Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi
18 Nisan 2016
Protein bolluğu hem protein sentezi hem de protein yıkım oranlarını yansıtır. Bu makale, tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) modelinde protein bozulmasını analiz etmek için sikloheksimid kovalamacasının ve ardından western blotlamanın kullanımını açıklamaktadır.
Bu prosedürün genel amacı, Saccharomyces cerevisiae'de belirli bir proteinin kararlı durum popülasyonunun yıkımını görselleştirmektir. Bu yöntem, ilgilenilen bir proteinin yıkımı için gereken genetik gereksinimleri ve çevresel etkileri belirlemek amacıyla kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protein yıkımını görselleştirmek için kullanılan pulse-chase tekniklerinin aksine, radyoaktif izotoplar ve uzun immünopresipitasyon basamaklarının gerekmemesidir.
Bu prosedür, gerek endojen bir maya proteini gerekse bir plazmidden eksprese edilen bir proteinin analiz edilmesi için kullanılabilir. İkinci durum için, standart bir maya transformasyon protokolü takip edilerek, maya suşu ilgili proteini kodlayan bir plazmid ile transforme edilir. Mayayı beş mililitre uygun besiyerine ekleyin.
30 °C'de, rotasyonla gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, her bir gece boyu kültürü için 600 nanometredeki optik yoğunluğu (OD600) ölçün. Kültürleri, 15 mL taze besiyerinde 0,2 OD600 değerine seyrelteyin.
Hücreler orta-logaritmik büyüme evresine ulaşana kadar 30 °C'de çalkalamalı olarak inkübe edin. Maya hücreleri büyürken, sikloheksimid takip (chase) prosedürü için hazırlık yapın. Hücrelerin sikloheksimid varlığında inkübasyonu için 15 ml konik tüpleri alabilen bir ısıtıcı bloğu 30 °C'ye ayarlayın.
Kültürlere etkili ısı dağılımı sağlamak için, ısıtma bloğunun her bir kuyucuğuna, 15 mL'lik konik bir tüp yerleştirildiğinde su seviyesinin kuyucuğun kenarına kadar yükselmesini ancak taşmamasını sağlayacak şekilde su ekleyin. Hücre lizini sonrası protein denatürasyonu için, 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini alabilecek ikinci bir ısıtma bloğunu 95 °C'ye ayarlayın. Taze büyüme ortamını 30 °C'ye kadar önceden ısıtın.
Analiz edilecek her kültür için her zaman noktası başına 1,1 mililitre besiyeri gereklidir. Önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine 50 mikrolitre 20x Stop Mix ekleyin. Analiz edilecek her kültür için her zaman noktası başına bir tüp hazırlayın.
Tüpleri buz üzerine yerleştirin. Maya hücreleri orta-logaritmik büyüme evresine ulaştığında, analiz edilecek her zaman noktası için her kültürden 2,5 OD600 birim toplayın. Bir OD600 birimi, OD600 değeri 1,0 olan bir mililitre kültürde bulunan maya miktarına eşittir.
Toplanan hücreleri 15 mililitrelik konik tüplerde, oda sıcaklığında, 3.000 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın. Her bir hücre peletini, hücrelerin her 2,5 OD600 birimi için bir mililitre 30 °C taze büyüme ortamı kullanarak yeniden süspanse edin.
Sikloheksimid takibine başlamadan önce, maya hücresi süspansiyonlarını 30 °C'lik ısıtıcı blokta beş dakika inkube ederek dengeleyin. Bu prosedürün en zor yönü, sikloheksimid ekleme ve her örnek için hücre toplama zamanlamasıdır. Sikloheksimid ekleme ve hücre toplama için bir zaman çizelgesi oluşturup buna bağlı kalarak başarıyı sağlıyoruz.
Sikloheksimid takibini başlatmak için zamanlayıcıdaki "Start" düğmesine basın. İlk maya hücresi süspansiyonuna hızlı ancak dikkatli bir şekilde 250 µg/mL nihai konsantrasyon olacak şekilde sikloheksimid ekleyin ve karıştırmak için kısa süreliğine vorteksleyin. Sikloheksimid eklenmiş maya hücresi süspansiyonunun 950 µL'sini veya yaklaşık 2,4 OD600 birimini, 50 µL buz gibi soğuk 20x Stop Mix içeren önceden etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpüne hemen aktarın.
Tüm örnekler toplanana kadar mikro santrifüj tüpünü vorteksleyin ve buz üzerine yerleştirin. Geriye kalan her bir maya hücresi süspansiyonu için düzenli zaman aralıklarıyla, gösterildiği şekilde sikloheksimid kovalamasını başlatın. Sonraki her zaman noktasında, maya hücresi süspansiyonlarını vorteksleyin ve 50 µL ön soğutmalı 20x Stop Mix içeren etiketli mikro santrifüj tüplerine 950 µL aktarın.
Vorteksleyip toplanan hücreleri buz üzerine yerleştirin. Maya hücrelerinin çökmesini önlemek için, takip süreci boyunca 15 mililitrelik konik tüplerdeki hücre süspansiyonlarını yaklaşık her beş dakikada bir vorteksleyin. Tüm örnekler toplandığında, toplanan hücreleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 6.500 x g santrifüj hızıyla çöktürün.
Süpernatanı pipetleme veya aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Hücreler artık alkali lizis için hazırdır. Her bir hücre peletine 100 µL distile su ekleyerek hücreleri alkali lizise hazırlayın ve pipetle aşağı yukarı çekerek yeniden süspande edin.
Her bir örneğe 100 µL 0,2 M sodyum hidroksit ekleyin. Vorteksleyerek karıştırın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Bu aşamada, maya hücreleri henüz lizize edilmemiş ve proteinler serbest kalmamıştır. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 18, 000 ×g santrifügasyon ile çöktürün. Süpernatantı pipetleme veya aspirasyon yoluyla uzaklaştırın.
Hücreleri liz etmek için her bir hücre peletine 100 µL Laemmli Örnek Tamponu ekleyin. Pipetle aşağı yukarı çekerek yeniden süspanse edin. Proteinleri tamamen denatüre etmek için 95 °C'de beş dakika inkübe edin.
Çözünmeyen materyali çöktürmek için lizatları 18,000 ×g'de ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Çözünmüş ekstrakte protein olan süpernatant, SDS PAGE ile ayırmaya ve ardından Western blot analizine hazırdır. Alternatif olarak, lizatlar -20 °C'de saklanabilir.
Model bir maya endoplazmik retikulumla ilişkili yıkım substratı olan Deg1-Sec62'nin stabilitesi, sikloheksimid takip yöntemi ile analiz edildi. Deg1-Sec62 proteini, SDS PAGE üzerinde birden fazla tür olarak göç eder ve yabani tip hücrelerde kolayca yıkıma uğrar. Pgk1, bolluğu test edilen koşullarda değişmeyen bir yükleme kontrolüdür.
ER yerleşik ubiquitin ligaz hrd1 veya ubiquitin-konjugasyon enzimi ubc7'den herhangi birinin kaybı, Deg1-Sec62 proteinini önemli ölçüde stabilize etti; bu durum, söz konusu proteinlerin Deg1-Sec62 degradasyonundaki daha önce gözlemlenen rolünü doğrulamaktadır. Cue1, ubc7'yi ER membranına sabitleyen ve enzimi aktive eden bir transmembran proteindir, ancak Deg1-Sec62 degradasyonunda cue1 gereksinimi doğrudan araştırılmamıştır. Bu çalışmadan elde edilen, cue1 yokluğunda Deg1-Sec62'nin stabilize olduğu gözlemi, cue1'in Deg1-Sec62'nin ER ile ilişkili degradasyonundaki rolünü doğrulamıştır.
Western blot sonucu görüntüleme yazılımı kullanılarak nicelleştirildi. Örnekler arasındaki Deg1-Sec62 protein bolluğunu karşılaştırmak için, her bir örnek için Deg1-Sec62'nin Pgk1'e göre düzeltilmiş sinyal yoğunlukları oranı belirlendi. Bu prosedürün, en doğrudan şekilde, ilgilenilen bir proteinin kararlı durumdaki popülasyonunun degradasyon kinetiği hakkında bilgi verdiğini unutmamak önemlidir.
İlgilenilen bir proteinin yeni sentezlenen popülasyonunun degradasyonunu görselleştirmek için, pulse-chase deneyleri gibi diğer teknikler kullanılabilir. Sikloheksimid ve sodyum azidin son derece toksik olduğunu ve bu prosedürü gerçekleştirirken bu kimyasallarla doğrudan temastan kaçınmak için önlem alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, sikloheksimid takibi ve ardından western blotting kullanılarak Saccharomyces cerevisiae'deki protein yıkımının görselleştirilmesi için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu teknik, araştırmacıların radyoaktif izotoplara veya uzun süreli immünopresipitasyon basamaklarına ihtiyaç duymadan spesifik proteinlerin yıkımını analiz etmelerine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Protein degradasyonu
- Hücre biyolojisi
- Maya model sistemleri
Arka Plan
- Protein bolluğu, sentez ve yıkım hızlarından etkilenir.
- Sikloheksimid takibi (cycloheximide chase), protein stabilitesini incelemek için kullanılan bir yöntemdir.
- Western blotting, spesifik proteinlerin saptanması için kullanılan bir tekniktir.
- Protein yıkımının anlaşılması, hücresel süreçlere dair içgörüler elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Mayada belirli bir proteinin degradasyonunu görselleştirmek.
- Protein degradasyonunu etkileyen genetik ve çevresel faktörleri belirlemek.
- Geleneksel pulse-chase tekniklerine daha basit bir alternatif sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Protein sentezini inhibe etmek için sikloheksimid kullanımı.
- Protein seviyelerini zaman içinde analiz etmek için Western blotting.
- İlgili proteinleri kodlayan plazmidlerle mayanın transformasyonu.
- Mayanın uygun büyüme ortamına inokülasyonu.
Ana Sonuçlar
- Maya hücrelerinde protein degradasyonunun başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Protein degradasyonu için genetik gereksinimlerin belirlenmesi.
- Çevresel etkilerin protein stabilitesi üzerindeki değerlendirmesi.
- Yöntemin verimliliğinin geleneksel tekniklerle karşılaştırmalı olarak gösterilmesi.
Sonuçlar
- Sikloheksimid takip yöntemi, protein yıkımını incelemek için etkilidir.
- Bu teknik, mayadaki protein stabilitesinin analizini kolaylaştırır.
- Bulgular, hücrelerdeki protein dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Protein degradasyon kinetiği, erken keşif aşamasındaki hedef doğrulaması ve mekanistik risklerin azaltılması için kritik öneme sahiptir. Sikloheksimid kovalamaca (chase) yöntemi, genetik olarak yönetilebilir bir modelde protein stabilitesinin kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler. Bu yaklaşım, bileşik taraması öncesinde hedeflerin önceliklendirilmesi ve mekanistik hipotezlerin risklerinin azaltılması için öngörücü bir güven sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kararlı durum protein popülasyonlarının bozunma hızlarını ölçerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Genetik ve çevresel pertürbasyon analizi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Hedef güveni ve portföy önceliklendirme kararlarına temel oluşturacak kantitatif bozunma kinetiği verileri üretir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Zamana bağlı protein stabilitesi ölçümleri için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir western blot çıktıları üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Bileşiklerin protein degradasyon yolları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için çoklu koşul testleriyle uyumludur.
- Platform Kullanımı: Maya tabanlı sistemlerde degradasyon modülasyonu aracılığıyla hedef etkileşimini değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik oluşturur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Korunmuş yıkım mekanizmalarını modellemek için hastalıkla ilişkili bir sistem olarak Saccharomyces cerevisiae kullanır.
- Translasyonel Süreklilik: Korunmuş ubiquitin-proteazom yolu analizi aracılığıyla, keşif aşamasındaki hedef doğrulamayı preklinik çalışmalarla ilişkilendirir.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Memeli doğrulaması öncesinde hedef mekanizmalardaki riskleri azaltmak için yıkımın genetik ve çevresel modifikasyonlarını belirler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef seçimini ve etki mekanizması çalışmalarını bilgilendiren degradasyon kinetiği verileri sağlayarak, hedef doğrulamasından öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Degradasyon değişkenlerini sentez etkilerinden izole ederek hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Mühendislik ürünü maya suşlarında temel degradasyon oranlarını belirleyerek bileşik taraması için assay geliştirmeye olanak tanır.
- Analitikler: Karşılaştırmalı koşul analizleri için yükleme kontrollerine normalize edilmiş kantitatif western blot sonuçları üretir.
- Translasyonel Araştırma: Korunmuş ER ile ilişkili degradasyon bileşenleri aracılığıyla maya tabanlı degradasyon bulgularını memeli sistemlerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Genetik ve kimyasal perturbasyon çalışmaları yoluyla projeler arası hedef risk azaltma için standartlaştırılmış bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Protein yarı ömrünü nicelleştirerek ve degradasyon yolu bağımlılıklarını belirleyerek mekanistik risk azaltma sağlar.
- Operasyonel Değer: Standart western blot altyapısıyla uyumlu, standardize edilmiş ve izotop içermeyen bir iş akışı sunar.
- Stratejik Değer: Hedef mekanizmadaki belirsizliği ve bileşiklerin stabilite üzerindeki modüle edici etkilerini azaltarak go/no-go (devam/tamam) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Degradasyon uygulanabilirliği ve yol korunumuna dayalı olarak hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Maya kültürü yönetimi, sikloheksimid güvenlik protokolleri ve western blot kantifikasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- 30°C ve 95°C ısıtıcı bloklara, santrifüjlere ve standart SDS-PAGE/western blotting ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Zaman noktası toplama, lizis verimliliği ve sinyal normalizasyon prosedürlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Adaptasyon değerlendirmeleri arasında plazmid tabanlı ekspresyon sistemleri, epitop etiketleme ve maya nakavt kütüphaneleri ile uyumluluk yer alır.
- Pratik kısıtlamalar arasında sikloheksimid toksisitesi, translasyon üzerindeki potansiyel hedef dışı etkiler ve western blotting'de lineer aralık saptama gerekliliği bulunmaktadır.
