Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon
26 Eylül 2016
Bu el yazması, deneysel kemik metastazları oluşturmak için kanser hücrelerini özellikle kemikler de dahil olmak üzere arka bacak dokularına iletmek için bir teknik olan intra-iliak arter (IIA) enjeksiyonunun ayrıntılı prosedürünü sağlar. Başlangıçta meme tümörü modelleri ile oluşturulmuş olsa da, bu protokol diğer kanser türlerine de kolayca genişletilebilir.
Bu prosedürün genel amacı, kanser hücrelerini intra-iliak arter enjeksiyonu yoluyla kemikler de dahil olmak üzere doğrudan arka bacak dokularına ileterek deneysel kemik metastazı oluşturmaktır. Dolayısıyla bu yöntem, meme kanseri kemik kolonizasyonu ile ilgili temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir, özellikle bu sürecin erken aşamasında, meme kanseri hücrelerinin kemikteki mikro çevre hücreleriyle nasıl etkileşime girdiği. Bugün iliak arter enjeksiyonu yaptık.
Bu tekniğin temel avantajı, lokal doku hasarına neden olmadan çeşitli kanser türleri için deneysel bir mikroskobik kemik metastazı modelini verimli ve seçici bir şekilde oluşturmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edeceklerdir, çünkü mikroskopta doğru, iliak arter enjeksiyon pozisyonu olan bir enjeksiyon bulmak, yüzde doksandan daha yüksek enjeksiyon başarı oranı elde etmek için pratik yapabilir. Beş ila altı haftalık yirmi gramlık bir farenin ayak parmağını tutarak uygun sedasyon seviyesini onaylayarak başlayın.
Göz merhemi uyguladıktan sonra, traş edilmiş sağ kasık bölgesini sıralı, steril, %70 izopropil etanole batırılmış pamuklu çubuklarla birkaç kez silin ve ardından betadin cerrahi fırçalayın. Ardından, farenin tamamını steril bir örtü ile örtün. Ardından, sağ alt karın bölgesindeki dördüncü ve beşinci meme uçları arasında bir ila 1,2 santimetrelik bir cilt kesisi yapmak için steril bir on numara karbon çeliği neşter bıçağı ve üç numara bir tutamak kullanın.
Ve hayvanı standart bir tezgah üstü diseksiyon mikroskobu altında aktarın. 4X objektif altında, yağ dokusu ile periton arasındaki kesiye künt ayırma forsepsleri yerleştirin ve iliak damarları ve sinirleri ortaya çıkarmak için dokuları her iki taraftan dışa doğru itin. Daha sonra, damarlar ve damarlara en yakın sinir arasındaki bağ dokusunu kırmak için düz, ince forseps kullanın.
Daha sonra, açılı forsepsleri bağ dokusu boyunca ve iliak damarların altından kaydırırken, açılı forsepsleri doku boyunca yönlendirmek için düz forsepsleri damarların diğer tarafındaki bağ dokularına yerleştirirken. Bu adım için ilial kenar ve arteri bir demet olarak ayırmanızı ve kaldırmanızı öneririz. Tümör hücreleri sadece atardamar içine enjekte edilse de, her iki damarı birlikte izole etmek zamandan ve emekten tasarruf sağlar.
Açılı forsepsler yerleştirildikten sonra, diseksiyon sırasında damarları açılı forsepslerin üzerinde tutarak iliak ven ve arteri çevreleyen dokudan daha fazla ayırın. Damarlar temiz olduğunda, 4-0 ipek sütürün ucunu açılı forsepslere iletmek için düz forsepsleri kullanın ve dikişi damarların altına yavaşça ve nazikçe çekin. Hem iliak ana ven hem de arter damarları daha sonra dikiş tarafından tutulmalıdır.
Damarlar hazır olduğunda, tümör hücrelerini tek bir hücre çözeltisine yeniden süspanse etmek ve kümeleri parçalamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, fare başına 100 mikrolitre hücreyi 31 gauge insülin şırıngasına aspire edin. Şimdi, açılı forsepsleri, dikişi kılavuz olarak kullanarak damarların altına geri kaydırın ve forsepsleri, damarlar uçlara nazikçe dayanacak şekilde açın.
Öte yandan, iğne ucunu eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde, arterin forseps uçları arasındaki bölümünün lümenine sokun. Hücreleri enjekte etmek için pistona yavaşça bastırın. Hücre süspansiyonu kanı damardan geçirecektir.
Tüm hücreler verildiğinde, kanamayı önlemek için damarları forseps üzerinde yukarıda tutarak iğneyi nazikçe çıkarın. Ardından dikişi çekin. Son olarak, forsepsleri hızlı bir şekilde çıkarın ve kanamayı durdurmak için kesi üzerine beş ila 10 dakika boyunca pamuklu bir bez bastırın.
Burada, beşinci GFP lusiferin etiketli MCF-7 meme kanseri hücrelerine beş kez 10 kez intrailiak arter enjeksiyonundan sonra temsili bir tam hayvan biyolüminesans görüntüsü ve ardından retro-orbital sinüs enjeksiyonu ile d-lusiferin uygulaması gösterilmektedir. Enjeksiyondan 14. günde, intrailiak arter enjekte edilen arka kemikten güçlü bir biyolüminesans sinyali elde edildi, ancak kontralateral kontrol kemiğinden elde edilmedi, bu da enjekte edilen hücrelerin spesifik lokalizasyonunu doğruladı. Tümör taşıyan kemiklerin bir H&E boyaması kesitinde, intra-iliak arter enjeksiyonundan 14 gün sonra kemik dokusunda mikroskobik MCF-7 metastatik lezyonlarını gösteren büyük çekirdeklere sahip kompakt, parke taşı benzeri bir hücre popülasyonu da gösterildi.
Ayrıca, kemik bölümlerinin immünofloresan boyaması, MCF-7 hücrelerinin osteoblastlar ve preosteoblastlarla birlikte karıştığını da ortaya çıkardı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik on ila on beş dakika içinde tamamlanabilir. Bu yordamları izleyerek, ek soruları yanıtlamak için başka yöntemler kullanabilirsiniz.
Örneğin, metastaz nişindeki mikroçevre hücrelerinin profilini çıkarmak ve bunları normal hücrelerle karşılaştırmak için RNA-Seq'i kullanabiliriz. Bu teknik, meme kanseri araştırmacıları ve prostat kanseri araştırmacıları için hayvanlarda kemik mikrometastazı incelemeleri için bir yol sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, intrailiak arter enjeksiyonu ile meme kanseri kemik metastazı modelinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.
Lütfen uygun önlemleri alın çünkü ketamin ve ksilazin ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, deneysel kemik metastazları oluşturmak amacıyla kanser hücrelerini kemikler dahil olmak üzere arka ekstremite dokularına iletmek için kullanılan intra-iliyak arter (IIA) enjeksiyon tekniğini detaylandırmaktadır. Bu yöntem, özellikle meme kanseri hücresinin kemik mikroçevresi ile olan etkileşimlerinin incelenmesinde oldukça faydalıdır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Deneysel Teknikler
Arka Plan
- Kemik metastazı, kanser hastalarında yaygın görülen bir komplikasyondur.
- Kanser hücrelerinin kemikte kolonize olma mekanizmalarının anlaşılması, tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- İntra-iliyak arter enjeksiyon yöntemi, kanser hücrelerinin hedeflenmiş bir şekilde iletilmesine olanak tanır.
- Bu teknik, diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında lokal doku hasarını minimize eder.
Çalışmanın Amacı
- Kemik metastazını incelemek için bir model oluşturmak.
- Meme kanseri hücreleri ile kemik mikroçevre hücreleri arasındaki etkileşimleri araştırmak.
- Enjeksiyon tekniğinin doğruluğunu ve başarı oranını artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kanser hücrelerinin intra-iliak artere enjeksiyonu.
- Beş ila altı haftalık fare modelinin kullanımı.
- Sedasyon seviyelerinin ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle izlenmesi.
- Yüksek başarı oranları elde etmek için enjeksiyon tekniklerinin uygulanması.
Temel Sonuçlar
- Bu teknik, kemik metastaz modellerinin verimli bir şekilde kurulmasına olanak tanır.
- Pratikle yüksek başarı oranları elde edilebilir.
- Bu yöntemle minimal lokal doku hasarı gözlemlenir.
- Meme kanseri hücre kolonizasyonunun erken evrelerine dair bilgiler edinilir.
Sonuçlar
- İntra-iliyak arter enjeksiyonu, kanser araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, meme kanseri dışındaki çeşitli kanser türleri için de uyarlanabilir.
- İleri çalışmalar, kanser-kemik etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Erken evre kemik metastazının güvenilir modellerinin oluşturulması, özellikle mikrometastatik kolonizasyonu hedefleyen terapötik müdahalelerin değerlendirilmesi açısından onkoloji ilaç keşfinde kritik bir zorluk olmaya devam etmektedir. İntra-iliyak arter enjeksiyon tekniği, kanser hücrelerinin arka ekstremite kemiklerine spasyotemporal olarak senkronize dağılımına olanak tanıyarak, yayılmış tümör hücrelerinin güçlü bir şekilde kantifikasyonunu destekler ve prosedürel doku hasarından kaynaklanan karmaşık inflamatuar yanıtları azaltır. Bu yaklaşım, sistemik organ metastazı olmaksızın indolent kemik lezyonlarının sürekli izlenmesine imkan tanıyarak preklinik çalışmalarda öngörü güvenini artırır ve böylece hedef doğrulama ile öncü bileşik belirleme çalışmaları için kemik metastaz modellerinin translasyonel ilgisini iyileştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kanser hücrelerinin osteoblastlar ve preosteoblastlar gibi kemik mikroçevre bileşenleri ile erken dönem etkileşimlerini modelleyerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kanser hücrelerinin arka ekstremite kemiklerine iletilmesi için seçici ve verimli bir yol sunarak, deneysel kohortlar genelinde tutarlı model oluşturulmasını kolaylaştırır.
- Stratejik Değer: Biyolüminesans ve histolojik okumalar aracılığıyla, tek hücrelerden çok hücreli lezyonlara doğru mikrometastatik progresyonun görüntülenmesine izin vererek kemik metastazı yollarının mekanistik risk azaltma sürecini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Biyolüminesans sinyal yoğunluğu ve histolojik lezyon yoğunluğu gibi ölçülebilir çıktılar üreterek metastatik yükün standardize edilmiş şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Yerel doku hasarını ve buna bağlı yara iyileşmesi karıştırıcı faktörlerini önleyerek analiz tekrarlanabilirliğini artırır ve sonraki analizlerdeki değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: Hedef dışı organ metastazının minimum düzeyde olduğu hastalığa özgü sistemler oluşturarak, tarama kampanyalarında doz-yanıt ve zamanlama çalışmaları için daha uzun gözlem pencereleri sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Klinik açıdan kritik bir tıkanıklık noktası olan, yayılmış tümör hücrelerinden kemikteki mikrometastazlara geçiş sürecini yakalayarak hastalıkla ilgili sistemlerle uyum sağlar.
- Operasyonel Değer: Boylamsal görüntüleme ile H&E ve immünofloresan boyama gibi bitiş noktası analizlerini destekleyerek, keşiften preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Stratejik Değer: Kanser-stroma etkileşimini veya kemik mikroçevresindeki niş oluşumunu bozan bileşikler üzerinde erken etkinlik sinyalleri sağlayarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarına temel oluşturur.
İş Akışı ve Hattı Entegrasyonu
İntra-iliyak arter enjeksiyon yöntemi, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan keşif sürecine uygundur; bu durum özellikle, erken metastaz modellemesinin mekanistik anlayışı ve terapötik pencereleri bilgilendirdiği kemik hedefli terapötikler için geçerlidir.
- Keşif Biyolojisi: Tümör hücrelerinin iskelet bölgelerine kontrollü iletimini sağlayarak, kanser hücresi-kemik mikroçevresi etkileşimlerinin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Yüksek içerikli tarama platformlarına uygun, nicel biyolüminesans ve histopatolojik okumaları olan, analize hazır biyolojik sistemler sunar.
- Analitik: Biyolüminesan foton akısı, histolojik kesitlerdeki lezyon alanı ve tümör ile stromal hücrelerin ko-lokalizasyon indeksleri dahil olmak üzere ölçülebilir bağımlı değişkenler oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Klinik kemik metastazında osteolitik veya osteoblastik progresyondan önce gelen avasküler mikrometastatik evreyi modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kanser türleri ve laboratuvarlar arasında uyarlanabilir, standartlaştırılmış bir cerrahi tekniği temsil ederek kemik metastaz modeli oluşturmada projeler arası tutarlılığı teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Prosedür kaynaklı inflamasyondan gelen gürültüyü azaltarak ve fenotipik değişikliklerin ilaç mekanizmalarına net bir şekilde atfedilmesini sağlayarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Belirlenmiş anatomik işaret noktaları ve sütür destekli damar izolasyonu aracılığıyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirerek operatöre bağlı değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Beklenmedik kemik tropizmi nedeniyle geç aşamada meydana gelen başarısızlıkları azaltan, erken ve organa özgü metastaz çıktıları sağlayarak git/gitme (go/no-go) karar verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Sigenik veya ksenograft modellerde tedavi kolları arasındaki metastatik yükün doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanıyarak, kemik hedefli adayların riskle uyumlu önceliklendirilmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Damar izolasyonu ve dissection mikroskobu altında sütür ligasyonu dahil olmak üzere mikrocerrahi tekniklerde yetkinlik gerektirir.
- Steril dissection mikroskoplarına, ince pensetlere, insülin şırıngalarına ve izotonik hücre süspansiyonu hazırlama ekipmanlarına erişime bağımlıdır.
- Hayvan refahını ve model tutarlılığını sağlamak için anestezi protokollerinin (örneğin, ketamin/ksilazin) ve ameliyat sonrası izlemin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Adaptasyon değerlendirmeleri, kanser hücre hattının agresifliğine ve murine suş değişkenliğine göre enjeksiyon hacminin ve hücre konsantrasyonunun ayarlanmasını içerir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, %90'ın üzerinde enjeksiyon başarı oranına ulaşmak için gereken öğrenme süreci ve kasık insizyonu sırasında periton kontaminasyonunu önlemek için aseptik teknik uygulama ihtiyacı yer alır.
