Name: Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Öğrenin, sigara dumanı bileşenlerinin toksisitesini değerlendirmek için empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizi ve yüksek içerik tarama yöntemlerini kullanmayı. Bu yaklaşım, sitotoksisite ve hücresel stres yanıtlarını inceleyerek toksikolojik profiller oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar yazının kendi incelenmek üzere Karsta Luettich ve Grégory VUILLAUME teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Rodgman, A., Perfetti, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodgman%2C+A+%22The+chemical+components+of+tobacco+and+tobacco+smoke%22">The chemical components of tobacco and tobacco smoke</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen, London. (1959).</li>
<li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research+combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).</li>
<li>US Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Harmful+and+potentially+harmful+constituents+in+tobacco+products+and+tobacco+smoke%3B+established+list%2C+federal+register%22">Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register</a>. , 20034-20037 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Suarez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Biology+Approach+for+Evaluating+the+Biological+Impact+of+Environmental+Toxicants+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro.</a> Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).</li>
<li>Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+alterations+in+mitochondrial+mass+and+function+characterize+different+models+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis.</a> Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1%2Fcaspase-9+complex+initiates+and+apoptotic+protease+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+%CE%B1+stimulates+AP-1+activity+through+prolonged+activation+of+the+c-jun+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase.</a> J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).</li>
<li>Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+in+rat+hippocampal+neurons%3A+selective+imaging+with+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine.</a> J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).</li>
<li>Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+glutathione+in+anchored+cells+with+monochlorobimane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane.</a> J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).</li>
<li>Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pardaxin+an+antimicrobial+peptide%2C+triggers+caspase-dependent+and+ROS-mediated+apoptosis+in+HT-1080+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells.</a> Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).</li>
<li>Bao, S., Knoell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+modulates+cytokine-induced+lung+epithelial+cell+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+Cytotoxicity+Profiling+Using+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening.</a> Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).</li>
</ol>

Tüm yazarlar Philip Morris International&#39;ın çalışanlarıdır. Philip Morris International, bu projenin finansman ve sponsor tek kaynağıdır.

Hayvan deneyleri alternatifler için ve yeni yüksek kapasiteli test yaklaşımları için ihtiyaçları yaygın olarak son yıllarda ele alınmıştır. Bu yakından hedef dokuların fizyolojisini taklit hücresel deneyleri kullanılarak standart toksisite testleri için alternatif yöntemler, araştırmak için bilim adamları ve düzenleyici otoriteleri yol açmıştır. Bu çalışmada, insan akciğer epitel hücreleri üzerinde tek CS bileşenlere maruz kalma etkisini değerlendirmek için bir içeriği yüksek tarama (HCS) platformu ile gerçek zamanlı hücre analizörü (RTCA) birleştirerek uygulanabilirliğini göstermiştir. Bu kurulum benzer diğer çeşitli havada bulunan kirleticilerin, havadaki partiküllerin ve nanopartiküller tarafından uyarılan sitotoksisite değerlendirmek için uygulanabilir. Ayrıca, elde edilen sonuçlar nedensel biyolojik ağlarına dayalı tam genom transkriptomik ve hesaplama yöntemleri gelenler ile uyumlu olabilir. Önceden bildirildiği gibi, bu yaklaşım moleküler yolu verileri doğrulamak için bize izinHCS bitiş noktaları ile CS maruz 5 üzerine pertürbasyon, ayrıca fenotipik bu yolu tedirginlikler ele. Bir akış deneyi olarak, gerçek zamanlı hücre analiz dozu ve maruz kalma süresi noktası aşağı analiz 14 için uygun olabilir daha iyi karar verme sağlayan bir doz ve zamana bağımlı çözünürlük, hücre canlılığı ile ilgili bilgi sağlar. analizörü ilkesi bir altın mikroelektrot ile kaplı bir kültür de yüzeyde takmak ve yayılma olarak hücreler tarafından üretilen elektrik empedans değişikliklere dayanır. Empedans sonuçta morfolojisi ve hücre canlılığı, yayma, hücre yapışmasını izlemek için kullanılabilir hücre dizini adlı bir boyutsuz parametre, dönüştürülür. Bu teknik sitotoksik mekanizmaları hakkında bilgi sağlamaz rağmen, duyarlılığı bile HCS bilgilendirici olmadığı çok düşük dozlarda morfolojik hücresel değişimlerin tespit edilmesini sağlar (veriler gösterilmemiştir). Kümelenme Strateji dayalılı deneyler, biz RTCA metodoloji HCS bitiş noktaları ile karşılaştırıldığında daha düşük dozlarda morfolojik değişiklikleri tespit etmek mümkün olduğunu kaydetti. Gerçek zamanlı hücre analizörü ile ilk gösteriminin ardından, bir HCS platformu her HPHC tarafından ortaya sitotoksisite tür daha derinlemesine bilgi elde etmek için kullanıldı. hücre bölmeleri üzerindeki potansiyel etkileri doğru HPHCs profil izin HCS tahlil paneli / organelleri yanı sıra genotoksisite veya oksidatif stres yol açanlara tanımlamak için. Analiz seçilen HPHCs NHBE hücrelerinde sitotoksisite neden bu sayede farklı profiller ortaya çıkardı. Genel olarak, tüm bileşikler, fenol hariç test edilen en yüksek dozda nekroza neden olduğu bulunmuştur. potansiyel genotoksisite için bir marker olarak H2AX kanser gelişimi 1-aminonaphtalene indüklediği fosforilasyon rolü ise mitokondriyal toksisite okuma bu HPHC de ortaya çıkarılan aktivite HCS paneli (kütle artarak sitokrom C Relea tutarlıse) ve oksidatif stres (GSH azalması). Daha önce de tarif edildiği gibi, fenol mitokondriyal işlev bozukluğu indükler ve DNA hasarı gibi GSH tüketilmesine neden olarak tespit edilmiştir. Krom (VI), grup I kanserojen olarak sınıflandırılmıştır bileşiklerden biri ve Crotonaldehyde de hem özellikle krom (VI) aynı zamanda kaynaklı apoptosis (kaspaz çağlayanı etkinleştirme) ve krotonaldehit ROS üretimini artış neden olarak genotoksik tespit edilmiştir. Son olarak arsenik (V), stres kinaz yolu aktivasyonunun bir belirtecidir cJun fosforilasyonu uyardığı bulunmuştur. Bu çalışmada, in vitro olarak akciğer epitel hücreleri için bir model olarak NHBE hücreleri kullanılmıştır. Bir HCS ortamda bu hücreleri kullanılarak görülmemiş ve genotoksisite ve oksidatif stres belirteçleri de dahil olmak üzere uç noktalar, daha geniş bir yelpazede soruşturma sağladı. canlı hücre ve sabit hücre boyama yaklaşımları Hem genel teknik esneklik göstererek bizim protokoller dahilinde tarif edildi. fişlem, aynı protokoller bir flüoresan boya veya antikor kullanılarak saptanabilir hedefleri daha geniş bir yelpazesi için uygulanabilir. Canlı boyama protokollerin başarıyla uygulanması için, boyalar, bazı sınırlı yarılanma ömrü ve görüntü alma tamamlanmadan önce azalabilir floresan sinyali olarak, inkübasyon süresi saygı önemlidir. Farklı bir hücre tipi kullanılırsa, tüm boyama koşullarının uygun boya konsantrasyonu, yeniden değerlendirilmeli ve inkübasyon süresi farklı olabileceğini dikkate almak da önemlidir. Geçerli yazıda sadece beş bileşikler HCS metodolojisi ile tarandı bir senaryo tarif var. daha önce tarif edilen plaka düzeni göz önüne alındığında, bu şekilde daha fazla bileşik ya da eş zamanlı olarak taranması için sağlayan 24 levha (6 deneyleri, 2 zaman noktalarında) levha .bir sayısı da artırılabilir toplam 2 farklı levhayı dozlandı yatırımcılarınDaha fazla uç noktaları sunda. Bunu yapmadan önce, ancak, bir belirli uç noktalar (GSH ve ROS) derhal satın gerektiren dikkate almalı ve bunun sonucu olarak, plakaların dozaj önceki plaka satın izin vermek için kademeli bir şekilde yapılmalıdır. Plakalar daha sonraki bir aşamada boyama işleminin tamamlanması için, tespit sonrasında herhangi bir aşamada iletişim kuralı bölerek istiflenebilir Diğer taraftan, sabit bir hücre boyama protokolü kullanılarak bir avantajı temsil eder. Bu yaklaşım, örneğin veri kalitesinden ödün vermeden tüm canlı hücre boyama plakaları tamamlamak için zaman operatör sağlayacaktır. ayrıca plakaların sayısını azaltarak iş akışını optimize etmek için, aynı zamanda birlikte daha uç noktaları multipleks mümkün olacaktır. Bu bağlamda DNA Hasarı ve Stres Örneğin Kinaz farklı c yayan fluorochromes sadece iki ikincil antikor kullanılarak birbirine araştırılması olabilirhannels. Sürekli tam otomatik Hücre Serpilmesi bileşik seyreltme, dozajlama ve boyama dahil HCS platformun geliştirilmesi, hem de yeni uç noktaları ilavesi, epitelyal ilgili HPHCs ve diğer hücre tipleri için güçlü bir profil aracı olarak HCS platformun kapasitesini artıracaktır .

Toksikolojik risk değerlendirmesi tarihsel yaşam bilimlerindeki temel olsa da, aynı zamanda insanlar ve yüksek maliyet tutarsız çevirilebilirlik olarak eksiklikleri ile bağlantılıdır, hayvan modellerinin kullanımı dayanmıştır. Ayrıca, &quot;3R&quot; 2 (değiştirme, azaltma ve arıtma) ruhu hayvan testlerine alternatifler bulmak için giderek artan bir çaba olmuştur. Bu çaba, son birkaç yıl içinde ivme kazanmıştır çünkü sadece özellikle Avrupa Birliği&#39;nde bu tür yüksek verimlilik teknikleri ve aynı zamanda, çünkü hayvanlar üzerinde test kullanımını kısıtlayan mevzuat sistem biyolojisi yaklaşımları olarak son gelişmeler, evi. Toksik hakaretlere tepki düzenleyen hücresel sinyal yollarının karmaşıklığı tek toksikolojik son noktalar kullanılarak bazı bileşiklerin toksikolojik temelini açıklamak için yeterli olmayacaktır o belli yapar. Bunun için, etkileşen p yüzlerce etkileşimibiyolojik ağa katkıda roteinler de dikkate alınması gerekir. Bu ağlarda Toksik maddelerin etkisini araştırmak için, fenotipik orta ve yüksek verimli tarama deneyleri ile kombine bir sistem toksikoloji yaklaşımı güçlerini anlaması ve aynı zamanda bireysel toksik maddelerin etki mekanizması hakkında daha fazla bilgi sağlamak için yararlıdır. Bu çalışmada elde süreç ve spesifik flüoresan bazlı hücresel analizlerden elde edilen görüntü verilerini analiz otomatik bir mikroskop ve bir biyolojik yazılım uygulaması oluşan güçlü bir tarama aracı, yanı HCS kullanılabilir. Bu, tek bir hücre ya da hücre-altı seviyede, sayısal olarak bir hücre içinde görsel değişiklikler sağlar ve birçok parametre eş zamanlı olarak analiz edilmesi. 3, örneğin, DNA, iki iplikçikli kırılmalar histon H2AX fosforilasyon bir antikor bazlı kimlik kullanılarak değerlendirildi ve reaktif oksijen türleri (ROS), bir hücre-Perm kullanılarak ölçüldüEable süperoksit duyarlı boya. Akciğer epitel hücreleri sigara dumanı olmak üzere solunan toksik maddelerin, karşı ilk biyolojik bariyer temsil çünkü, biz Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından yayınlanan HPHCs etkisini profil bir in vitro model olarak primer bronş epitel hücreleri kullanılmaktadır. 4 Bu el yazması bir takip olduğunu biz HPHCs farklı bir alt kümesi biyolojik etkilerini değerlendirdi olan önceki bir çalışmada 5 üzerinde -up. In vitro sitotoksisite değerlendirmek için bizim iş akışının bir parçası olarak, başlangıçta bize sonraki HCS için uygun doz aralıkları, kurmalarına izin (RTCA) sistemi, bir empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analiz kullanılarak, 15 HPHC en bir seçim potenslerine değerlendirdi analiz (Şekil 1). Daha sonra hücresel toksisite dokuz çok parametrik son noktalar kullanılarak gerçekleştirilmiştir bir toksikolojik HCS değerlendirme, her iki zaman noktalarında (4 ve 24 saat) izlenir. Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, 7 aktivitesi, sitokrom C salınımı ve hücre membran geçirgenliği - kullanılan belirteçler mitokondriyal toksisite, DNA hasarı, stres kinaz, reaktif oksijen türlerinin (ROS), glutatyon (GSH) içeriği, kaspaz 3&#39;ün göstermekteydi. Bizim yaklaşım etkin kimlik ve doza ve zamana bağımlı örnekleme yoluyla sigara duman bileşenlerinin etkisi karakterizasyonu. Sonuç olarak, bu durum, her HPHC için bir in vitro toksikolojik profil üretilmektedir. Çok omik yaklaşımlar da daha HCS analizi tamamlamak için kullanılabilir. Bu nihayet hücre haberleşmesi ve / veya transkripsiyon seviyesinde etkileri daha derin bir anlayış sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Okuyucu</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td></td><td></td></tr> 05331625001 <tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY sayacı TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plakalar VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Çerçeve 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Kardiyo Sıcaklık Aracı</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plaka mühürleyen nefes sızdırmaz</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal İnsan Bronşiyal Epitel hücreleri (NHBE)</td> <td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>sigara içilmeyen 60 yaşında Kafkas erkek donör&nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>37 ° C'de Sıcak & Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>ReagentPack Alt Kültür Reaktifleri kiti</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>37 ° C'de ısıtın; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin (100x)</td> <td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kolay Şişe filtre kapağı 75 & nbsp; cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu tahlil plakası&nbsp; siyah&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (Uzak Kırmızı Nükleer Boyama İçin)</td><td>Biyodurum</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitokondriyal Boya: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life teknolojileri</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitokondriyal Boya: MitoTracker Kırmızı CM-H2XRos</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Boya: Dihidroetidyum</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Boya: CellROX</td><td>Life teknolojileri</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Boya: MitoSOX</td><td>Life teknolojileri</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Boya: Monoklorobiman</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toksik GSH</td></tr><tr><td>Boya: Monobromobimane</td><td>Life teknolojileri</td><td>M-1378</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Membran geçirgenlik Boyası: YO-PRO-1&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>Y3603</td><td>Tahriş edici&nbsp;</td></tr><tr><td>Membran geçirgenlik boyası: TO-PRO-1&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>T3602</td><td>Tahriş edici&nbsp;</td></tr><tr><td>Membran geçirgenlik boyası: TOTO-1&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>T3600</td><td>Tahriş edici&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaspaz Boyası: Cellevent Caspaz 3/7 yeşil</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>C10423</td><td>Tahriş edici&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Sitokrom C antikoru (Fare)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-c-Jun antikoru (Fare)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-H2AX antikoru (Fare)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG DyLight 650&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x geçirgenlik tamponu</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>%4 Formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>10x engelleme tamponu</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporin</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Valinomisin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Anizomisin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Ethacrynic asit</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>1-Aminonaftalin</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>2-Nitropropan</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Arsenik (V)</td> <td>Sigma</td><td>A6756</td><td>zehirli</td></tr><tr><td>Benzen</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Krom (VI)</td> <td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Krotonaldehit</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td></td></tr><tr><td>Toksik Metil etil keton</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Nikel&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Nitrobenzen</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Kinolin</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toksik</td></tr></tbody></table>

zararlı ve potansiyel zararlı bileşenlerinin toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik tarama analizi (hphc)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Sigara dumanı (CS), kardiyovasküler ve akciğer hastalıkları için önemli bir risk faktörüdür. CS onun genel toksisite bireysel bileşenlerin katkıları değerlendirmek için zorlu 1 7.000 &#39;den fazla kimyasal madde içeren karmaşık bir aerosol olduğu için. ABD Gıda ve İlaç tarafından tanımlanan tek tek bileşenlerin yanı sıra karışımların toksikolojik profilleri, ancak verimlilikte bir tütün dumanının zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin (HPHCs) ve profil oluşturma özelliği sağlar tarama araçları, yüksek uygulayarak, in vitro kurulabilir İdaresi (FDA). 2 Bir ilk değerlendirmenin, bir empedans tabanlı enstrüman bileşiğin toksisite gerçek zamanlı, etiket ücretsiz değerlendirme için kullanıldı. alet okuması hep birlikte hücre durumuna genel bir bakış sağlamak hücre yapışması, canlılığı ve morfolojisi dayanır. Hücre indeksi adında bir boyutsuz parametre, ölçümü için kullanılır. dif kümesiferent boyama protokolleri bir floresan görüntüleme bazlı soruşturma için geliştirilmiştir ve bir HCS platformu her HPHC tarafından ortaya sitotoksisite tür daha derinlemesine bilgi elde etmek için kullanıldı. Onlar hesaplanabilir LD 50 (&lt;20 mM) kayıtlı olarak test edilen 15 bileşenlerin, sadece beş HCS tabanlı analiz için seçilmiştir. Bu 1-aminonaphtalene, Arsenik (V), Krom (VI), Crotonaldehyde ve Fenol dahil. HCS&#39;de etkilerini esas alarak, 1-aminonaphtalene ve Fenol artan histon H2AX fosforilasyonuna dayanan genotoksik krom (VI) ile birlikte, mitokondriyal disfonksiyon indüklemek için tespit edilebilir ve. Krotonaldehit stres kinaz yolu aktivatörü gibi bir oksidatif stres indükleyici ve arsenik olarak tespit edilmiştir. Bu çalışma, empedansı bazlı ve HCS teknolojilerinin bir kombinasyonu CS bileşenlerin in vitro değerlendirilmesi için sağlam bir araç sağlar göstermektedir.

Rtca Hiçbir toksik etki tespit edildiğinde HCS bitiş noktaları bilgilendirici olmayacaktır, çünkü görünmüyor bileşiklerdir HCS (Şekil 3b, c, d, g, k, l, m tarafından test edilmez RCTA en yüksek konsantrasyon hücre canlılığı kadar azaldı p). Bileşikler gösteren sadece en yüksek konsantrasyonda hücre canlılığı azalmıştır (Şekil 3e, o) da HCS için seçimi kaldırılır. Son olarak, bir hesaplanabilir LD 50 (&lt;20 mm) tek bileşeni daha HCS analizi (Şekil 3a, f, h, j, n) seçilir. yukarıda bahsi geçen HPHCs şunlardır: 1-aminonaphtalene, Arsenik (V), krom (VI) &#39;ya, krotonaldehit&#39;in ve fenol yer alır. HCS Kalite Kontrolü (QC) gibi, pozitif kontrol fi vardırilk doğru gerçekleştirildiğini boyama işlemini sağlamak için analiz edilmiştir. Pozitif kontrol ile muamele edilmiş hücrelerin Örnek Resimlerde Şekil 6 &#39;da gösterilmiştir. Veriler değerleri, daha önce tarif edildiği gibi araca normalleştirilir. Doz-yanıt eğrileri, sadece üç doz test edilir olarak çizilir ve üç doz, her bir zaman noktasında kabul edilir değildir. uygun yanıtlar 4 saat, 24 saat, her iki her nokta için gözlenir, böylece pozitif kontrol dozlar seçilir (önceki deneylere dayanarak, veriler gösterilmemiştir). Özellikle dozlarda 1 ve 2 doz 2 ve 3 24 saat sonra etkisini değerlendirmek için kullanılır ise 4 saat sonra etkisini değerlendirmek için kullanılır. cevap yok pozitif kontrol dozları gözlenmesi halinde Tabaklar atılır. mitokondrial membran potansiyeli ve GSH içeriği dışındaki tüm uç noktalar için, sinyal yoğunluğunda bir artış beklendiğini unutmayın. Fenol hariç tüm bileşikler, bir nekrotik fenoksi neden<html> türü, artan hücre membran geçirgenliği (Şekil 7a, f, h, i) göre. 1-aminonaphtalene, krom (VI), krotonaldehid ve Fenol artan histon H2AX fosforilasyonu (Şekil 7E, j, n, p) göre genotoksik olarak tespit edilmiştir. Fenol ve 1-aminonaphtalene ciddi mitokondriyal disfonksiyon 1-aminonaphtalene ile artan bir sitokrom C salınımı (Şekil 7c) yol açtı (Şekil 7b, o) neden olduğu bulunmuştur. artan kaspaz 3/7 aktivitesinin tespiti krom maruz kaldığında apoptotik olayın kanıt sağladı. Oksidatif stres indüksiyonlu (TSH veya GSH) ayrıca 1-aminonaphtalene, krotonaldehit&#39;in ve fenol (Şekil 7d, m, q,) ile muamele edilerek tespit edildi. Transkripsiyon faktörü cJun (Şekil 7G) artmış fosforilasyon ile gösterildiği gibi son olarak, arsenik, hücre gerilimi indükler. yük / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Bileşik Tox-Profiler İş Akışı a.) Iş akışının şematik Bu çalışmada izledi. İlk olarak, bir doz oranı bulma sonra HCS bileşiği özgü toksisite profillerinin b.) Çalışma deneysel tasarım karakterize etmek için uygun dozlar seçmek için RTCA platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HCS uç noktalar 4 incelenmiş ve 24 saat dozlama sonra. Grubunda ise, 24 saat tohumlama sonrası, hücreler ilave edildi ve empedans değerleri sürekli takip eden 24 saat boyunca izlenen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Şekil 2. RTCA Pozlama Plate. Bileşik ana plakası ilk beş adım 1:10 seri seyreltme yapılarak üretilir. Her bir bileşik,(Doz 0) araç kontrolü dahil olmak üzere, daha sonra kontrol olarak orta ve staurosporin ile birlikte maruz plakasına üç kopya halinde ilave edilir. Araç kontrolleri sıra numarası 7. iken dizisi transferi üzerine korunur dozlar, en yüksek doz sıra numarası 1 unutmayın <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Şekil 3. Örnek RTCA Hücre Canlılığı Sonuçlar a.) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropan, Cı) asetamid, d) Aseton, e) akrilamid, f) Arsenik (V), g), benzen, lH) Krom (VI) j) krotonaldehid, k) metil etil keton, L) Nickel (II) &#39;, m) nitrobenzen, n) fenol, o) kinolin, s) Toluen. 24 saat sonra-dozlama, eğri (AUC) altındaki alan, 0 ila 0 aktivitesini yansıtır -100% aktivitesi (y-ekseni), aralığında ve normalize (pozitif kontrol ve araç da dahil olmak üzere), her doz için hesaplanmış araç ve pozitif kontrol -100. Değerler daha sonra çizilen ve dört parametreli bir Hill denklemine ve mümkün olduğu LD50 hesaplandı kullanılarak monte edildi. Konsantrasyonları bir günlük ölçeğinde (x-ekseni) ifade edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Şekil 4&#39;te HCS Tahliller için pozitif kontrol bileşikleri için seyreltme cetveli. Pozitif kontroller) Toplama ve ziyaretindeseri seyreltme plakası. b) pozitif kontroller seri seyreltme. c) 200X pozitif kontroller dozlar. de) orta (01:40 içinde 200x pozitif kontrol dozlarda seyreltilmesi) için hicle 5x dozları içeren pozitif kontrol plaka üretmek için. ) Her doz maruziyet plakada son düzenini yansıtmak için üç kez seyreltilmiş unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Şekil 5. HCS Pozlama Plate. Bileşik ana plakası ilk beş adımlı bir seyreltme yapılarak üretilir. araç kontrol de dahil olmak üzere her bir bileşik olup, (doz 0) daha sonra pozitif kontroller ile birlikte maruz plakasına üç kopya halinde ilave edilir. , Dozlar sipariş transferi üzerine muhafaza unutmayınAraç kontrolleri sıra numarası 7. iken yüksek doz sıra numarası 1 olan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Antikor ya da boya-boyalı hücrelerin Şekil 6. Örnek Floresan Resimler: a) Nükleer parametreler - Nükleer boya. Canlı veya sabit hücrelerde DNA bağlanan bir geçirgen bir boya. Bu leke çekirdek bölge etiketleme tek tek hücrelerin tanımlamak için kullanılır b) Nekroz - Hücre membran geçirgenliği boya. Hücre membran bütünlüğünün Boya bazlı tespiti. Reaktif hücre membranına özünde geçirimsizdir. nekroz Membran, geçirgen hale gelir ve boya hücre girer ve güçlü bir floresan s üretiminde DNA&#39;ya bağlanan. ignal c) apoptozun - Sitokrom C: sitokrom C salınımı erken apoptoz iyi bilinen bir ayar damgası antikor bazlı tespiti. Apoptoz indüksiyonu üzerine, sitokrom C mitokondri salınır ve çekirdeği D) DNA hasarına difüze - pH2AX.:. Histon H2AX fosforilasyon antikor bazlı tespiti, çift sarmal DNA kırılmalarının iyi bilinen bir özelliğidir, e) Gerilme Kinaz - cJun. Ser-73, cJun bölgesinin hücre stres iyi bilinen bir ayar damgası de fosforilasyonu antikor bazlı algılama f) Oksidatif stres - DHE: süperoksit radikallerinin Boya bazlı tespiti. . Ücretsiz GSH moleküllerinin Boya bazlı algılama: mBcl - okside formu etidyum DNA ardalanması g üzerine kırmızı fluoresces ise Dihydroethidium kendisi GSH) sitoplazmada mavi fluoresces. mBcl için GSH ile reaksiyona giren. kaspaz 3/7 aktivitesinin Boya bazlı algılama: Kaspaz 3/7 aktivasyon - yüksek floresan ürünü h) Apoptoz üretir. Reaktif DNA bağlama inhibe eden bir dört amino asit peptidi olmayan floresan. kaspaz-3/7 aktivasyonu üzerine, peptid DNA&#39;ya bağlanan ve aydınlık, florojenik tepkisi üretmek için boya sağlayan bölünmektedir. Paneller pozitif kontrol ile tedavi edilen hücreler gösterir BH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Şekil 7. Temsilcisi HCS Sonuçları. 1-aminonaphtalene (ae), Arsenik (V) (f ve g), Krom (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) ve Fenol (oq). 4 saat (mavi çizgi) ve24 saat (turuncu çizgi) sinyaller her bir doz için hesaplanmış ve araç aktivitesi (% 0) normalize edilmiştir. eğri uydurma hesaplamaları dahil değildir Değerler gri renkle gösterilir. Konsantrasyonları bir günlük ölçeğinde (x-ekseni) ifade edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tahlil </td><td> Endpoint # </td><td> biyolojik son nokta </td><td> Hücresel bölmesi </td><td> çıkış özelliği </td></tr><tr><td rowspan="4"> sitotoksisite </td><td> 1 </td><td> Mitokondriyal kütle 6 </td><td> sitoplazma </td><td> Nokta ortalama alan </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Mitokondrial membran potansiyeli 6 </td><td> sitoplazma </td><td> Nokta ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Sitokrom C bırakma <sup&gt; 7 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Hücre zarı geçirgenliği 8 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> DNA Hasarı </td><td> 5 </td><td> fosfo-H2AX 9 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> stres Kinaz </td><td> 6 </td><td> fosfo-cJun 10 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> GSH içeriği </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> sitoplazma </td><td> Nokta ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> apoptoz </td><td> 9 </td><td> Kaspaz 3 13 </td><td> sitoplazma </td><td> Nokta ortalama yoğunluk </td></tr></tbody></table> HCS a Tablo 1. listesissays ve bitiş noktaları. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> araç </td><td colspan="6" rowspan="2"> RTCA dozlar (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> HCS dozları </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Hücre canlılığı, seçilen (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 280 uM </td><td> 2.000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitro- </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> aseton </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> akrilamid </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsenik (V) </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 160 uM </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0.17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzen </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Krom (VI) </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 20 uM </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td colspan="2"> krotonaldehit </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 200 uM </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Metil etil keton </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt;20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nikel </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzen </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Fenol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 2.300 uM </td><td> 5000 </td><td> 2.000 </td><td> 1000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> kinolin </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> tolüen </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Tedavi 24 saat sonra Bağıl LD 50 ile test edilmiştir HPHC Bileşiklerin listesi. HCS analizi için seçilen bileşikler turuncu vurgulanır ve test dozları da verilmiştir. 3R4F doz referans sigara 3R4F itibaren bir sopa duman oluşturucu miktarına eşdeğerdir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tahlil </td><td> bileşik </td><td> Ana çözelti </td><td> çözücü </td&gt; <td colspan="3"> Doz (ler) (uM) </td></tr><tr><td> Hücre canlılığı </td><td> staurosporin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> sitotoksisite </td><td> Valinomycin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DNA Hasarı </td><td> parakuat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> stres Kinaz </td><td> Anisomycin </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> rotenone </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> GSH içeriği </td><td> etakrinik asit </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> apoptoz </td><td> staurosporin </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Her Testi için kullanılır Olumlu Kontroller ve Konsantrasyonlarına Tablo 3. listesi.

Çalışmanın amacı, empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizörü ve in vitro toksikolojik değerlendirme için yüksek içerikli tarama (HCS) tabanlı bir platformun bir kombinasyonunu kullanarak 15 sigara dumanı bileşeninin biyolojik etkisini değerlendirmekti. Bu çalışma, test edilen bileşiklerin etkili dozları, toksisitesi ve etki şekilleri hakkında bilgi sağlar.

Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizörü ile Yüksek İçerikli Tarama Tabanlı Platformu birleştiren bu yaklaşımın genel amacı, test edilen bileşiklerin Tokin Profilini elde etmek için etkili dozlar, toksisite ve biyolojik etkiler hakkında bilgi sağlamaktır. Bu yaklaşım, Toksikoloji alanındaki anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, sitotoksisite, genotoksisite ve hücresel stres tepkilerinin ele alınması.Ayrıca, aynı anda birden fazla biyokimyasal ve morfolojik parametre hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda farklı hücre tiplerine ve hücre kültürü modellerine de uygulanabilir. Yargı yetkisi ve sınırlama nedeniyle, tüm yaklaşım yalnızca kısa bir bileşik parçası değerlendirilirken gerçekleştirilecektir. Aynı nedenle, Yüksek İçerik Tarama Değerlendirmesini göstermek için yalnızca bir protokol gösterilecektir.Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan teknisyenler Stefano Acali ve Alexander Laurent olacak. Normal insan bronşiyal epitel hücrelerini veya NHBE hücrelerini görmek için, aleti empedans ölçümlerinin sayısını ve süresini tanımlayacak şekilde programlayın. Bu çalışmada, veriler 48 saat boyunca her 15 dakikada bir kaydedilmektedir.96 oyuklu bir RTCA plakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam pipetleyerek plaka arka planını ölçün. Bu adım, cihazın hücre tabanlı hesaplamalar için temel referans olarak kullanılacak orta elektrik direncini hesaplaması için teknik bir gereksinimi temsil eder. Daha sonra, RTCA plakasının her bir oyuğunda bulunan ortama mililitre başına 144.000 hücre konsantrasyonunda 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.Hücre ısındıktan sonra, hücrelerin bağlanmasını ve homojen hücre dağılımı elde etmesini sağlamak için plakayı 40 dakika oda sıcaklığında bırakmak çok önemlidir. RTCA plakalarını inkübatördeki yuvada inkübe edin ve dozlamadan önceki 24, artı veya eksi iki saat boyunca verileri kaydetmeye başlayın. Pozitif kontrol için, 10 milimolar staurosporin stok çözeltisini DMSO'da bir ila 10 arasında seyreltin.5x çalışma çözeltisi elde etmek için 195 mikrolitre ortama beş mikrolitre seyreltme ekleyin. Zararlı ve potansiyel olarak zararlı bileşenler için, tek bir molar stok çözeltisi oluşturmak üzere her birini araçta çözün. Ardından, 100 milimolar bir çözelti oluşturmak için her bir test maddesi stok çözeltisini bir ila 10 arasında orta derecede seyreltin.Önce B'den F'ye kadar olan kuyucuklara orta artı% 10 araç ekleyerek ve 100 milimolar çözeltiyi A kuyusuna ekleyerek bileşik ana plakayı oluşturun. 5x çalışma çözeltisini elde etmek için beş adımlı, bir ila 10, seri seyreltme gerçekleştirin. Dozlama için, RTCA cihazını duraklatın, maruz kalma plakasını çıkarmak için kızağı açın ve empedans ölçümünü etkileyebilecek hücrelerin soğumasını önlemek için plakayı RTCA sıcaklık aletine yerleştirin. Bileşik ana plakadan hücrelere 25 mikrolitre 5x çözelti ekleyin, Bileşik ana plakadakiyle aynı dozlama sırasını koruyun.Mevcut hücre kültürü ortamını çıkarmayın. Ardından, mevcut kültür ortamını çıkarmadan alt sıranın sağ yarısındaki hücrelere 25 mikrolitre 5x Pozitif kontrol solüsyonu ekleyin. Benzer şekilde, alt sıranın sol yarısındaki hücrelere 25 mikrolitre ortam ekleyin.Plakayı plaka kapatıcı ile kapattıktan sonra, plakayı RTCA kızağına geri yerleştirin ve kilitleyin. İstenen pozlama süresi için veri kaydını yeniden başlatın. Veri kaydının ardından, HCS analizinde hangi test maddesinin kullanılacağını belirlemek için RTCA hücre canlılık verilerini analiz edin.Bu deneyde, HCS analizi için 1-aminonaftalen, Arsenik, Krom ve Krotonaldehit seçilmiştir. NHBE hücrelerini görmek için, 96 oyuklu bir siyah plakanın her bir oyuğuna mililitre başına 120.000 hücrede 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. HCS plakasını 30 dakika oda sıcaklığında bıraktıktan sonra, hücrelerin kuyucuklara yapışmasına izin vermek için, dozlamadan önce 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 24, artı veya eksi iki saat inkübe edin.Pozitif kontrol için, ikinci sütundaki her pozitif kontrolün stok çözeltisinden 40 mikrolitre dağıtın. Ardından, aracın 20 mikrolitresini üçüncü ve beşinci sütunlara dağıtın. Ve dördüncü sütunda aracın 40 mikrolitresi.İkinci sütundaki kuyucuklardan 12 mikrolitre çekin, üçüncü sütundaki kuyucuklara dağıtın ve karıştırın. Üç doz ile son bir seri seyreltme ve her pozitif kontrol bileşiği için araç elde edilene kadar devam edin. Pozitif kontrol plakasını oluşturmak için, üç dozun ve aracın ortamında bir ila 40 seyreltme hazırlayın.Bileşik ana plakayı yapmak için, 100 milimolar konsantrasyon için her bir test maddesi stok çözeltisini, bir ila 10 orta boy olacak şekilde yeniden askıya alın ve seyreltin. Her test maddesi için seçilen 10x dozu elde etmek için% 5 araç ile ortam kullanarak seyreltmeler gerçekleştirin. Hem pozitif kontroller hem de bileşik plaka artık maruz kalma plakası üzerine dozlanmaya hazırdır.Daha sonra, Bileşik ana plakadaki ile aynı dozlama sırasını koruyarak, Bileşik ana plakadan hücrelere üç kopya halinde 25 mikrolitre 5x çözelti ekleyin. Mevcut hücre kültürü ortamını çıkarmayın. Ardından, Pozitif kontrol plakasındaki ile aynı dozlama sırasını koruyarak, Pozitif kontrol plakasından alt sıradaki hücrelere 25 mikrolitre 5x solüsyon ekleyin.Metin protokolünde açıklandığı gibi yeterli miktarda canlı hücre boyama çözeltisi hazırlayın. Ardından, satıcının talimatlarına göre hem mitokondri boyasını hem de zar geçirgenlik boyasını canlı hücre boyama çözeltisinde seyreltin. Sitotoksisite Testi olarak adlandırılan plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre canlı hücre boyama çözeltisi ekleyin.Hücre kültürü ortamını çıkarmayın ve 37 santigrat derece,% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin. Ortamı ve boyama solüsyonunu nazikçe aspire edin ve her birine 100 mikrolitre Fiksasyon Solüsyonu ekleyin. Ardından, plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.İnkübasyondan sonra, Fiksasyon Solüsyonunu nazikçe aspire edin ve yıkama tamponu kuyusu başına 100 mikrolitre ile bir kez yıkayın. Yıkama tamponunu çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmeden önce her bir oyuğa 1x geçirgenlik tamponu başına 100 mikrolitre ekleyin. Geçirgenlik tamponunu aspire edin ve plakayı kuyucuk başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.Ardından, yıkama tamponunu aspire edin ve her bir kuyucuğa 100 mikrolitre 1x Engelleme tamponu ekleyin. Daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Anti-Sitokrom C Antikorunu, bir ila 250 arasında Primer Antikor Çözeltisi içinde seyreltin.Daha sonra, Bloke Edici tamponu aspire edin ve karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika inkübe etmeden önce her bir oyuğa oyuk başına 50 mikrolitre Birincil Antikor Çözeltisi ekleyin. Anti-Fare Antikorunu, İkincil Antikor ve Nükleer Çözelti içinde bir ila 500 arasında seyreltin. Ayrıca, nükleer boyayı İkincil Antikor ve Nükleer Çözelti içinde bir ila 1.000 oranında seyreltin.Birincil Antikor Çözeltisini aspire ettikten sonra, plaka yıkayıcıyı kullanarak plakayı kuyu başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkama tamponunu aspire edin ve plakanın her bir oyuğuna oyuk başına 50 mikrolitre İkincil Antikor ve Nükleer Çözelti ekleyin. Şimdi, plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.İkincil Antikor ve Nükleer Çözeltinin aspirasyonunu takiben, plaka yıkayıcıyı kullanarak plakayı oyuk başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından, kuyucuk başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Plaka artık HCS cihazında değerlendirilmeye hazırdır ve satın alma işlemine başlanır.Test maddesi tedavisinin temsili RTCA hücre canlılığı sonuçları gösterilmiştir. Sadece 1-aminonaftalen, Arsenik, Krom ve Krotonaldehit ile 24 saatlik maruziyetten sonra toksik doza bağlı bir etki elde edilir, çünkü hepsi 20 milimolar'dan daha az hesaplanmış bir LD50 göstermiştir. Diğer bileşiklerle toksik etki elde edilmemiştir.Burada gösterilen, sadece 1-aminonaftalen tedavisi için temsili HCS sonuçlarıdır. 1-aminonaftalanın toksik etkisi, hücre zarında ciddi bir hasara neden olur, bu da dört saatlik maruziyetten sonra doza bağlı bir şekilde hücre zarı geçirgenliğinin artmasına neden olur. Bileşik aynı zamanda mitokondriyi de etkiliyor ve dört saatlik maruziyetten sonra kütle artışına neden oluyor ve daha sonra dört ve 24 saatlik maruziyetten sonra çekirdeklerde tespit edilebilen Sitokrom C salınımına neden oluyor.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki ila üç gün içinde uygulanabilir, çünkü çoğu ayar ve dozlama için günde yaklaşık bir saat uygulamalı zaman gerektirir. Seçilen protokole bağlı olarak, Yüksek İçerik Taraması, tüm boyama prosedürünün yürütülmesi için maksimum üç ve 1/2 saat gerektirir. Bu yordamı denerken, daha geniş bir uç nokta aralığının seçilmesinin iş akışına karmaşıklık katmasına rağmen, süreyi önemli ölçüde artırmayacağını unutmayın.Optimum bir iş akışı ile aslında birkaç plaka paralel olarak değerlendirilebilir. Tam otomatik hücre ayarı, bileşik seyreltme, dozlama ve boyama ve yeni son noktanın eklenmesi dahil olmak üzere Yüksek İçerikli Tarama Platformunun sürekli gelişimi, toksikolojik profilleme için güçlü bir araç olarak Yüksek İçerikli Tarama Platformunun kapasitesini daha da genişletecektir. Ayrıca, bu kadar yüksek verimde çoklu, tek toksikolojik uç noktaların kombinasyonu, hayvanlarda kimyasal testleri azaltma çabamızda bizi bir adım daha ileri götürecektir.

high-content-screening-analysis-to-evaluate-toxicological-effects

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz yüksek içerik görüntüleme ile otomatik hücre kültür birleştirerek yüksek verimli bir şekilde, çoklu hücresel süreçleri ve yapıları görselleştirmek ve ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu yöntemler daha fonksiyonel ek açıklama genomların yardım yanı sıra hastalık gen ağları ve potansiyel ilaç hedefleri belirleyebilir.

Nörodejeneratif Hastalıklar Yüksek İçerik Tarama

protokoller, insan embriyonik kök hücreleri ve transcriptome çalışmalarına dayalı iki in vitro gelişimsel toksisite test sistemleri (UKK ve UKN1) açıklar. test sistemleri, insan gelişimsel toksisite tehlike tahmin ve hayvan çalışmaları, maliyet ve kimyasal güvenlik testi için gerekli süreyi azaltmak için katkıda bulunabilir.

Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

3Rs prensibi içinde görüş-in seçimli-e doğru hayvan çalışmaları olarak solunum modelleri gelişmektedir. Özellikle solunum maddelerin risk değerlendirmesi için uygun deneyleri eksikliği vardır. Burada, biz insan hassas kesim akciğer dilimleri hava maddelerin değerlendirilmesi için nasıl kullanılacağını açıklar.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Yüksek işlem hacmi küçük inhibitör RNA tarama daha hızlı moleküler mekanizmalar kimyasal kornea epitel yaralanma aydınlatmak için yardımcı olabilecek önemli bir araçtır. Burada, biz geliştirme ve pozlama modelleri ve kornea epitel yaralanma hidrojen florür ve polis indüklenen yüksek aktarım tarama yöntemlerini doğrulama mevcut.

Yüksek işlem hacmi SiRNA tarama için polis ve hidrojen florür kaynaklı kornea epitel hücre hasarı

Burada, kütle spektrometresi tarafından bir protokol sıralı hedeflenen miktar ve sigara hedefli çözümleme fluor bileşikleri su mevcut. Bu metodoloji bilinen fluorochemical bileşikler nicel düzeyleri sağlar ve onların bereket yarı kantitatif tahminler ile ilgili örnekleri bilinmeyen kimyasallar tanımlar.

Ücret belirlenmesi- ve Polyfluorinated kimyasal türler ile kombine hedef ve hedef tarama olmayan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi iş akışı

Bu protokol, terapötik bir anti-HER-2 antikoru varlığında doğal öldürücü hücre aracılı meme kanseri hücresi öldürmeyi modüle eden bileşikleri tanımlamak için otomatik, görüntü tabanlı yüksek verimli bir teknik sunar.

Antikor Bağımlı Hücresel Sitotoksisiteyi Modifiye Eden Bileşiklerin Tanımlanması için Yüksek İçerikli Tarama Testi

Bu iki dilli protokol, Polo benzeri Kinazlar 1'den 3'e (PLK1–3) ve veritabanı kaynaklı doğal moleküllerin Emilim, Dağılım, Metabolizma, Salgılama, Toksisite ve Stabilite (ADMET-S) özelliklerini değerlendiren hesaplamalı ilaç keşif iş akışı sağlar.

Amerikan İşaret Dili ve İngilizce'de Potansiyel PLK1 Inhibitörlerini Tanımlamak İçin İki Dilli Hesaplamalı İş Akışı

Burada, çok aşamalı kütle spektrometrisi ağaçlarını Huoxiang Zhengqi ağız sıvısına dayalı bir parçalanma süreciyle birleştiren standart bir protokolü gösteriyoruz.

Huoxiang Zhengqi Ağız Sıvısında Bilinmeyen Bir Bileşiğin Yapısal Analizi için Doğrusal İyon Kapanı Kütle Spektrometrisine Dayalı Teknik Yaklaşım

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

DsDNA ölçümü Moleküler Problar PicoGreen boya ve bir mikroplak okuyucu aksesuar ile donatılmış Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre kullanılarak gösterilmesi.

Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Öğrenin, sigara dumanı bileşenlerinin toksisitesini değerlendirmek için empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizi ve yüksek içerik tarama yöntemlerini kullanmayı. Bu yaklaşım, sitotoksisite ve hücresel stres yanıtlarını inceleyerek toksikolojik profiller oluşturur.

Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC) (Video) | JoVE Journal

Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC)

Daha fazla video keşfet