Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Bu deneysel protokolün genel amacı, zebra balığı embriyosunun göz gelişimini ışık tabakası mikroskobunda görüntülemek ve Figi'de elde edilen çoklu görüntüleme veri setini çoklu görüntüleme rekonstrüksiyon uygulaması eklentisi aracılığıyla işlemektir. Bu yöntem, hayvan gelişimindeki morfogenetik olayları anlamanıza yardımcı olabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, gelişmekte olan embriyoda yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükle morfogenetik olayları gözlemleyebilmenizdir.

Işık tabakası mikroskobunun en büyük avantajı, yöntemin düşük fototoksisitesi, numuneyi görüntüleyebileceğiniz hızlı alım zamanlaması ve numuneyi çeşitli açılardan, yani görünümlerden görüntüleyebilmenizdir. Numuneyi farklı görünümlerden yakalamak, sinyalin ve ayarlanan eksenin bozulmasının üstesinden gelmemizi sağlar. Bu farklı görüntüler daha sonra numunenin etrafındaki floresan mikro küreler kullanılarak kullanılabilir ve kaydedilebilir.

İzotropik çözünürlüğe ulaşan üç boyutlu hacmi yeniden yapılandırabiliriz. Zebra balığı gözü gelişimi için ışık tabakası florensan mikroskobunun kullanımını göstermemize rağmen, bu yöntem aynı zamanda çeşitli model organizmalar kullanarak gelişim biyolojisi ve sinirbilimdeki çeşitli soruları yanıtlamak için de kullanılabilir. Başlamak için, aydınlatma hedeflerini kapalı tutarken algılama hedefini mikroskoba vidalayın.

Ardından, objektiflerin kapağını açın ve numune odasını dikkatlice mikroskobun içine kaydırın. Vidayı sıkarak hazneyi sabitleyin. Ardından, sıcaklık probunu ve peltier bloğunu mikroskoba bağlayın.

Peltier bloğu için soğutma sıvısını dolaştıran iki tüp, her iki konektörle de uyumludur ve her iki yönde de çalışabilir. Daha sonra, hazneyi şırıngadan hazne pencerelerinin üst kenarına kadar solüsyonla yüklemek için bir şırınga kullanın ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Şimdi mikroskobu, bilgisayarı ve inkübasyonu açın.

Mikroskop çalıştırma yazılımını başlatın ve inkübasyon sıcaklığını 28,5 santigrat dereceye ayarlayın. Sıcaklık bir saat boyunca gerekli olduğunda, numuneyi hazırlayın. Agarozu hazırlamakla başlayın.

% 1 düşük erime noktalı agarozun hazırlanmış bir mililitrelik alikotunu 70 santigrat derecede E üç ortamında eritin. Yaklaşık 15 dakika sonra, 600 mikrolitre erimiş agarozu 1.5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın ve 250 mikrolitre E üç orta, 50 mikrolitre% 0.4MS 222 ve 25 mikrolitre girdap floresan boncuk stok çözeltisi ekleyin. Agarozun jelleşme noktasına yaklaşmasına izin vermek için tüpü yaklaşık 39 santigrat derecede bir ısıtma bloğuna yerleştirin.

Ardından, Teflon uçlu pistonları bir milimetre iç çaplı cam kılcal damarların altına kadar itin. Bunlardan beşini hazırlayın. Şimdi, agaroz karışımını kısaca girdaplayın ve ardından minimum miktarda sıvı ile beş embriyoyu içine aktarın.

Ardından, bir kılcal damar yerleştirin ve önce bir embriyo başını aspire edin. Baş kuyruktan önce girmelidir ve herhangi bir hava kabarcığı olamaz. Embriyonun üzerinde yaklaşık iki santimetre agaroz ve altında bir santimetre agaroz olacak şekilde yeterli çözelti hazırlayın.

Devam etmeden önce her kılcal damara bir embriyo çizin. Bu adımda ustalaşmak için biraz pratik yapmanız gerekir. Değerli olmayan embriyoları kullanarak buna hazırlanın.

Agaroz tamamen katılaştığında, kılcal damarları, alt açıklığı çözelti içinde olacak şekilde hamuru ile bir beher duvarına destekleyerek numuneleri E üç ortamında saklayın. Şimdi numune tutucuyu monte edin. İlk olarak, gövdeye doğru boyutta iki plastik kılıfı birbirine karşı yerleştirin.

Kollardaki yarıklar dışa bakmalıdır. Ardından, bir kelepçe vidası takın. Ve kılcal damarı, siyah renk bandı diğer tarafta görünür hale gelene kadar tutucunun içinden geçirin.

Pistona dokunmaktan kaçının. Ardından kelepçe vidasını sıkın. Ardından, kılcal damardan bir santimetre agaroz itin ve kesin.

Ardından gövdeyi numune tutucu diske yerleştirin. Örnek diski yüklemeden önce, s'nin kontrol yazılımında en üst konumda olduğunu kontrol edin. Ardından, tutucuyu kaydırmak ve örneklemeyi mikroskoba indirmek için kılavuz rayları kullanın.

Şimdi, seçilen örneği metin protokolünde açıklandığı gibi görüntüleyin. Veri işleme Figi'de yapılır. ImageJ'nin bir dağıtımıdır.

Başlamadan önce Figi güncellenmelidir. Alınan görüntü veri kümesini tek bir klasöre kaydedin. Görüntü işlemenin ara dosyaları aynı klasöre kaydedilecektir.

Şimdi, çoklu görünüm rekonstrüksiyon uygulamasını başlatın. Ardından, yeni bir veri kümesi tanımlayın. Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats seçeneğini belirleyin ve çıktı veri dosyası için bir ad oluşturun.

Ardından veri kümesinin ilk CZI dosyasını seçin. Meta veriler otomatik olarak yüklenecektir. Görüntü meta verilerinde, açı sayısının, kanalların, aydınlatmaların ve voksel boyutunun doğru ayarlandığını iki kez kontrol edin.

Tamam'a basıldığında, bir günlük penceresi, görünüm kurulum gezgini penceresi ve bir konsol penceresi açılır. Görünüm kurulum gezgini, kullanıcı dostu bir arayüz sağlar. İşlenmesi gereken dosyaları seçin ve farenin sağ tuşuna basın.

Yürütülürken farklı işlem adımlarını gösteren yeni bir pencere açılacaktır. Sağ üst köşede bilgi ve kaydet düğmeleri bulunur. Bilgi, kaydedilen veri dosyasının içeriğinin bir özetini görüntüler ve kaydet'e basmak işlem sonuçlarını kaydeder.

Aksi takdirde program, işlem adımlarının sonuçlarını kaydetmez. Tüm veri kümesini yeniden kaydetmek için önce Ctrl+A tuşlarına basarak ve sağ tıklamayı kullanarak tüm dosyaları seçin. Ardından Veri Kümesini Yeniden Kaydet'i ve HDF5 Olarak seçin.

Yeniden kaydetme eyleminin onayı daha sonra işaretlenmelidir. Birkaç dakika sonra, her zaman noktası için program yeniden kaydetme işleminin ne zaman tamamlandığını gösterecektir. Ardından, verilerdeki ilgi noktalarının tespitine devam edin.

Ctrl+A tuşlarına basarak tüm zaman noktalarını seçin ve sağ tıklayın. Seçmek için ilgi noktalarını tespit edin. Seçeneklerden gauss farkı'nı seçin.

Ve segmentasyondan önce örnek görüntüleri seçin. Bir sonraki pencerede, algılama ayarlarını seçin. Alt piksel yerelleştirme seçeneklerinden, 3 boyutlu ikinci dereceden uyum'u seçin.

Ardından, ilgi noktası belirtiminde etkileşimli'yi seçin. Aşağı örnek XY seçeneği için Z çözünürlüğünü eşleştir'i seçin. Ve aşağı örnek Z için 1x'i seçin.

Daha sonra compute on CPU Java seçeneğini seçerek işlemi yürütünüz. Açılır pencereden, parametreleri test etmek için bir görünüm seçin. Görünüm yüklendikten sonra klavyede Ctrl+Shift+C tuşlarına basarak parlaklığı ve kontrastı ayarlayın.

Ayrıca, boncuk algılama için maksimum yeşil arama seçeneğini değiştirin. Şimdi segmentasyonu, algılamaların etrafında yeşil halkalar olarak gözlemleyin. Boncukları minimum sayıda yanlış pozitif ile en uygun şekilde segmentlere ayırmak için sigma bir ve eşik parametreleri için gaussien farkı değerlerini ayarlayın.

Her boncuk yalnızca bir kez algılanmalıdır. En uygun parametreleri belirledikten sonra bitti'ye basın. Bilgisayar yüklendikten sonra, zaman noktasının her bir görünümü ve boncukları bölümlere ayırdıktan sonra, program, görüntüleme başına algıladığı boncuk sayısını içeren bir günlük dosyası çıkarır.

Görüntüleme başına 600 ila birkaç bin boncuk olmalıdır. Aksi takdirde, algılama parametrelerinin ince ayar yapılması gerekir. Bu zor bir süreçtir.

Algılama piramidi ilk denemede nadiren doğrudur ve sıfırlamalar bir filmin zaman noktaları arasında değişebilir. Tazeyi rahatlatmak, tüm gerçek boncukları algılayacak ve daha fazla yanlış pozitife izin verecektir. Piramidin hiçbir kombinasyonu işe yaramazsa, farklı floresan boncuklar kullanan yeni bir veri seti elde edilmelidir.

Şimdi algılamaları kaydetmeye ve yığından çoklu görünüm evrişimini gidermeye devam edin. LSFM, hücreler arası yapılardan hücrelere ve tüm dokulara kadar çok ölçekteki gelişimsel süreçleri uzun süreler boyunca görüntülemek için ideal bir yöntemdir. Nöro progenitör hücrelerdeki mikrotübüllerin büyümesi gibi çok hızlı hücreler arası olaylar yüksek çözünürlükte yakalanabilir.

Tek bir filmden bakıldığında, mikrotübül büyümesinin ölçülmesi mümkündür. Retinal ganglion hücreleri içindeki sentrozom gibi hücre içi yapılar saatlerce takip edilebilir. Tek hücre davranışı, retina boyunca bir ganglion hücresinin trans konumu gibi tüm doku görüntülerinden çıkarılabilir.

Çoklu görünüm evrişimi, nokta yayılma işlevini kullanarak birkaç farklı görünümü birleştirerek bir izotropik Z yığını oluşturur. Bu, tek görüntülemelere veya ağırlıklı ortalama füzyonlara kıyasla çok daha iyi görüntüler sağlar. Örneğin, optik vezikülün bir optik kapa dönüşümü, gösterilen veri seti aracılığıyla farklı yönlerdeki optik dilimlerden incelenebilir.

Ek olarak, embriyonun derinliklerinde bile genel olarak iyi görüntü kalitesi belirgindir. Optik kap morfogenezini görüntülerken olduğu gibi. Bu videoyu izledikten sonra, bir ışık tabakası mikroskobunda bir Zebra balığı embriyosunun nasıl monte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Ve Figi'de çoklu görünüm veri kümelerinin nasıl işleneceği. Bir kez ustalaştıktan sonra, hafif levha mikroskobu üzerinde hızlandırılmış bir deney başlatmak yaklaşık iki saat sürecektir. Sonraki veri analizi önemli ölçüde daha fazla zaman alacaktır.

Bu görev için bir bilgisayar kümesi kullanmak yararlı olabilir. Daha pratik ipuçları, sorun giderme önerileri ve diğer kaynaklara bağlantılar metin protokolünde bulunabilir. Deneyden önce yeterli depolama kapasitesi ve net bir veri işleme boru planı bulunmalıdır.

Herhangi bir sorununuz, sorunuz veya gelecekteki istekleriniz varsa, lütfen ilgili github depolarındaki ilgili özellik web sitesine veya dosya sorunlarına bakın.