Name: In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Keşfedin canlı hayvanlarda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesini Drosophila melanogaster kullanarak nasıl izleyeceğinizi. CaspaseTracker biyosensörü sağlıklı hücrelerdeki kaspaz rollerini anlamak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Şekil Drosophila çizimler için Polan Santos ve Darren Obbard teşekkür ederiz. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena JHMRI insectary kullanımı için. Bu çalışma Hayat Bilim Araştırma Vakfı bursu (HLT) tarafından desteklenmiştir, Üniversite Ödenekler Komitesi Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) ve NIH NS096677, NS037402 ve NS083373 (JMH) verir. Ho Lam Tang Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Shurl ve Kay Curci Vakfı üyesidir.

CaspaseTracker Sineklerin hazırlanması 1. <ol><li> Bu haç gerçekleştirmek, CaspaseTracker (DQVD) hazırlamak deneyler için uçar için: 7-10 bakire kadın aktarılması (ya da erkek) tarafından, UBI-CaspaseTracker G-İZ (Ubi&gt; Dur&gt; GFP-nls;; UAS-FLP UAS-RFP) x kaspaz biyosensör substrat mCD8-DIAP1-Gal4 taşıyan erkek (ya da kadın) aynı sayıda ubikutin destekleyicisi 35 araya tarafından G- homozigot kombinasyonu ölümcül önlemek için ikinci kromozom CYO dengeleyici olan G-İZ sinekler, tahrik sinekler İZ (UAS-RFP, UAS-FLP ve Ubi&gt; Dur&gt; GFP-nls) 34. Bir yerde bir protein kaynağı olarak taze maya macun ile bir taze gıda flakon uçar. </li><li> 5 ila 7 gün (en fazla 2 hafta) 18 ° C&#39;de dosyaları inkübe ve sonra da üst yeni döl ile aşırı kalabalık önlemek için, ve yeni ıslah şişeleri kurmak için tüpten uçar kaldırın. </li><li> döl Eclose uçar kadar 18 ° C&#39;de inkübasyon devam edin. olmayan CYO seçin [non-cCaspaseTracker ve G-TRACE elemanları 35 için transgenik olan CaspaseTracker doğru genotip, bir urly kanat] döl. </li><li> Aynı zamanda, belirli CaspaseTracker RFP ve GFP floresan doğrulamak için kontrol ebeveyn transgenik olmayan w118 sinekler ve kaspaz-duyarsız (DQVA) paralel sinekler oluşturmak. </li><li> primerler kullanılarak CaspaseTracker dosya teyit etmek için PCR genotipleme gerçekleştirmek: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA bir 3,897 bp ürünü üretir. G-İz lokusların genotipleme için GFP (474 ​​bp) için aşağıdaki primerler kullanın, 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; RFP (258 bp) için, 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; ve Flpase (655 bp), 5&#39;-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG için 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. pUWR vektörü olarak genotiplendirme Gal4 (554 bp), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT için CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Doku Hazırlama, Boyama ve Montaj <ol><li> Uçucu disseksiyonlar için, su içinde eritildi,% 1 sığır serum albümini ile plastik pipet uçları ve santrifüj tüpleri, kaplama uçları ve borular (BSA) yapışmasını kesilerek dokuların engeller. </li><li> Teşrih forseps kullanarak bir silikon yastık üzerinde uçar. <ol><li> doku diseksiyonu yaparken sert bir yüzeye forseps ipuçları zarar görmesini önlemek için, bir silikon yüzey üzerinde diseksiyon. Silikon diseksiyon plakaları yapmak için, üreticinin talimatlarına (Malzeme Listesi) göre ticari kit silikon eritebilir. silikon erime sonra, 60 mm çapında bir doku kültürü çanağı 3 ila 4 mL ekleyin. Silikon yemekleri yeniden kullanılabilir. </li><li> CO2 ile bir sinek anestezisi, ve soğuk 1 mL PBS ile bir silikon plaka aktarın. Bir blowgun kullanarak anında ihtiva eden bir şişeye CO2 giriş, ve daha sonra anestezi uçucu t aktarmakCO 2 kaynağı vardır oa Pad. </li><li> Baş ve foregut arasındaki bağlantıyı zarar vermeden vücudu örten uçucu kafasını kesmek için ters yönde toraks çekmek için sinek kafa tutmak için forseps bir çift ve forseps ikinci bir çift kullanın. </li><li> toraks kanatlarını ve bacaklarını kaldırmak için forseps 2 çift kullanın. </li><li> toraks tutmak için forseps bir çift kullanın ve forseps başka çift foregut ve midgut arasındaki bağlantıyı zarar vermeden tekrar toraks ayırmak için karın çekin. </li><li> Daha önce gösterildiği gibi, beynin, gut, Malpighi tüplerinin ve yumurtalıkların da dahil olmak üzere iç organlarını teşrih. 39-41 </li><li> Bu dokular, güçlü otofloresans üretmek olarak forseps ile manikür tüm parçaları ve yağ organları çıkarın. Sabır ve pratik gösterildiği gibi tam bir organ sistemini hazırlamaları gerekmektedir. </li></ol></li><li> 1.5 ml santrifüj tüplerine disseke dokuların aktarın ve dokular wi düzeltmek20 karanlıkta rotasyonu ile 30 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehit 0.5 mL (fosfat-tamponlu tuzlu su) inci dokularda ağartıcı RFP ve GFP&#39;yi önlemek için. sonraki boyama sonuçları tehlikeye düşürebilecek uzun süreli fiksasyon kaçının. </li><li> yumuşak bir pipetleme paraformaldehid çıkartın ve oda sıcaklığında, 0.5 mL PBST (PBS +% 0.1 Triton X-100) ile 3 kez yıkanır. </li><li> hafifçe çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C&#39;de 0.5 mL PBST ile dokuların geçirgenliği. Kısa inkubasyon eksik permeabilization ve uzlaşma boyama sonuçlara neden olabilir. <ol><li> Bu arka plan boyama azaltmak için gerekli ise, yerine PBS,% 1 BSA ile 0.5 mL PBST dokuları inkübe düşünün. </li></ol></li><li> 0.5 mL PBST ile dokular 3 kere yıkayın. </li><li> , Çekirdek ve filamentli aktin (F-aktin) leke / ml Hoechst 33342 mavi çekirdek boyası ve 0.3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-aktin boya ile boyanırken 10 ug, 0.5 mL PBST uygulamak ve oda sıcaklığında 1 saat w doku ile eş zamanlı olarak kuluçkalanmasıKaranlıkta Ith nazik dönme. Bu arka plan artacak olarak uzun süreli boyama kaçının. <ol><li> immün için, dokuya sabit ve geçirgen inkübe% 0.1 Triton X-100, 0.5 ml PBS içinde bir gece boyunca 4 ° C, 1 lekeye: Anti-ELAV antikorun veya 1 100 seyreltme: Anti-kaspaz-3 200 seyreltme gece boyunca 4 ° C (300 uL). 100 ve oda sıcaklığında 1 ila 3 saat süre ile inkübe: 1 seyreltilmiştir karşılık gelen ikincil antikor devam edin. Belirli antikor bilgi için Malzeme Listesi bakın. </li></ol></li><li> yavaşça döndürülerek 0.5 mL PBST 5 dakika boyunca dokular 3 defa, her bir yıkama. </li><li> Bir pipet ile, tüm PBST kaldırın ve sonra tamamen gece boyunca oda sıcaklığında 1-3 saat ya da 4 ° C için dokular kapsayacak şekilde (malzeme bakınız) 200 uL, anti-ağartıcı montaj ajanı ekleyin. Tam montaj ajan absorbe Optimal dokular tüpün dibine batar. </li><li> Ön temizlemek, su ya da% 70 etanol ile cam slayt ve glas ajan montaj dokuları transferis slayt. </li><li> Dikkatle dokular üzerinde bir cam kapak kayma yerleştirin. cam slayt ve overcompression dokuyu tahrip önlemek için kapak kayma vazelin uygulayın. kağıt mendil ile ekstra montaj ajan çıkarın. </li><li> dokulardan maddeleri montaj sızıntısını önlemek için tüm kapak kayma kenarları boyunca oje uygulayarak kapak kayma mühür. </li></ol> 3. Konfokal Mikroskop <ol><li> ters konfokal epi-floresan mikroskop kullanarak. Bununla birlikte, yukarı doğru mikroskoplar da kullanılabilir. döşeme kullanarak görüntü dokulara nedeniyle bileşenlerin ısıl genleşme ve daralma nedeniyle odaklanma ve xy düzleminin kayması sürüklenme önlemek için kararlı oda sıcaklığını korumak. Çevresel kontrol sistemleri ve odak kayması ücret sistemleri nedeniyle mikroskop sistemi termo-denge kaybına, bu sorunu önlemek için yardımcı olur. </li><li> mikroskop sahnede slayt yerleştirin. Düşük çözünürlük kullanarak birkaç test görüntüleri çekmek (125 x 125 piksel) birFaiz (ROI) tüm bölgeyi kapsayacak şekilde gerekli karoların uygun sayısını belirlemek d. </li><li> tarama çözünürlüğü gibi 500 x 500 piksel ile görüntü yakalamak için mikroskop tarama sistemini ayarlayın. görüntüleri (çini) her her tarafta% 20 örtüşür ki, böyle bir 20X NA 0.8 veya cam lamelleri ile dokuları analiz etmek için bir 63X NA 1.4 Plan-Apochromat hedef olarak hedef seçin. </li><li> uzun dalga boyu ışık düşük foto-ağartma neden olarak, uyarma dalga boylarını kısaya uzun görüntü dizisi ayarlayın. dalgaboyu kısaya uzun sekansı şöyledir: (i) Phalloidin F-aktin ve aktive kaspazlara karşı antikorları saptamak için 633 nm, RFP (ii) 561 nm, GFP (iii) 488 nm, ve (iv) 405 nm için Hoechst nükleer leke. </li><li> görüntüleme sırasında, dokuların yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için lazer yoğunluğu azaltarak foto-ağartma önlemek için işlemi görüntüleme sırasında floresan lazer uyarma hücrelerin maruziyeti en aza indirmek. </li><li> i sonramages mikroskop yazılımını kullanarak görüntüleri birleştirmek, toplanır. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada sağlıklı dokularda yaygın bazal kaspaz aktivitesinin saptanmasını kolaylaştırmak CaspaseTracker inşaat ve iç işleyişini göstermektedir. In vivo olmayan apoptotik kaspaz aktivitesini tespit etmek için kritik adımlar şunlardır: 1) 2) uygun kontroller ile kaspaz-özel raportör fonksiyonu doğrulayarak, 3) diseksiyon tekniklerini uygulayarak yetişkin Drosophila tüm iç organ sistemlerini gözlemlemek, biyosensör transgen ile sinekleri üreten, autofluorescent eserler gelen ve 4) ayırt edici biyosensör et...

Kaspazlar önemli aspartat kalıntısı sonra uzun hücre içi proteinleri bölünmesiyle apoptotik hücre ölümüne aracılık sistein proteazlardır. Örneğin, başlatıcı kaspaz efektör Kaspaz, baskılanmasını durdurmak DNA nükleazlar, bölen iskelet parçaları etkinleştirmek ve hücreleri hızla demontaj ve hücre cesetlerin imha komşu hücreler tarafından kendi tanıma ve yutulmasına uyarmak için hücre zarlarının lipit kompozisyonunu değiştirmek. 1-4 tahmin edilmektedir hücrelerin milyarlarca insan vücudunda günde ölür, ve apoptoz kemoterapi kaynaklı tümör hücre ölümünün önemli bir mekanizması olduğunu. 5 caspases farklı bir dizi doğal bağışıklığı uyarmak için farklı olmayan apoptotik süreçler tarafından hücre ölümüne neden olabilir. 6 bu nedenle, kaspaslara çoğu araştırma yanlısı ölüm fonksiyonları üzerine yoğunlaşmıştır. İlginç bir şekilde, alanda dair kanıtlar teşvik hücre ölümünden sorumlu olan kaspaz non ölüm f olduğunu ortayaonksiyonlar ı. Öncü çalışmalar kaspazlar embriyojenez esnasında hücre çoğalması ve göçünün düzenlenmesinde dahil olmak üzere sağlıklı hücrelerde çeşitli hücresel fonksiyonları yer aldığını göstermiştir. 7-9 Kaspazlar alternatif necroptotic hücre ölüm yolunu bloke etmek için, Drosophila 10,11 spermatid Kişiselleştirme için gereklidir farelerde 12,13 ve mikroRNA işleme C. elegans. 14,15 belki de en uzun ömürlü hücreler, nöronlar, kaspaz ve diğer apoptotik makine sinaptik sonlar budama yoluyla nöronal aktivitenin düzenlenmesinde rol olan, inanılan bir süreç öğrenme ve hafıza için diğer sinaps güçlendirmek için önemli olduğu. 16- 18 kaspazlar bütün hücre ölümü olmadan minik nöronal projeksiyonları mini apoptoz bir türüne göre sinaptik budama kolaylaştırmak mümkündür. 19 Bununla birlikte, kaspaz apoptoz gibi olaylara ilgisiz alternatif işlevlere sahip olabilir. 20,21 Çift rolüyaşam ve ölüm s caspases özgü değildir; Kanıtlanmış olmasa da BCL-2 ailesi proteinleri ve sitokrom-c sağlıklı hücrelerde hücresel enerji endüstrisinde rol var ama aynı zamanda hücre stres birçok türleri tarafından aktive edilir çekirdek apoptotik yolun bir parçasıdır. 22-25, evrim gün bağlantılı olduğu mantıklı görünüyor uygun olmayan veya istenmeyen hücrelerin zamanında eleme sağlamak için aynı moleküllerden içinde ölüm işlere -iş. Şu anda, apoptotik olmayan kaspaz etkinliğinin moleküler mekanizmalar anlaşılmamıştır ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesi bulunması da bilinmemektedir. Büyük bir meydan okuma caspases ölüm işlerden gün işleri ayırmada zorluk olduğunu. kaspaz aktivitesi bir proteolitik akışı ile amplifiye edilir apoptoz ve pyroptosis, aksine, kaspaz günlük iş mevcut olan birçok techn göre büyük olasılıkla algılanan değer altına enzimatik aktivite çok daha düşük seviyelerde olması beklenmektedirologies. Burada sunulan çalışma öncesinde, diğerleri farklı amaçlar için kaspaz biyosensörler çeşitli geliştirdi. SCAT biyosensörler (örneğin, ECFP-DEVD-Venüs) hızla FRET kullanarak kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında gerçek zamanlı kaspaz aktivitesini algılar. 26,27 kaspaz bölünme üzerine, Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nükleer hedefli GFP kısmı nucGFP) plazma membran bağlama caspase&#39;lar tarafından yarılır dakika içinde hücre içi yerini değiştirmesi geçirmektedir. 28 Benzer şekilde, ApoAlert-pCaspase3 Sensör (NES-DEVD-YFP NLS) kaspaz yarılma üzerine çekirdeğe sitosolden relocalizes. 29,30 fazlası son zamanlarda, iCasper içinde kromofor akıllıca Drosophila embriyo nöronların gerçek zamanlı olarak biyosensör etkinliğinin bulgulanması izin kaspaz parçalanabilen, ancak öncelikle gelişimsel hücre ölümü ile ilişkili olarak kaldığında parlayan şekilde işleme sokuldu. koku nöronların 31 Kaspaz bağımlı ölüm olduğu yaşlanma sırasında demonstGBM biyosensörler (örneğin, bunun ardından mCD8-PARP Venüs) kaspaz-klivaj formunun immüno-algılama derecelendiren. 32,33 Önemli olarak, kaspaz-3 aktive edilmiş şekli dikenler duyarlı immunostain hücre ölümünün kaybolması saptandı kültürlü nöronlar ve soma nükleer CellEvent raportör boyanın kaspaz-bağımlı floresan kullanılarak, ancak hücre ölümü omurga eleme sonrasına kadar ertelendi olmasına rağmen zorluklar nedeniyle foto-toksisite rastlanmıştır içinde. 19 Böylece, yeni kaspaz biyosensörler algılamak için gerekli olan ve in vivo bazal kaspaz aktivitesi ile hücreleri izlemek. Bu zorlukları aşmak için, biz CaspaseTracker belirlenen yeni çift renkli kaspaz biyosensör, oluşturulan. Bu strateji kalıcı etiket ve in vivo hücreleri izlemek için Drosophila G-İZ FRT rekombinaz sistemi 34 ile Drosophila kaspaz-duyarlı Apoliner biyosensör 28 değiştirilmiş bir sürümü birleştirir. &lt;sup&gt; 35 Gal4 aktive G-TRACE sistemi. caspases çok düşük seviyelerde hiç kaspaz aktivitesini yaşadı herhangi bir hücrede sitoplazma ve kalıcı bir nükleer hedefli GFP ifade RFP ifade sonuçlanan CaspaseTracker etkinleştirmek için izin verir 35 Bu sistem etiketleyebilirsiniz Drosophila melanogaster, kaspaz ve hücre ölümü çalışma için izlenebilir ve yaygın olarak kullanılan bir model sistemi kullanarak tüm hayvanlarda ömrü boyunca hücreleri. 36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4">Sarf Malzemeleri ve Reaktifler</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vektör Ürünleri</td><td>H-1000</td><td>Montaj ortamı</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont cımbız biyoloji sınıfı, paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>Asılı Damla Slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Cam slaytlar</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Moleküler Problar</td><td>H1399</td><td>DNA lekesi</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Moleküler Problar</td><td>A22284</td><td>Aktin boyası</td></tr><tr><td>Sıçan-Elav-7E8A10 anti-elav antikoru</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)</td><td>Antikor Kayıt Kimliği:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Drosophla pan-neuronal ELAV için leke</td></tr><tr><td>Bölünmüş kaspaz-3 (Asp175) antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td> <td># 9661</td><td>Kaspaz-3'ün aktif parçası için leke</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reaktifi</td><td>Floroforları korumak için</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P36934</td>;</tr><tr><td>Floroforları korumak için</td> <td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td>&nbsp;</tr><tr><td>SylGard 182 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Ürün kodu:</td><td>diseksiyon plakaları</td></tr><tr> için 0001023934<td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>LSM780 konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila diseksiyon</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optik Çift Deveboynu Mikroskop Aydınlatıcı, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Işık kaynağı</td></tr></tbody></table>

in vivo biyosensör drosophila olmayan apoptotik kaspaz aktivite tracks

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Kapazlar, proteolitik aktiviteleri yoluyla apoptotik hücre ölümünün anahtar aracılarıdır. Kaspazlar hücrelerde mevcut teknolojiler tarafından tespit edilebilen seviyelere aktive edildiğinde, apoptozun genellikle kısa bir süre sonra meydana geldiği varsayılır. Kaspazlar, birkaç dakika içinde hızlı ve tam hücre yıkımına neden olmak için birçok fonksiyonel ve yapısal bileşeni parçalayabilir. Bununla birlikte, biriken kanıtlar, normal sağlıklı hücrelerde aynı kaspazların, muhtemelen daha düşük enzimatik seviyelerde başka işlevlere sahip olduğunu göstermektedir. Apoptotik olmayan kaspaz aktivitesi ile ilgili çalışmalar, düşük kaspaz aktivitesi seviyelerinin tespit edilmesindeki zorluklar ve in vivo olarak nihai hücre kaderinin izlenmesi ile ilgili zorluklar nedeniyle engellenmiştir. Burada, bütün hayvanlarda kaspaz aktivitesi yaşamış hücreleri kalıcı olarak etiketleyen ultra hassas bir kaspaz raportörü olan CaspaseTracker'ın kullanımını gösteriyoruz. Drosophila melanogaster için bu in vivo çift renkli CaspaseTracker biyosensörü, yakın zamanda veya devam eden kaspaz aktivitesini belirtmek için kırmızı floresan proteini (RFP) geçici olarak eksprese eder ve geçmişte herhangi bir zamanda kaspaz aktivitesi yaşamış ancak ölmemiş hücrelerde yeşil floresan proteini (GFP) kalıcı olarak eksprese eder. Daha da önemlisi, bu kaspaza bağımlı in vivo biyosensör, yetişkin sinek boyunca organ sistemlerinin dokularında apoptotik olmayan kaspaz aktivitesinin varlığını kolayca ortaya koymaktadır. Bu, beyin, bağırsak, malpighian tübülleri, kardiya, yumurtalık kanalları ve diğer dokulardaki sağlıklı hücrelerde biyosensör aktivitesini tespit etmek için tek tek sineklerin tüm montaj diseksiyonları kullanılarak gösterilmiştir. CaspaseTracker, kaspaz aktivasyonundan en az 10 gün sonra yetişkin nöronlarda ve diğer dokularda biyosensör aktivitesi tespit edildiğinden, uzun ömürlü hücrelerde apoptotik olmayan kaspaz aktivitesini tespit eder. Bu biyosensör, canlı hayvanlarda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesinin rollerini ve moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak için önemli bir araç görevi görür.

CaspaseTracker normal sağlıklı hücreleri (Şekil 1a) kaspaz aktivitesini algılamasına izin iki önemli bileşeni vardır. Bunlardan ilki, kaspaz biyosensör Apoliner (Şekil 1b) örnek alınarak 146 amino asit kaspaz-bölünebilir polipeptiddir. Bu polipeptid tipik olarak apoptoz sırasında bölünen tek bir doğal olarak oluşan kaspaz bölgesi içeren DIAP1 (apoptoz Drosophila inhibitörü) türetilir 28 kaspaz ile drice. 42,43 drice kaspaz-...

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Bu deneyin genel amacı, model olarak Drosophila Melanogaster kullanarak canlı hayvanlarda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesini tespit etmek ve takip etmektir. Kaspazlar, apoptotik hücre ölümüne neden olmak için birçok hücresel bileşeni parçalayan proteazlardır. Bu nedenle, hücrelerdeki aktif kaspazların varlığının genellikle yaklaşan hücre ölümünü yansıttığı varsayılır.Ancak, artan kanıtlar hücre ölümüne neden olan aynı kaspazların sağlıklı hücrelerde de normal rollere sahip olduğunu göstermektedir. Kaspazların bu rutin görevleri arasında nöronal aktivitenin düzenlenmesi, mitokondriyal fonksiyonlar ve hatta alternatif hücre ölümü yollarının baskılanması yer almaktadır. Kaspazların bu rutin görevlerini incelemede iki temel zorluk bulunmaktadır.Birincisi, normal bazal kaspaz aktivite seviyeleri genellikle mevcut teknolojilerin tespit limitlerinin altındadır. İkinci olarak, bazal kaspaz aktivitesi tespit edilebildiğinde bile, bunu yakın gelecekte hücre ölümüne yol açacak kaspaz aktivitesinden ayırt etmek zordur. Bu sorunu çözmek için, kaspaz aktivasyonundan kurtulmuş hücreleri kalıcı olarak işaretleyebilen, daha hassas bir kaspaz biyosensörü olan kaspaz izleyicisi geliştirdik.Bu biyosensör, apoptotik olmayan kaspaz aktivitelerine sahip hücreleri tespit etmemize ve takip etmemize, ayrıca canlı hayvanlarda bu aktivitelerin işlevlerini incelememize olanak sağlayacaktır. Drosophila in vivo kaspaz takipçi biyosensör sistemi iki bileşenden oluşur. Kaspaz tarafından aktive edilebilen maya transkripsiyon faktörü Gal4 ve G-Trace olarak bilinen Gal4 aktive floresan raporlayıcı.Kaspaz biyosensör sinekleri, kaspaz aktivitesini kırmızı ve yeşil floresans olarak raporlayan CaspaseTracker sineklerini üretmek için G-Trace sinekleri ile çaprazlanır. Biyosensör, aktif kaspazlar tarafından DQVD dizisinden kesilip Gal4'ü plazma membranından serbest bıraktığında, yavru sineklerde kaspaz aktivitesi tespit edilir. Serbest kalan Gal4, çekirdeğe taşınır ve kaspazlar inaktif hale gelene kadar kırmızı floresan proteinin, RFP, ekspresyonunu indükler.Buna karşın Gal4, FLP rekombinazın ekspresyonunu da indükleyerek, hücrenin yaşamı boyunca nükleer hedefli GFP'nin sürekli ekspresyonuna yol açar. Bir kontrol biyosensör, kaspaz kesim bölgesinde DQVA mutasyonuna sahiptir. Başlamak için, kaspaz-duyarlı Gal4 biyosensörü taşıyan transgenik sinekleri, G-Trace floresan raporlayıcısını taşıyan sineklerle çaprazlayın.Yedi ila 10 adet bakire biyosensör dişiyi, yeni çıkmış yedi ila 10 adet erkek G-Trace sineği ile taze besin içeren bir flakon içerisinde eşleştirin. Önemli bir negatif kontrol, caspase kesimi için gerekli olan aspartat kalıntısında tek bir nokta mutasyonuna sahip olan, bu biyosensörün caspase duyarsız versiyonudur. Bu kontrol sinekleri için aynı çiftleşme prosedürünü uygulayın.Çaprazlamalar kurulduktan sonra, tüpleri 18 °C'de tutun. Larvalar gelişirken ve yeni yavru sinekler ekloz etmeden önce, yeni yavrular üretmeye devam etmek için ebeveyn sinekleri yeni tüplere aktarın. Yavru sinekler çıktığında, düz ve kıvrılmamış kanatlı olanları toplayın.Bu fenotip, bu sineklerin hem kaspaz biyosensörü hem de floresan G-Trace raporlayıcı için transgenler taşıdığını gösterir. Ardından, yerleşik protokolleri izleyerek, hem kaspaz takipçi hem de kontrol sineklerinden sağlam dahili yumuşak dokuları izole etmek için sinekleri dissekt edin. Başlamak için, dissekt edilen dokulara yapışmayacak pipet uçları ve santrifüj tüpleri hazırlayın.Bunu yapmak için uçları ve tüpleri, suda çözülmüş yüzde bir sığır serum albümini ile kaplayın. Diseke edilen dokuları fikslemek için, kaplanmış şeffaf duvarlı tüplere 0,5 mL taze yüzde dört paraformaldehit (PBS içinde) ekleyin ve yeni diseke edilmiş dokuları bu tüplere aktarın. Ardından, fotobleaching'i önlemek için dokuları oda sıcaklığında karanlıkta bekletin ve dokuların fiksatif ile yıkanmasını sağlamak ve doku hasarını önlemek için hafif bir rotasyonla 20 ila 30 dakika inkübe edin.Uzun süreli fiksasyonlar, dokuların suboptimal boyanmasına yol açabilir. Paraformaldehidi uzaklaştırmak ve fikse edilmiş dokuların membran geçirgenliğini başlatmak için, paraformaldehit çözeltisini kaplamalı bir pipet ucuyla nazikçe çekin ve dokuları üç kez 0,5 mL PBST ile yıkayın. Doku geçirgenliğini tamamlamak ve sonraki boyama prosedürlerinde spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için, dokuları %1 BSA içeren 0,5 mL PBST içerisinde, 4 °C'de, karanlıkta ve hafif rotasyonla gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, permeabilize edilmiş dokuları 0,5 mL PBST ile üç kez yıkayarak PBST BSA çözeltisini uzaklaştırın. Farklı doku yapılarının görselleştirilmesine yardımcı olmak için, hazırlanmış dokuları Hoechst 33342 mavi nükleer boya ve Alexa Fluor 633 phalloidin F-aktin boyası içeren 0,5 mL PBST içerisinde oda sıcaklığında, hafif rotasyonla bir saat boyunca inkübe ederek nükleer DNA ve sitoplazmik F-aktini birlikte boyayın. Fazla boyayı, dokuları 0,3 mL PBST ile üç kez yıkayarak uzaklaştırın.Her bir yıkama işlemini, oda sıcaklığında hafif rotasyonla beş dakika boyunca inkübe edin. Tüpteki dokulardan tüm solüsyonu ince bir pipet ucuyla dikkatlice uzaklaştırın. Görüntüleme sırasında floresan sinyalini korumak için, dokuları tamamen örtecek şekilde 200 microliters anti-bleach mounting agent ekleyin.Dokuları oda sıcaklığında bir ila üç saat veya dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkube edin. En ideali, montaj ajanını tamamen emmiş olan dokuların tüpün dibine çökmesidir. Dokuları monte etmeden önce, lamı su veya %70 etanol ile temizleyin.Dokuların aşırı sıkıştırılma nedeniyle zarar görmesini önlemek için lam ve lamelleme camına vazelin uygulayın. Ardından, dokuları montaj ajanı ile birlikte lama aktarın. Fazla montaj ajanını peçete yardımıyla temizleyin.Son olarak, kenarlar boyunca oje sürerek lamelini mühürleyin. Başlamak için, lamı ters bir mikroskobun tablasına yerleştirin. Ve 0,8 açıklığa sahip 20x Plan-Apochromat objektif kullanarak hücre görüntülerini yakalayın.İlgilenilen bölgeyi, ki bu durumda sineğin tüm iç organ sistemidir, kapsayacak bir görüntü döşeme planını doğrulamak için düşük çözünürlükte birkaç test görüntüsü alın. Görüntü dizisini en uzun eksitasyon dalga boyuyla başlayıp en kısa eksitasyon dalga boyuyla bitecek şekilde ayarlayın. Bu işlem, kısa dalga boylarında artan fotobeyazlamayı en aza indirecektir.Ardından, uygun şekilde yüksek bir çözünürlükte görüntüler alın. Başarılı bir döşeme (tiling) için her görüntü, bir sonraki görüntüyle %10 örtüşmelidir. Arka plan gürültüsünü azaltmak için döşeme başına iki ila sekiz görüntüleme taraması toplayın.Diferansiyel girişim kontrastı, DIC, nedeniyle görüntü karoları arasında oluşan gölgeyi gidermek için boş bölgeden bir referans DIC görüntüsü alın. Ardından, referans DIC görüntüsü ile karo görüntüsü üzerinde gölge düzeltmesi gerçekleştirin. Bu; ağız parçaları, ön bağırsak, kursak, orta bağırsak, arka bağırsak, anüs, yumurta kanalı ve yumurtalıkları ile birlikte diseke edilmiş, yeni çıkmış bir kaspaz takipçisi sinektir.Konfokal mikroskopi ile kaspaz aktivitesi, yakın zamandaki kaspaz aktivitesini belirten RFP floresansı ve geçmişteki kaspaz aktivitesini belirten GFP floresansı aracılığıyla görselleştirilir. Büyütülmüş görüntüler; optik lob, cardia, orta bağırsak, arka bağırsak ve ovidukta RFP ve GFP biyosensör aktivitesini ortaya koymaktadır. Malpighi tübülleri boyunca yer alan spesifik hücreler, kalıcı kaspaz aktivitesini gösteren hem RFP hem de GFP'yi belirgin şekilde sergilemektedir.Buna karşın, F-aktin boyaması ile yapılan eş boyamaya dayalı olarak, yumurta odacıkları arasındaki kas hücrelerinde biyosensör eksprese edilmiş olsa da, yumurta odacıklarında herhangi bir RFP veya GFP biyosensör aktivitesi görülmemiştir. Bununla birlikte, immünoboyamaya dayalı olarak nükleer yıkıma ve masif kaspaz aktivasyonuna neden olan açlık veya soğuk şoku gibi bir hücre ölümü stimülüsü ile sineklere işlem uygulandığında, yumurta odacıklarının hücreleri kaspazları aktive edebilme kapasitesine sahiptir. Kaspaz takipçisinin muhtemelen erken aşamada ortaya çıktığı ve ardından hücre ölümü sırasında yok olduğu düşünülmektedir.Sağlıklı caspase tracker sinek beyninin optik lobunda, pan-nöronal bir marker olan anti-ELAVI antikoru ile yapılan eş boyama temel alındığında, nöronlar olduğu görülen sağlıklı hücrelerde biyosensör aktivitesi tespit edilmektedir. Bu durum, nöronlarda apoptotik olmayan caspase aktivitesinin bir rolü olduğunu göstermektedir. Genetik araçlar kullanılarak biyosensör ekspresyonunun kapatılması gibi diğer stratejiler, caspase aktivitesine sahip hücrelerin uzun süreli hayatta kaldığını kanıtlamak için kullanılabilir.Örneğin, Gal4'ü inhibe eden GalADTS. Caspase takipçisi, kontrol amaçlı kesilemez biyosensör DQVA aktive olmadığı için spesifik olarak caspase aktivitesini raporlar. Kontrollerdeki tek sinyal; ağız parçalarında ve anüste kalan kütikül ile kursak ve kardiyumda bulunan sindirilmiş gıdadan (maya) kaynaklanan otofloresanstır.Bu videoyu izledikten sonra, meyve sineklerinde apoptotik olmayan kaspaz aktivitesini takip etmek için kaspaz takipçisi biyosensörünün nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, kaspaz biyosensör sinyallerini otofloresanstan ayırt etmek için negatif kontroller eklemek önemlidir. Örneğin, biyosensör olsun veya olmasın, sineklerde kütikül ve yağ cisimcikleri güçlü otofloresans üretir.Kaspaz takipçi biyosensörünün mevcut versiyonu, aktif kaspaz DRICE'ı tespit etmek için tasarlanmıştır. Diğer uygulamalar, DRICE tarafından tanınan kesim bölgesinin diğer kaspazlar tarafından tanınan kesim bölgesiyle değiştirilmesiyle, farklı kaspazlara özgü biyosensörleri içerebilir.

in-vivo-biosensor-tracks-non-apoptotic-caspase-activity-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada apoptotik hücre boşluk dinamikleri eğitim için etkili bir yöntem...

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

Bazı genetik bozulmalar veya toksinlere maruz kalma, belirli hücre tiplerinin ölümüne yol açan normal gelişimsel süreçleri bozabilir. Zebra balığı embriyolarında tam montajlı immünofloresan ile aktive edilmiş Kaspaz 3'ün analizi, spesifik olarak apoptoz geçiren hücrelerin evre ve dokuya özgü lokalizasyonunu ortaya koymaktadır.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi Drosophila

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Burada yüksek spatio-zamansal çözünürlük vivo içindecanlı görüntüleme yara onarım ve ilişkili inflamatuar yanıt için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem uzun vadeli görüntüleme ve belirli hücre popülasyonlarının zaman içinde izleme etkinleştirmek için Drosophila geliştirme pupa aşaması kullanır ve verimli RNAi aracılı gen inactivation ile uyumludur.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

Burada rekombinant Drosophila kaspazlarını Dronc ve Drice'i ve bunların in vitro bölünme tahlillerini eksprese etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

İn Vitro Substrat Taraması için Saflaştırılmış Rekombinant Drosophila Caspases Kullanarak Bölünme Testleri

Keşfedin canlı hayvanlarda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesini Drosophila melanogaster kullanarak nasıl izleyeceğinizi. CaspaseTracker biyosensörü sağlıklı hücrelerdeki kaspaz rollerini anlamak için değerli bir araçtır.

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Daha fazla video keşfet