ışık tabakası mikroskobu ve bir görüntü işleme iş istasyonu kullanılarak oküler morfogenezin hızlandırılmış görüntülenmesi için bir protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, embriyo anestezisi, düşük erime sıcaklığında agaroza gömülme, görüntüleme odasında süspansiyon, görüntüleme parametrelerinin ayarlanması ve son olarak görüntü analiz yazılımı kullanılarak görüntüleme verilerinin analiz edilmesi prosedürlerini...

Oküler Morfogenezi Lightsheet Microscopy ile rx3:GFP Transgenik Zebra Balığı Kullanarak Görselleştirme

Zebra balığı kalbinin in vivo ışık tabakası floresan mikroskopisi ile incelenmesi için optimize edilmiş araçlar açıklıyoruz. Özellikle, parlak kardiyak transgenik çizgiler öneriyoruz ve gelişimsel ve kalp kusurlarını önleyen yeni nazik gömme ve hareketsizleştirme teknikleri sunuyoruz. Kardiyak görüntülemeye uyarlanmış olası bir veri toplama ve analiz boru hattı da sağlanmaktadır.

Zebra Balığı Embriyolarında Hızlı Kardiyak Dinamiklerin Işık Tabakası Mikroskopisi

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Öğrenin, ışık sac floresan mikroskobu kullanarak Danio rerio embriyolarında göz gelişimini canlı görüntüleme ve çoklu görünüm veri setlerini Figi ile işleme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve nörobilim araştırmalarında morfogenetik olayları yüksek çözünürlükle gözlemlemeyi sağlar.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Daha fazla video keşfet