Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC)

Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizörü ile Yüksek İçerikli Tarama Tabanlı Platformu birleştiren bu yaklaşımın genel amacı, test edilen bileşiklerin Tokin Profilini elde etmek için etkili dozlar, toksisite ve biyolojik etkiler hakkında bilgi sağlamaktır. Bu yaklaşım, Toksikoloji alanındaki anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, sitotoksisite, genotoksisite ve hücresel stres tepkilerinin ele alınması.

Ayrıca, aynı anda birden fazla biyokimyasal ve morfolojik parametre hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda farklı hücre tiplerine ve hücre kültürü modellerine de uygulanabilir. Yargı yetkisi ve sınırlama nedeniyle, tüm yaklaşım yalnızca kısa bir bileşik parçası değerlendirilirken gerçekleştirilecektir. Aynı nedenle, Yüksek İçerik Tarama Değerlendirmesini göstermek için yalnızca bir protokol gösterilecektir.

Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan teknisyenler Stefano Acali ve Alexander Laurent olacak. Normal insan bronşiyal epitel hücrelerini veya NHBE hücrelerini görmek için, aleti empedans ölçümlerinin sayısını ve süresini tanımlayacak şekilde programlayın. Bu çalışmada, veriler 48 saat boyunca her 15 dakikada bir kaydedilmektedir.

96 oyuklu bir RTCA plakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam pipetleyerek plaka arka planını ölçün. Bu adım, cihazın hücre tabanlı hesaplamalar için temel referans olarak kullanılacak orta elektrik direncini hesaplaması için teknik bir gereksinimi temsil eder. Daha sonra, RTCA plakasının her bir oyuğunda bulunan ortama mililitre başına 144.000 hücre konsantrasyonunda 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Hücre ısındıktan sonra, hücrelerin bağlanmasını ve homojen hücre dağılımı elde etmesini sağlamak için plakayı 40 dakika oda sıcaklığında bırakmak çok önemlidir. RTCA plakalarını inkübatördeki yuvada inkübe edin ve dozlamadan önceki 24, artı veya eksi iki saat boyunca verileri kaydetmeye başlayın. Pozitif kontrol için, 10 milimolar staurosporin stok çözeltisini DMSO'da bir ila 10 arasında seyreltin.

5x çalışma çözeltisi elde etmek için 195 mikrolitre ortama beş mikrolitre seyreltme ekleyin. Zararlı ve potansiyel olarak zararlı bileşenler için, tek bir molar stok çözeltisi oluşturmak üzere her birini araçta çözün. Ardından, 100 milimolar bir çözelti oluşturmak için her bir test maddesi stok çözeltisini bir ila 10 arasında orta derecede seyreltin.

Önce B'den F'ye kadar olan kuyucuklara orta artı% 10 araç ekleyerek ve 100 milimolar çözeltiyi A kuyusuna ekleyerek bileşik ana plakayı oluşturun. 5x çalışma çözeltisini elde etmek için beş adımlı, bir ila 10, seri seyreltme gerçekleştirin. Dozlama için, RTCA cihazını duraklatın, maruz kalma plakasını çıkarmak için kızağı açın ve empedans ölçümünü etkileyebilecek hücrelerin soğumasını önlemek için plakayı RTCA sıcaklık aletine yerleştirin. Bileşik ana plakadan hücrelere 25 mikrolitre 5x çözelti ekleyin, Bileşik ana plakadakiyle aynı dozlama sırasını koruyun.

Mevcut hücre kültürü ortamını çıkarmayın. Ardından, mevcut kültür ortamını çıkarmadan alt sıranın sağ yarısındaki hücrelere 25 mikrolitre 5x Pozitif kontrol solüsyonu ekleyin. Benzer şekilde, alt sıranın sol yarısındaki hücrelere 25 mikrolitre ortam ekleyin.

Plakayı plaka kapatıcı ile kapattıktan sonra, plakayı RTCA kızağına geri yerleştirin ve kilitleyin. İstenen pozlama süresi için veri kaydını yeniden başlatın. Veri kaydının ardından, HCS analizinde hangi test maddesinin kullanılacağını belirlemek için RTCA hücre canlılık verilerini analiz edin.

Bu deneyde, HCS analizi için 1-aminonaftalen, Arsenik, Krom ve Krotonaldehit seçilmiştir. NHBE hücrelerini görmek için, 96 oyuklu bir siyah plakanın her bir oyuğuna mililitre başına 120.000 hücrede 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. HCS plakasını 30 dakika oda sıcaklığında bıraktıktan sonra, hücrelerin kuyucuklara yapışmasına izin vermek için, dozlamadan önce 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 24, artı veya eksi iki saat inkübe edin.

Pozitif kontrol için, ikinci sütundaki her pozitif kontrolün stok çözeltisinden 40 mikrolitre dağıtın. Ardından, aracın 20 mikrolitresini üçüncü ve beşinci sütunlara dağıtın. Ve dördüncü sütunda aracın 40 mikrolitresi.

İkinci sütundaki kuyucuklardan 12 mikrolitre çekin, üçüncü sütundaki kuyucuklara dağıtın ve karıştırın. Üç doz ile son bir seri seyreltme ve her pozitif kontrol bileşiği için araç elde edilene kadar devam edin. Pozitif kontrol plakasını oluşturmak için, üç dozun ve aracın ortamında bir ila 40 seyreltme hazırlayın.

Bileşik ana plakayı yapmak için, 100 milimolar konsantrasyon için her bir test maddesi stok çözeltisini, bir ila 10 orta boy olacak şekilde yeniden askıya alın ve seyreltin. Her test maddesi için seçilen 10x dozu elde etmek için% 5 araç ile ortam kullanarak seyreltmeler gerçekleştirin. Hem pozitif kontroller hem de bileşik plaka artık maruz kalma plakası üzerine dozlanmaya hazırdır.

Daha sonra, Bileşik ana plakadaki ile aynı dozlama sırasını koruyarak, Bileşik ana plakadan hücrelere üç kopya halinde 25 mikrolitre 5x çözelti ekleyin. Mevcut hücre kültürü ortamını çıkarmayın. Ardından, Pozitif kontrol plakasındaki ile aynı dozlama sırasını koruyarak, Pozitif kontrol plakasından alt sıradaki hücrelere 25 mikrolitre 5x solüsyon ekleyin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi yeterli miktarda canlı hücre boyama çözeltisi hazırlayın. Ardından, satıcının talimatlarına göre hem mitokondri boyasını hem de zar geçirgenlik boyasını canlı hücre boyama çözeltisinde seyreltin. Sitotoksisite Testi olarak adlandırılan plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre canlı hücre boyama çözeltisi ekleyin.

Hücre kültürü ortamını çıkarmayın ve 37 santigrat derece,% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin. Ortamı ve boyama solüsyonunu nazikçe aspire edin ve her birine 100 mikrolitre Fiksasyon Solüsyonu ekleyin. Ardından, plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, Fiksasyon Solüsyonunu nazikçe aspire edin ve yıkama tamponu kuyusu başına 100 mikrolitre ile bir kez yıkayın. Yıkama tamponunu çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmeden önce her bir oyuğa 1x geçirgenlik tamponu başına 100 mikrolitre ekleyin. Geçirgenlik tamponunu aspire edin ve plakayı kuyucuk başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Ardından, yıkama tamponunu aspire edin ve her bir kuyucuğa 100 mikrolitre 1x Engelleme tamponu ekleyin. Daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Anti-Sitokrom C Antikorunu, bir ila 250 arasında Primer Antikor Çözeltisi içinde seyreltin.

Daha sonra, Bloke Edici tamponu aspire edin ve karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika inkübe etmeden önce her bir oyuğa oyuk başına 50 mikrolitre Birincil Antikor Çözeltisi ekleyin. Anti-Fare Antikorunu, İkincil Antikor ve Nükleer Çözelti içinde bir ila 500 arasında seyreltin. Ayrıca, nükleer boyayı İkincil Antikor ve Nükleer Çözelti içinde bir ila 1.000 oranında seyreltin.

Birincil Antikor Çözeltisini aspire ettikten sonra, plaka yıkayıcıyı kullanarak plakayı kuyu başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkama tamponunu aspire edin ve plakanın her bir oyuğuna oyuk başına 50 mikrolitre İkincil Antikor ve Nükleer Çözelti ekleyin. Şimdi, plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.

İkincil Antikor ve Nükleer Çözeltinin aspirasyonunu takiben, plaka yıkayıcıyı kullanarak plakayı oyuk başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından, kuyucuk başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Plaka artık HCS cihazında değerlendirilmeye hazırdır ve satın alma işlemine başlanır.

Test maddesi tedavisinin temsili RTCA hücre canlılığı sonuçları gösterilmiştir. Sadece 1-aminonaftalen, Arsenik, Krom ve Krotonaldehit ile 24 saatlik maruziyetten sonra toksik doza bağlı bir etki elde edilir, çünkü hepsi 20 milimolar'dan daha az hesaplanmış bir LD50 göstermiştir. Diğer bileşiklerle toksik etki elde edilmemiştir.

Burada gösterilen, sadece 1-aminonaftalen tedavisi için temsili HCS sonuçlarıdır. 1-aminonaftalanın toksik etkisi, hücre zarında ciddi bir hasara neden olur, bu da dört saatlik maruziyetten sonra doza bağlı bir şekilde hücre zarı geçirgenliğinin artmasına neden olur. Bileşik aynı zamanda mitokondriyi de etkiliyor ve dört saatlik maruziyetten sonra kütle artışına neden oluyor ve daha sonra dört ve 24 saatlik maruziyetten sonra çekirdeklerde tespit edilebilen Sitokrom C salınımına neden oluyor.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki ila üç gün içinde uygulanabilir, çünkü çoğu ayar ve dozlama için günde yaklaşık bir saat uygulamalı zaman gerektirir. Seçilen protokole bağlı olarak, Yüksek İçerik Taraması, tüm boyama prosedürünün yürütülmesi için maksimum üç ve 1/2 saat gerektirir. Bu yordamı denerken, daha geniş bir uç nokta aralığının seçilmesinin iş akışına karmaşıklık katmasına rağmen, süreyi önemli ölçüde artırmayacağını unutmayın.

Optimum bir iş akışı ile aslında birkaç plaka paralel olarak değerlendirilebilir. Tam otomatik hücre ayarı, bileşik seyreltme, dozlama ve boyama ve yeni son noktanın eklenmesi dahil olmak üzere Yüksek İçerikli Tarama Platformunun sürekli gelişimi, toksikolojik profilleme için güçlü bir araç olarak Yüksek İçerikli Tarama Platformunun kapasitesini daha da genişletecektir. Ayrıca, bu kadar yüksek verimde çoklu, tek toksikolojik uç noktaların kombinasyonu, hayvanlarda kimyasal testleri azaltma çabamızda bizi bir adım daha ileri götürecektir.