Name: Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de siklohekzimid kovalama yöntemiyle protein bozulmasını görselleştirmeyi. Bu teknik, radyoaktif izotop gerektirmeden protein stabilitesini analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, destekleyici ve hevesli bir araştırma ortamı sağladıkları için Rubenstein laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine teşekkür eder. Yazarlar, reaktifleri ve uzmanlıklarını paylaştığı için Mark Hochstrasser'e (Yale Üniversitesi) teşekkür eder. E.M.R., Stefan Kreft (Konstanz Üniversitesi) ve Jennifer Bruns'a (Pittsburgh Üniversitesi) proteinlerin kinetik analizindeki paha biçilmez uzmanlıklarını paylaştıkları için teşekkür eder. Bu çalışma, EMR'ye Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi (R15 GM111713), EMR'ye Ball State Üniversitesi ASPiRE araştırma ödülü, Ball State Üniversitesi'nden Sigma Xi'ye bir araştırma ödülü ve Ball State Üniversitesi Provost Ofisi ve Biyoloji Bölümü'nden fonlar ile desteklenmiştir.

Maya hücrelerinin 1. Büyüme ve Hasat <ol><li> Bir endojen maya protein degradasyon kinetiği analiz değilse, ilgili proteini kodlayan bir plazmid ile arzu edilen maya suşu (ler) dönüşümü. Maya transformasyonu için güvenilir yöntemler, daha önce 37 tarif edilmiştir. </li><li> Uygun bir ortamda 5 ml maya inoküle (örneğin, dönüştürülmüş hücreler ya da dönüştürülmemiş hücreler için seçici olmayan bir maya ekstresi-pepton dekstroz (YPD) orta plasmid bakımı için Seçici Sentetik tanımlanan (SD) ortamı). döner, 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Not: 30 ° C, tipik vahşi tip laboratuar maya kökleri 38 için en uygun bir büyüme sıcaklığıdır. Mutant maya cinsleri, 30 ° C &#39;de en iyi şekilde büyümez ve bazı proteinler sıcaklığa bağlı bozunmaya maruz Ancak, maya hücresi büyümesi ve sikloheksimid Chase için kullanılan sıcaklıklar deneysel 39 tespit edilmelidir. </li><li> th ölçünHer gecede kültür, 600 nm (OD 600) e optik yoğunluk. Not: Hücreler logaritmik ya da sabit büyüme fazında olabilir, fakat minimal = OD 600 seyreltme izin 0.2 ml taze ortam 15 bir yoğunluğa ulaştığı olmalıdır. </li><li> Taze ortam 0.2 15 ml&#39;lik bir OD 600 değerine gece boyunca kültürler ile seyreltilir. </li><li> Hücreler, orta-logaritmik büyüme fazı ulaşana kadar çalkalanarak 30 ° C&#39;de inkübe edin maya (örneğin, OD 0.8 ve 1.2 arasında, 600). </li><li> maya hücre büyümesi sırasında, sikloheksimid kovalamaca prosedürü için hazırlık aşağıdakileri gerçekleştirin: <ol><li> sikloheksimid mevcudiyetinde hücre inkübasyon için 30 ° C, 15 ml konik tüpü bir ısıtma bloğu ayarlayın. kültürlere verimli ısı dağılımını sağlamak için ısı bloğu çukurlarına su eklenir. 15 ml konik tüp, su seviyesi taşma yükselecek, ancak iyi bir dudak neden olacağını her kuyu gibi su ekleyin. </li><li> hücre lisizini takiben protein denatürasyonu 95 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ikinci bir ısıtma bloğu ayarlayın. </li><li> Ön sıcak taze büyüme ortamı, 30 ° C (analiz edilecek kültür başına zaman noktası başına 1.1 mi). </li><li> 50 ul 20x Durdurma Mix ekle (kültür başına bir tüp zaman başına nokta denenecek) mikrosantrifüj tüpleri önceden etiketlenmiş. buz üzerinde tüpler yerleştirin. DİKKAT: sodyum azid, 20x Durdurma Karışım bir madde, oral yoldan ya da deri teması ile toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve sodyum azit tutarken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın. </li></ol></li><li> Hücreler, orta-logaritmik büyüme ulaştığı zaman, her zaman noktasında her kültür 2.5 OD 600 birim toplamak (örneğin, 7,5 OD 600 tane üç zaman noktasında protein bolluğu analiz etmek için) tahlil edilecek. Santrifüj Eğer 3,0, 15 ml konik tüplerde hücreler toplanmış2 dakika boyunca oda sıcaklığında 00 xg. NOT: Bir OD 600 ünite OD 1.0 600, 1 ml kültüre mevcut maya miktarına eşittir. V = x OD 600 birim / OD 600 ölçüm süresi: X, OD 600 birim (V) hasat için gereken kültür (ml) hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir. Örneğin, bir OD 1.0 600 maya hücresi kültürü 7.5 OD 600 birim hasat 7.5 OD 600 birim / 1.0 = 7.5 ml maya kültürü toplamak. </li><li> 30 ° C (7.5 OD 600 birim örneğin, 3 ml), hücrelerin 2.5 OD 600 birimi başına (önceden ısıtılmış), taze büyüme ortamı, 1 ml her bir hücre pelletini. </li></ol> 2. Siklohekzimid Chase <ol><li> 30 ° C ısı bloğu 5 dakika boyunca kuluçkalama ile maya hücre süspansiyonları dengelenmesi. </li><li> 0:00 kadar saymak için bir zamanlayıcı hazırlayın. </li><li> zamanlayıcı sikloheksimid kovalamaca, basın &quot;Başlat&quot; başlayacak. hızla,ama dikkatle, aşağıdaki adımları gerçekleştirin: <ol><li> İlk maya hücre süspansiyonuna, 250 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar sikloheksimid ekleme (örneğin, hücre süspansiyonu, 3 ml, 20 mg / ml siklohegzimid stokunun 37.5 ul), ve vorteks kısa bir süre karıştırmak. DİKKAT: Siklohekzimid dermal tahriş ve ağız yoluyla ilaç yoluyla toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve Siklohekzimidsiz işlerken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın. </li><li> Hemen sikloheksimid ve vorteks ilave edildikten sonra, 50 ul buz soğukluğunda 20x durdurma karışımı ihtiva eden bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sikloheksimid maya hücre süspansiyonu 950 ul (~ 2.4 OD 600 birim) aktarın. Tüm örnekler toplanmıştır kadar buz üzerinde ependorf tüp, ve yer Vortex. </li><li> 30 ° C&#39;ye kadar maya hücre süspansiyonu geri dönün. </li></ol></li><li> Adımları tekrarlayın 2.3 ile 2.3.1.3 Düzenli zaman aralıklarında (kalan maya hücresi süspansiyonları her biri için, örneğin, sikloheksimid ilave edilir, öyle ki, her 30 saniye, 1:00 de, 0:30 de, 0:00 de örnek # 3 Örnek 2. 1. Numune vb.). </li><li> sonraki her zaman noktasında 50 ul önceden soğutulmuş 20x Durdurma Mix ihtiva eden etiketli mikrosantrifüj tüplerine vorteks maya hücresi süspansiyonları ve transfer 950 ul. Vortex ve buz üzerinde yer hücreler toplandı. 30 ° C ısı bloğu 15 ml konik tüpler dönün. <ol><li> Örneğin, 30 dakika sikloheksimid ilave edildikten sonra hücrelerin toplanması için, girdap (zamanla başlangıcında, maya hücre süspansiyonlarına sikloheksimid ilave arasında 30 saniyelik aralıklarla varsayarak) ve 30:00 de örnek # 1 hücre süspansiyonu 950 ul çıkarın . böylece 30:30 de örnek # 2 için tekrarlayın ve. Not: Chase süresince konik tüp yaklaşık 5 dakika 15 ml maya, girdap hücre süspansiyonları oturmasını önlemek için. Alternatif olarak, maya hücre süspansiyonus sikloheksimid takip deney süresince sürekli olarak ajite su banyosu içinde muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Tüm numuneler toplanmıştır sonra, pelet 30 saniye boyunca oda sıcaklığında 6500 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplandı. pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. Hücreler artık alkali lizis için hazır. Seçenek olarak ise, ek bileşen dondurularak sıvı azot ve mağaza pelet hücreleri -80 ° C&#39;de ilave edildi. </li></ol> 3. Post-alkali Protein Ekstraksiyonu (16,40 den Modifiye) <ol><li> Her hücre pelletine damıtılmış suyun 100 ul ekle. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks tarafından süspanse edin. </li><li> Her bir örnek için 0.2 M NaOH, 100 ul ekle. yukarı pipetleme ve aşağı ya da vorteks karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında süspansiye edilmiş hücreler inkübe edin. Bu aşamada, maya hücreleri lize edilmemiştir ve proteinler 40 serbest edilmemiştir. </li><li> Oda öfke 18.000 xg santrifüj Pelet hücreleri30 sn için çalıçtırdıgınızda. pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> , Hücreler lize edildi Her hücre pelletine Laemmli numune tampon 100 ul ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks tarafından süspanse edin. Not: Tris-glisin çalışan tamponu sistemi kullanılarak sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir biçimde NaOH ve Laemmli numune tamponu bültenleri proteinleri ile hücrelerin ardışık inkübasyon. </li><li> 5 dakika tam proteinleri denatüre etmek için 95 ° C&#39;de inkübe edin. Not: 95 ° C&#39;de inkübasyon toplama eğilimli proteinlerin analizi için uygun değildir (örneğin, çeşitli transmembran segmentlerle proteinleri). Yüksek sıcaklıklarda 41 ° C&#39;de inkübe bu proteinler çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, bu tür proteinlerin analizinde, lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 dakika, hem deneysel olarak belirlenebilir. </li><li> ro 18.000 xg&#39;de santrifüj lizatları1 dakika için OM sıcaklığı çözünmeyen malzeme peletlendi. Süpernatan (çözünebilir ekstre protein), SDS-PAGE ve ardından Western blot analizi ile ayrılması için hazır hale gelir. Alternatif olarak, -20 ° C&#39;de mağaza lizatları. </li></ol> 4. Temsilcisi SDS-PAGE ve Western Blot Prosedürü (16 uyarlanmıştır) <ol><li> Yük proteini moleküler ağırlık standartları ve bir SDS-PAGE jeli üzerine lizatları ampirik bir biçimde tespit hacmi. Not: ilgilenilen proteinin moleküler ağırlığı bazında SDS-PAGE jeli akrilamid ve bis-akrilamid yüzdesini seçin. Genel olarak, düşük bir yüzde jeller yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin çözülmesi için daha uygundur. </li><li> boya ön kadar 200 V çalıştırmak jel jel alt kenarı ulaşmıştır. </li><li> 4 ° C&#39;de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florit (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın. </li><li> (TBC Tris tamponlu tuz içinde kuluçkalanmasıyla zar blokeS),% 5 kaymağı alınmış süt içeren, 1 saat boyunca veya bütün gece 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında, sallanan. Not: gece boyunca inkübe bir membran mevcudiyetinde mikrobiyal büyümeyi önlemek için,% 0.02 nihai bir konsantrasyonda bloke çözeltisi içinde sodyum azit dahil edilmesi önerilmektedir. </li><li> 1 saat süre ile, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ve% 1 yağsız süt, sallanan TBS daki protein için spesifik primer antikor ile membran inkübe edin. </li><li> sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın. </li><li> Sallanan 1 saat boyunca oda sıcaklığında% 1 yağsız süt ile TBS / T uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. NOT: Flüoroforlar ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, florofor konjüge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmıştır ve membranların ışık geçirmeyen (ör, metal yaprak sarılı) co gerçekleşmelidir fluorophores ve daha sonra yıkama aşamasına konjuge antikor varlığında olmalıdırntainers. </li><li> sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın. </li><li> LI-COR Odyssey CLX ve üretici tavsiyelerine aşağıdaki Image Studio yazılımı (ya da benzer görüntüleme cihazları ve yazılım), kullanarak görüntü membran. </li><li> Membran görüntü aldıktan sonra, sallama, 1 saat süre ile, oda sıcaklığında,% 1 yağsız süt ile TBS / T içinde bir yükleme kontrol proteini için spesifik bir primer antikor ile membran inkübe edin. </li><li> sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın. </li><li> Sallanan 1 saat boyunca oda sıcaklığında% 1 yağsız süt ile TBS / T uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. </li><li> sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın. </li><li> Adım 4.9 gibi görüntü membran. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yazıda, protein yıkımı kinetik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik hali hazırda çeşitli mekanizmalar ile bozulmuş proteinler, bir dizi uygulanabilir. Sikloheksimid kovalamaca deneyleri belirli bir proteinin kararlı durum havuzunun bozulma kinetiği rapor dikkat etmek önemlidir. Diğer teknikler proteinlerinin spesifik popülasyonlarının degradasyon kinetiğinin analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, doğmakta olan polipeptidlerin parçalayıcı kaderi darbe kovalamaca analizi 55 tarafından iz...

Proteinler hemen her hücresel süreçte önemli işlevleri yerine getirir. Pek çok fizyolojik işlem zaman ya da belirli koşullar altında, belirli bir süre için belirli bir protein (ya da proteinlerin) varlığını gerektirir. Organizmalar nedenle izlemek ve hücresel ihtiyaçlarını karşılamak 1 protein bolluğu düzenler. Örneğin, siklinler (hücre bölünmesini kontrol eden proteinler), hücre döngüsünün belirli aşamalarında mevcut olduğu ve düzenlenmiş siklin seviyelerinin kaybı habis tümör oluşumu 2 ile ilişkili olmuştur. Hücresel ihtiyaçlarını karşılamak için, protein düzeylerinin düzenlemenin yanı sıra hücreler, yanlış katlanmış, birleştirilmemiş ya da başka anormal bir protein moleküllerini 3 ortadan kaldırmak için bozundurucu bir kalite kontrol mekanizmaları kullanır. protein oranından kontrol makromoleküler sentezinin (kopya ve çeviri) ve bozulmaya (RNA çürüğü ve proteoliz) hem düzenlenmesini içerir. Bozulmuş veya aşırı protein yıkımı birden patolojilerin katkıdaKanser, sistik fibroz, nörodejeneratif koşullar, ve kalp-damar bozuklukları 4-8 dahildir. Proteolitik mekanizmaları nedenle hastalıkların 9-12 aralığı için gelecek vaat eden terapötik hedeflerini temsil eder. Tek bir zaman noktasında proteinlerin analizi sentezi veya bozulma göreli katkılarını vermeden kararlı durum proteini bolluğu anlık görüntüsünü sağlar (örneğin, western blot 13 ​​tarafından, sitometri 14 veya floresan mikroskobu 15 akış). Benzer bir şekilde, büyüme göre raportör testleri sentez ve degradasyon 15-20 etkilerini ayırt olmadan uzun bir süre boyunca sabit durum protein seviyesini göstermektedir. Daha önce bolluk karşılaştırarak ve farmakolojik prote inaktive ederek, örneğin parçalayıcı mekanizmasının (belirli bileşenlerini inhibe sonra kararlı durum protein düzeyleri parçalayıcı süreçlerin katkısını anlaması mümkünasome 21 veya varsayılmış bir gen nakavt bozulması 13) için gerekli olduğu. Parçalayıcı yolları inhibe sonra kararlı durum protein düzeylerinde bir değişiklik protein bolluğu 13 kontrolüne proteoliz katkısı için güçlü kanıtlar sağlar. Ancak, bu tür bir analiz de protein döngüsü kinetiği ilişkin bilgi sağlamaz. Batı blot takip Siklohekzimid kovalamaca araştırmacılar zaman 22-24 üzerinde protein parçalanmasını görselleştirmek için izin vererek bu zayıflıkları üstesinden gelir. Sikloheksimid Chase, aşağıdaki protein saptama, batı lekeleme, radyoaktif izotoplar ve uzun immünopresipitasyon aşamalarla gerçekleştirilir, çünkü daha fazla, aynı zamanda protein degradasyonunu 25 görselleştirmek için gerçekleştirilen çok sayıda yaygın olarak kullanılan darbe takip teknikleri, farklı olarak, sikloheksimid Chase gerekli değildir. Sikloheksimit birinci anti-mantar, uygun olan bir bileşik olarak tanımlanmıştır26,27 griseus gram-pozitif bakteri Streptomyces tarafından üretilen kravatlar. Özellikle ribozomal translokasyonu 28-31 bozarak ökaryot sitozolik (ama organel değil) çeviri inhibe eden hücre geçirgen bir moleküldür. Bir sikloheksimid Chase deneyde, sikloheksimid hücrelere ilave edilir ve hücre numuneleri, hemen ve bileşik 22 ilave edildikten sonra belirli zaman noktalarında alınır. Hücreler lizlenir ve her zaman noktasında bir protein bolluğu tipik western blot ile analiz edilmiştir. güvenle protein yıkımı atfedilebilir siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki proteini bolluğu azaltır. nispeten istikrarlı bir protein bolca az değişiklik gösterecektir sırasında bir kararsız protein, zamanla bolca azalacaktır. seçici protein yıkımı mekanizmaları son derece ökaryotlarının boyunca muhafaza edilmiştir. protein yıkımı hakkında bilinen çok ne ilk öğrenildiModel tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) 25,32-36. maya ile yapılan çalışmalar protein yıkımı içine yeni ve önemli bilgiler sunmaya devam etmek olasıdır. protein oranından Western blot analizi ile, ardından maya hücrelerinde sikloheksimid Chase bir yöntem sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>İstenilen maya suşları, plazmitler, standart ortam ve tampon bileşenleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık borosilikat cam tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>Sıcaklık ayarlı inkübatör (örn. Heratherm İnkübatör Modeli IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>18 mm tüpler için New Brunswick Değiştirilebilir Tambur (tüp silindiri)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Süspansiyon halinde maya hücrelerinin gece boyunca&nbsp; starter kültürlerini korumak için bir tüp silindiri önerilir. Alternatif olarak, bir tüp silindiri mevcut değilse, gece boyunca başlatıcı kültürler için sıcaklık kontrollü bir inkübatörde bir platform çalkalayıcı kullanılabilir. Daha büyük kültürleri süspansiyonda tutmak için bir platform çalkalayıcı veya tüp silindiri kullanılabilir.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Makaralı Tambur 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Tüp makaralı</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometre</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td> ile kullanım için <td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>Santrifüj 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&nbsp;</td><td>Ünite ile birlikte satılan rotor 1.5 ve 2.0 ml mikrosantrifüj tüpleri bulundurur. Rotor, 15 ve 50 ml konik tüpler içeren bir rotorla değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Sabit Açılı Rotor F-35-6-30, Santrifüj Modeli 5430/R için Kapaklı ve Adaptörler, 15/50 ml Konik Tüpler, 6'lı</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml serigrafi baskılı vidalı kapaklı tüp 17 x 20 mm konik, polipropilen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>1.5 ml esnek tüp, PCR temiz, doğal mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Isıtıcıları</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>İki ısıtıcının mevcut olması önerilir (biri sikloheksimid tedavisi sırasında hücreleri inkübe etmek için ve diğeri proteinleri denatüre etmek için lizatları kaynatmak için). Alternatif olarak, 30 & derece; C su banyosu, sikloheksimid varlığında hücrelerin inkübasyonu için kullanılabilir. Sıcak plakalı kaynar su banyosu, proteinleri denatüre etmek için alternatif olarak kullanılabilir.</td></tr><tr><td>12 x 15 ml konik tüpler için ısıtma bloğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>Sikloheksimid varlığında hücrelerin inkübasyonu sırasında Dri-Bath Isıtıcı ile kullanım için.</td></tr><tr><td>20 x 1,5 ml konik tüpler için ısıtma bloğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>Protein denatürasyonu için lizatları kaynatmak için Dri-Bath Isıtıcı ile kullanım içindir.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE çalıştırma ve transfer cihazları, güç kaynakları ve görüntüleme ekipmanı veya SDS-PAGE ve membrana</td><td></td><td></td> aktarım için karanlık odalar <td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir</td></tr><tr><td>Western blot görüntüleme sistemi (örn. Li-Cor Odyssey CLx tarayıcı ve Image Studio Yazılımı)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir</td></tr><tr><td>EMD Kırlangıç İmmobilon PVDF Transfer Membranları</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir</td></tr><tr><td>Birincil antikorlar (örn. Fosfogliserat Kinaz (Pgk1) Monoklonal antikor, fare (klon 22C5D8))</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>459250</td><td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir</td></tr><tr><td>İkincil antikorlar (örn. Alexa-Fluor 680 Tavşan Anti-Fare IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişiklik gösterir</td></tr></tbody></table>

protein bozulması ve siklohekzimid chase analizi<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein bolluğu Yönetmelik hemen hemen her hücresel süreç için çok önemlidir. Protein bolluk protein sentezi ve protein yıkımı oranları entegrasyonunu yansıtmaktadır. Protein bolluk raporlama birçok tahliller, protein düzeyleri çeviri ve proteoliz göreli etkilerinin ayrımcılığa izin vermez (örneğin, tek zamanlı noktası batı lekeleme, sitometri floresan mikroskobu veya büyüme-temelli muhabir deneyleri akış). Bu makalede, özellikle model, tek hücreli ökaryot protein parçalanmasını analiz etmek batı blot takip sikloheksimid kovalamacanın kullanımını, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) açıklar. Bu prosedürde, maya hücreleri translasyonel önleyicisi sikloheksimid mevcudiyetinde inkübe edilir. Hücrelerin alikotlan sonra siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki özel zaman noktalarında hemen toplanır. Hücreler lizlenir ve lisatlar fo poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılırHer bir zaman noktasında, protein bolluğu Western blot analizini r. sikloheksimid Chase prosedürü hücresel proteinlerin çeşitli sabit durum nüfusun degradasyon kinetiğinin görselleştirme izin verir. Prosedür protein yıkımı üzerinde genetik gereksinimleri ve çevresel etkileri araştırmak için kullanılabilir.

Sikloheksimid Chase yöntemi göstermek için, Deg1 -Sec62 stabilitesi (Şekil 1) bir model maya endoplazmik retikulum (ER) -associated bozulması (ERAD) alt-tabaka, 42-44 analiz edilmiştir. ERAD, kalite kontrol ubikuitin ligaz enzimleri kovalent ER zarında lokalize anormal proteinlerin küçük bir protein ubikitinin zincirlerini takın. Böyle polyubiquitylated proteinler daha sonra ER kaldırılır ve proteazom, büyük, sitozolik proteaz 45 tarafından...

Protein bolluğu hem protein sentezi hem de protein yıkım oranlarını yansıtır. Bu makale, tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) modelinde protein bozulmasını analiz etmek için sikloheksimid kovalamacasının ve ardından western blotlamanın kullanımını açıklamaktadır.

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Bu prosedürün genel amacı, Saccharomyces cerevisiae'de belirli bir proteinin kararlı durum popülasyonunun yıkımını görselleştirmektir. Bu yöntem, ilgilenilen bir proteinin yıkımı için gereken genetik gereksinimleri ve çevresel etkileri belirlemek amacıyla kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protein yıkımını görselleştirmek için kullanılan pulse-chase tekniklerinin aksine, radyoaktif izotoplar ve uzun immünopresipitasyon basamaklarının gerekmemesidir.Bu prosedür, gerek endojen bir maya proteini gerekse bir plazmidden eksprese edilen bir proteinin analiz edilmesi için kullanılabilir. İkinci durum için, standart bir maya transformasyon protokolü takip edilerek, maya suşu ilgili proteini kodlayan bir plazmid ile transforme edilir. Mayayı beş mililitre uygun besiyerine ekleyin.30 °C'de, rotasyonla gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, her bir gece boyu kültürü için 600 nanometredeki optik yoğunluğu (OD600) ölçün. Kültürleri, 15 mL taze besiyerinde 0,2 OD600 değerine seyrelteyin.Hücreler orta-logaritmik büyüme evresine ulaşana kadar 30 °C'de çalkalamalı olarak inkübe edin. Maya hücreleri büyürken, sikloheksimid takip (chase) prosedürü için hazırlık yapın. Hücrelerin sikloheksimid varlığında inkübasyonu için 15 ml konik tüpleri alabilen bir ısıtıcı bloğu 30 °C'ye ayarlayın.Kültürlere etkili ısı dağılımı sağlamak için, ısıtma bloğunun her bir kuyucuğuna, 15 mL'lik konik bir tüp yerleştirildiğinde su seviyesinin kuyucuğun kenarına kadar yükselmesini ancak taşmamasını sağlayacak şekilde su ekleyin. Hücre lizini sonrası protein denatürasyonu için, 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini alabilecek ikinci bir ısıtma bloğunu 95 °C'ye ayarlayın. Taze büyüme ortamını 30 °C'ye kadar önceden ısıtın.Analiz edilecek her kültür için her zaman noktası başına 1,1 mililitre besiyeri gereklidir. Önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine 50 mikrolitre 20x Stop Mix ekleyin. Analiz edilecek her kültür için her zaman noktası başına bir tüp hazırlayın.Tüpleri buz üzerine yerleştirin. Maya hücreleri orta-logaritmik büyüme evresine ulaştığında, analiz edilecek her zaman noktası için her kültürden 2,5 OD600 birim toplayın. Bir OD600 birimi, OD600 değeri 1,0 olan bir mililitre kültürde bulunan maya miktarına eşittir.Toplanan hücreleri 15 mililitrelik konik tüplerde, oda sıcaklığında, 3.000 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın. Her bir hücre peletini, hücrelerin her 2,5 OD600 birimi için bir mililitre 30 °C taze büyüme ortamı kullanarak yeniden süspanse edin.Sikloheksimid takibine başlamadan önce, maya hücresi süspansiyonlarını 30 °C'lik ısıtıcı blokta beş dakika inkube ederek dengeleyin. Bu prosedürün en zor yönü, sikloheksimid ekleme ve her örnek için hücre toplama zamanlamasıdır. Sikloheksimid ekleme ve hücre toplama için bir zaman çizelgesi oluşturup buna bağlı kalarak başarıyı sağlıyoruz.Sikloheksimid takibini başlatmak için zamanlayıcıdaki "Start" düğmesine basın. İlk maya hücresi süspansiyonuna hızlı ancak dikkatli bir şekilde 250 µg/mL nihai konsantrasyon olacak şekilde sikloheksimid ekleyin ve karıştırmak için kısa süreliğine vorteksleyin. Sikloheksimid eklenmiş maya hücresi süspansiyonunun 950 µL'sini veya yaklaşık 2,4 OD600 birimini, 50 µL buz gibi soğuk 20x Stop Mix içeren önceden etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpüne hemen aktarın.Tüm örnekler toplanana kadar mikro santrifüj tüpünü vorteksleyin ve buz üzerine yerleştirin. Geriye kalan her bir maya hücresi süspansiyonu için düzenli zaman aralıklarıyla, gösterildiği şekilde sikloheksimid kovalamasını başlatın. Sonraki her zaman noktasında, maya hücresi süspansiyonlarını vorteksleyin ve 50 µL ön soğutmalı 20x Stop Mix içeren etiketli mikro santrifüj tüplerine 950 µL aktarın.Vorteksleyip toplanan hücreleri buz üzerine yerleştirin. Maya hücrelerinin çökmesini önlemek için, takip süreci boyunca 15 mililitrelik konik tüplerdeki hücre süspansiyonlarını yaklaşık her beş dakikada bir vorteksleyin. Tüm örnekler toplandığında, toplanan hücreleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 6.500 x g santrifüj hızıyla çöktürün.Süpernatanı pipetleme veya aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Hücreler artık alkali lizis için hazırdır. Her bir hücre peletine 100 µL distile su ekleyerek hücreleri alkali lizise hazırlayın ve pipetle aşağı yukarı çekerek yeniden süspande edin.Her bir örneğe 100 µL 0,2 M sodyum hidroksit ekleyin. Vorteksleyerek karıştırın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Bu aşamada, maya hücreleri henüz lizize edilmemiş ve proteinler serbest kalmamıştır. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 18, 000 ×g santrifügasyon ile çöktürün. Süpernatantı pipetleme veya aspirasyon yoluyla uzaklaştırın.Hücreleri liz etmek için her bir hücre peletine 100 µL Laemmli Örnek Tamponu ekleyin. Pipetle aşağı yukarı çekerek yeniden süspanse edin. Proteinleri tamamen denatüre etmek için 95 °C'de beş dakika inkübe edin.Çözünmeyen materyali çöktürmek için lizatları 18,000 ×g'de ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Çözünmüş ekstrakte protein olan süpernatant, SDS PAGE ile ayırmaya ve ardından Western blot analizine hazırdır. Alternatif olarak, lizatlar -20 °C'de saklanabilir.Model bir maya endoplazmik retikulumla ilişkili yıkım substratı olan Deg1-Sec62'nin stabilitesi, sikloheksimid takip yöntemi ile analiz edildi. Deg1-Sec62 proteini, SDS PAGE üzerinde birden fazla tür olarak göç eder ve yabani tip hücrelerde kolayca yıkıma uğrar. Pgk1, bolluğu test edilen koşullarda değişmeyen bir yükleme kontrolüdür.ER yerleşik ubiquitin ligaz hrd1 veya ubiquitin-konjugasyon enzimi ubc7'den herhangi birinin kaybı, Deg1-Sec62 proteinini önemli ölçüde stabilize etti; bu durum, söz konusu proteinlerin Deg1-Sec62 degradasyonundaki daha önce gözlemlenen rolünü doğrulamaktadır. Cue1, ubc7'yi ER membranına sabitleyen ve enzimi aktive eden bir transmembran proteindir, ancak Deg1-Sec62 degradasyonunda cue1 gereksinimi doğrudan araştırılmamıştır. Bu çalışmadan elde edilen, cue1 yokluğunda Deg1-Sec62'nin stabilize olduğu gözlemi, cue1'in Deg1-Sec62'nin ER ile ilişkili degradasyonundaki rolünü doğrulamıştır.Western blot sonucu görüntüleme yazılımı kullanılarak nicelleştirildi. Örnekler arasındaki Deg1-Sec62 protein bolluğunu karşılaştırmak için, her bir örnek için Deg1-Sec62'nin Pgk1'e göre düzeltilmiş sinyal yoğunlukları oranı belirlendi. Bu prosedürün, en doğrudan şekilde, ilgilenilen bir proteinin kararlı durumdaki popülasyonunun degradasyon kinetiği hakkında bilgi verdiğini unutmamak önemlidir.İlgilenilen bir proteinin yeni sentezlenen popülasyonunun degradasyonunu görselleştirmek için, pulse-chase deneyleri gibi diğer teknikler kullanılabilir. Sikloheksimid ve sodyum azidin son derece toksik olduğunu ve bu prosedürü gerçekleştirirken bu kimyasallarla doğrudan temastan kaçınmak için önlem alınması gerektiğini unutmayın.

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, deterjan fraksiyonlaması ile birlikte sikloheksimid muamelesi kullanılarak yanlış katlanmış proteinler için bir bozunma testi açıklanmaktadır. Bu yöntem, yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemeye ve protein döngüsünün derinlemesine mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, transfekte edilmiş memeli hücrelerinin çekirdeğinde eksprese edilen floresan etiketli yanlış katlanmış lusiferaz mutant proteinin bozunma kinetiğini incelemek için in vitro floresan bazlı bir mikroplaka testi açıklanmaktadır. Test, yanlış katlanmış proteinin proteazom aracılı bozunmasını değerlendirmek için floresan mutant proteini eksprese eden hücrelerin bir translasyon inhibitörü ve bir proteazom inhibitörü ile işlenmesini içerir.

Floresan Mikroplaka Bazlı Sikloheksimid Takip Testi: Floresan Nükleer Yanlış Katlanmış Proteinlerin Bozunma Kinetiğini İzlemek İçin Bir Teknik

Burada, ubikitin-proteazom sistemi tarafından nispi proteoliz oranını ölçmek için sağlam bir biyolojik testi açıklıyoruz. Tahlil okuması, temel bir metabolik belirteçle kaynaşmış bir bozunma sinyali içeren bir raportör proteinin hücresel seviyelerine bağlı olan sıvı kültürdeki maya büyüme hızıdır.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada, biz etkin bir protokol sunmak ve özellikle β-EST yardım sistemi kullanarak Maya Saccharomyces cerevisiae ilgi bir protein tüketmek.

Belirli ve verimli protein tükenmesi elde etmek için bozulma ayarlama

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de siklohekzimid kovalama yöntemiyle protein bozulmasını görselleştirmeyi. Bu teknik, radyoaktif izotop gerektirmeden protein stabilitesini analiz etmenizi sağlar.

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi

Daha fazla video keşfet