Name: Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Öğrenin, zaman atlamalı mikroskopi ile HT1080 hücrelerinde tek hücre düzeyinde anti-kanser ilaç yanıtlarını uzun süreli izleme yöntemini. Bu teknik, kanser hücrelerinin ilaçlara karşı gösterdiği heterojen yanıtları ve hücre kaderini gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik destek için Joshua Marcus'a ve teknik tavsiye için Richard J. McIntosh Işık Mikroskobu Çekirdek Tesisi Direktörü Dr. Jolien Tyler'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Colorado Boulder Üniversitesi ve Colorado Boulder Üniversitesi Lisansüstü Okulu'ndan JDO'ya sağlanan fonlarla desteklenmiştir. RTB, kısmen NIH'den (T32 GM008759) doktora öncesi eğitim hibesi ile desteklenmektedir. Selinexor için Karyopharm Therapeutics, Inc.'e ve Kinesin-5 inhibitörü için Merck Serono'ya teşekkür ederiz. FUCCI plazmitleri, MTA aracılığıyla Atsushi Miyawaki'den (RIKEN, Japonya) gelmektedir. mCherry-BP1-2 Addgene'dendi. H2b-mCherry ve β-tubulin-EGFP'yi eksprese eden HeLa, Daniel Gerlich'ten (IMBA, Avusturya Bilimler Akademisi, Avusturya) alınmıştır.

Aşağıdaki protokol, Şekiller 4 ve 6 ile ilgili olarak elde etme ayarları ve deney koşullarında deneyler ile tanımlanan parametreleri kullanır. Bu parametrelerin çoğu, diğer deneyler uyacak şekilde değiştirilebilir (örneğin, maruz kalma süreleri, gruplama, floresan kanalları, vs.).. Tüm işlemler, kurumsal kurallar ve düzenlemelere uymak zorundadır ve kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından onaylanmalıdır. Mikroskop üretici web siteleri canlı hücre görüntüleme için mükemmel bilgiler içermektedir. 1. mikroskoplar ve Görüntüleme Yazılımı <ol><li> ters mikroskoplar çok çeşitli canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. En yaygın mikroskoplar Epifloresans ve eğirme diskli konfokal Geniş alanlı edilir. Burada, 200 watt metal halide ışık kaynağı ile bir otomatik ve motorlu widefield Epifloresans mikroskop kullanıyoruz. </li><li> Bir sahne top almak veya çevre odasına mikroskop. Burada, bir sahne t kullanmakop çevre odası. </li><li> time-lapse mikroskobu yürütmek için programları ile mikroskopları çalıştırmak için ticari yazılım kullanın. </li><li> Görüntü analizi için ticari olarak temin edilebilen yazılımı veya ImageJ kullanın. Diğer birçok analiz araçları piyasada mevcuttur ve 8,18 yayınlanmış olan birçok ısmarlama programları vardır. </li></ol> 2. Hücresel Süreçler ve Fenotipik Yanıtlar görselleştirme <ol><li> aydınlık mikroskobu ile hücrelerin görselleştirmek. yalnız Diferansiyel girişim kontrast ve faz kontrast anti-kanser ilaç yanıtları yanıtları incelemek için çok bilgilendirici olabilir. Bu süreçler mitoz, hücre motilitesi ve apoptoz içerebilir. </li><li> floresan biyosensörler ile hücre yapıları, organelleri ve süreçleri gözünüzde canlandırın. Floresan sondalar spesifik hücre içi süreçleri izleme bilgilendirici. Bunlar mikrotübül dinamiklerini, mitokondriyal ve endoplazmik retikulum dinamikleri, protein birikimi ve lokalizasyonu ve içerebilirmoleküler sinyal (örn., fosforilasyon, kalsiyum). </li></ol> Numunelerin 3. hazırlanması <ol><li> Standart bir hücre kültürü sertifikalı kap içinde bulunan hücreler büyümek, nemlendirilmiş hücre kültürü yetiştirme cihazı kullanılmaktadır (örneğin, 37 o C,% 5 CO2,% 80 bağıl nem). <ol><li> EBSS&#39;ye ile MEM HT1080 hücreleri büyütün. % 10 h / h FBS,% 1 h / h Pen / Strep,% 1 hac / hac sodyum piruvat ve% 1 h / h esansiyel olmayan amino asitler ile, ortam takviyesi. </li></ol></li><li> görüntüleme İki gün önce, sertifikalı steril laminer akış kaputun içindeki bir 12-iyi # 1.5 cam alt çanak 3 kuyu içine plaka 50,000 HT1080 FUCCI hücreleri. Deneyin başlaması için ~% 60 izdiham elde etmek için kaplama hücrelerinin sayısını ayarlar. hücre çizgisi ve deney hücre yoğunluğu doğasına bağlı olarak daha az olabilir. Not: Hücre yoğunluğu, hücre kuşağının büyümesinin ve deney sonuçları üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. en aza indirmek için hücreleri saymak deneme-to-deney variabilityoğunluğuna bağlı Y. <ol><li> çevre odasında ve deney için gerekli olan koşullar, tek bölmeli tepsilerde levha hücreler (genellikle 35-veya 60-mm), 4 de 35 mm&#39;lik tabaklar, 6-, 12 veya 24-iyi hücre kültür plakaları ya da bağlı olarak çeşitli biçimlerde slaytlar lamel. Hücre kültürü plastik yoluyla # 1.5 en objektif lensler cam bu kalınlık için optimize edilmiştir cam ve görüntüleme ile cam-alt tabak kullanın çok kötüdür. Not: Bazı hücre hatları büyür ve camın üzerine hayatta yoktur. Bu gibi durumlarda, cam (örn., Poli-lisin ya da kolajen), hücre yapışmasını arttırmak için kaplanabilmektedir. Bu uygun bir seçenek olup olmadığını Bazı şirketler, bu ampirik olarak tespit edilmelidir optik hücre kültürü plastik imalatı. </li></ol></li></ol> 4. Çevre Odası Kurulumu <ol><li> Önceden herhangi bir deney için, set-up çevre odasını 37 o C 80% nem ~ çalışır ve böylece örnek konumunda sıcaklık böylece. En kültürlenmiş hücreler nedeniyle ortam içinde, sodyum bikarbonat tamponu% 5 CO2 / denge hava atmosferinde büyür. Set-up bağlı olarak, ya% 5 CO 2 çevre kontrolörü ayarlamak ve hava ile% 100 CO 2 karıştırın, ya da% 5 CO 2 / denge hava gazı sertifikalı, önceden karıştırılmış kullanacaktır. Gaz akış hızları için üreticinin talimatlarını izlemelidir. Not: bazı hücre çizgileri de CO2 olmaksızın muhafaza edilebilir ve bu durumda, CO 2 bağımsız ortamda büyür. Özel olarak tasarlanmış görüntüleme medya autofluorescent bileşiklerinin eklenmesini sınırlar da mevcuttur. İstenen bir hücre tipi için tezler ortamlarda büyüme deneysel olarak daha önce tespit edilmelidir. </li><li> görüntüleme önce su deposu steril damıtılmış su ile (üreticinin talimatlarına sonra) dolu olduğundan emin olun. İstenilen sıcaklık ayarına çevre odasında açın ve mikroskop sahne içerlek içine yerleştirin. gaz kaydetmek için, bu noktada akışını başlatmak yok. Not: sahne top haznesi ve sahne içerlek ve / veya deneye hareket eserleri tanıtmak olabilir odasına bağlantı kablolarının herhangi bir gerilim arasında herhangi bir boş alan varsa. <ol><li> sahneye çift içine odasına odasını takmadan önce sahne gömme açılış kenarları üzerinde parafin filmin parçalarını Lay ve hiçbir bağlantı odasının çekerek emin olun. </li></ol></li><li> Odası 37 o C gelmesini sağlayınız Hücre fizyolojisini etkileyen ve sürüklenme tanıtabilirsiniz görüntüleme sırasında sıcaklık dalgalanmaları önlemek için istikrarlı bir sıcaklık korumak. Ulaşan sıcaklık dengeleme genellikle ortama bağlı olarak 1 saat 30 dakika gerektirir. <ol><li> ısıtılırken odasına kuyulardan su ile bir &#39;kukla&#39; çanak yerleştirin. odasına sağlamak yardımcı su taklit ile örnek dolu bir görüntüleme çanak, yeterince ısınmış ve stabilize edilir. Önceden ısıtılmış steril su ile bölme doldurmaIsı dengelenmesi için gerekli olan zamanı azaltır ve deneysel örnek ilavesinden sonra sıcaklık düşmesini minimuma indirir. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskop Set-up <ol><li> mikroskop, ilişkili bilgisayar, ve gerekli çevre birimlerini açın. <ol><li> Işık kaynağına bağlı olarak, gerekli kadar açmak için sabırsızlanıyorum (örn., LED). </li></ol></li><li> Düşük pozisyonda objektif taret, kullanılacak 20X 0.7 NA hedefi seçin. </li><li> amaç üzerinde örnek yerleştirin - Bu örnek odasına olduğunda daha kolay hücreleri bulmak için yapacaktır. </li><li> önceki deneylerden biliniyorsa, şu anda görüntüleme parametreleri tanımlayın. </li></ol> 6. Mikroskop ve Odası&#39;na Hücreler taşınması <ol><li> Taşıma hücreleri, çevresel bölmeye inkübatör yansıması. Bu nispeten düşük CO2 etkilerini sınırlamak için hızlı bir şekilde yapılır emin olun </sub&gt; atmosfer ve hücreler üzerindeki sıcaklık azaldı. Numune taşıma ve dökülme durumunda temiz-up için tüm kurumsal biyogüvenlik kurallarına uyun. <ol><li> Büyük çevre değişiklikleri önlemek için kapalı bir Strafor kap veya yalıtılmış torba hücreleri yerleştirin. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına aşağıdaki odasına örnek görüntüleme çanak yerleştirin. </li><li> Hücre, çevresel bölme içinde tespit edildikten sonra, kararlı bir ortam sağlamak hemen atmosferik gaz kaynak (lar) açmak için bölme mühür. <ol><li> bazı çevresel odaları sıkı, mühürlü kapağı kullanmak yok gibi, büyüme ortamının üstüne buharlaşmasını, steril bir katman, embriyo sertifikalı madeni yağ geciktirir. Cam görüntüleme alanını engellemeyecek için dikkatli olmak örnek çanak çevre-kenarlarda gaz geçirgen parafin filmi sarın. Lokalize, ikincil nemlendirme yöntemleri kullanılabilir. performasını azaltabilir örnek çanak kapağı üzerinde yoğunlaşmaaydınlık mikroskobu mance. </li></ol></li><li> Erken deney sırasında termal sürüklenme etkisini en aza indirmek amacıyla, time-lapse başlamadan önce 30 dakika bekleyin. Gerekli zamanlı görüntüleme çanak büyüklüğü ve diğer faktörlere bağlı olarak değişir. ampirik belirleyin. </li></ol> 7. Görüntüleme kurma <ol><li> en iyi veri temsil edecek seçin görüntüleme koşulları. , Pozlama süreleri sınırlayıcı düşük yoğunlukta ışık kullanılarak ve ışığın uzun dalga boylarına göre heyecanlıyız sondalar seçerek fototoksisite önlemek için gerekli tedbirleri alın. </li><li> Her bir konum için X, Y ve Z düzlemi ve istenen dalga boyu (ları) nın, görüntülenecek. Zaman çözünürlüklü pozisyonları ve dalga boyu sayısı ile sınırlıdır. En hücresel süreçlerin uzun vadeli time-lapse, bir görüntü her 10 elde - 20 dakika; yüksek zaman çözünürlüğü (kısa aralıklar, örneğin., 1 dk) daha fazla veri noktaları ve bu nedenle daha güçlü hücre izleme sağlar, fakat aynı zamanda daha entegre sonuçlanırışığa maruz kalma ve daha büyük veri setleri. <ol><li> - 50 msn, Texas Red / TRITC - 40 msn, aydınlık - 20 milisaniye FITC / GFP: HT1080 FUCCI dinamik, yeşil ve kırmızı floresan proteinleri olduğu gibi (Temsilcisi Sonuçlar bakınız), aşağıdaki poz kez kullanabilirsiniz. 2 x 2 bin kullanın. </li></ol></li><li> Gelişmiş ayarları altında, varsayılan parametreler kullanılarak yazılım kontrollü otomatik netleme etkinleştirin. Tavsiye adım büyüklüğü ile 10 mikron bir otofokus aralığını tanımlayın. time-lapse başlamadan önce bu yaptığınızdan emin olun. Aydınlık görüntüleri ile otofokus ve asla floresan ile fototoksisite ve photobleaching azaltmak için. <ol><li> motorlu bir sahne ile herhangi bir mikroskop yazılım kontrollü otomatik netleme sistemleri kullanmak ve doğrudan örnek üzerinde odaklanmak. Ancak, deney edinme hızını sınırlayabilir. Sürekli odaklama sistemleri daha fazla pozisyon için izin time-lapse mikroskopi için iyi çalışır ve hızını artırmak kontrollü donanım görüntülü veya devralma daha yüksek bir oran olması. Bununla birlikte,Hava-cam arayüzü tespiti güveniyor ve kuyunun üzerinden cam kalınlığı varyasyonları ile numunenin odağı kaybedebilir. </li></ol></li><li> Medya 37 o C ısıtılmış olmuştur istenen ilaç konsantrasyonu içeren medyanın yarısını Değiştir Kısmi medya yedek termal sürüklenme azaltmaya yardımcı olur. Bu deneyde koşulları araç (DMSO), 1 uM selinexor ve 10 uM PD0332991 vardır. Not: Bu adım aynı zamanda duraklatma ve deney yeniden başlatarak satın başlattıktan sonra yapılabilir. Bu tek hücre öncesi ve sonrası ilaç etkileşimleri uzunlamasına izleme sağlar. İlaç kararlılığı ya da metabolizma eğer duraklatma ve medya aynı yöntemle yapılabilir yerine, bir husustur. İlaç bozulması veya metabolizma testi için, muamele edilmiş hücreler ortam, aynı zamanda ilaç etkisini test etmek için saf hücrelerde yerleştirilebilir. </li><li> time-lapse başlatın. </li><li> Zaman atlamalı çalışır gibi, görüntülü alanlar odak ve Chambe içinde kalmasını sağlamakr nemli 37 o C korur <ol><li> zaman noktaları arasındaki zaman boşluğu sırasında edinme duraklatarak gerektiği gibi odağı ayarlayın. </li></ol></li><li> Gerekirse, uzun deneyler sırasında bölmeye su ilave edilir. 37 o C&#39;de önceden ısıtılmış steril damıtılmış su eklemek suretiyle soğutma odalı önlemek </li></ol> 8. Time-lapse Bitiş <ol><li> Deney tamamlanma tükendi zaman otomatik olarak durdurmak için ayarlanmamış ise, satın durdurun. </li><li> düzgün veri kaybı olabilir bitmiş değilse çoğu yazılım paketleri otomatik olarak satın alma sırasında tasarruf rağmen time-lapse, sabit diske düzgün kaydedildi emin olun. </li><li> mikroskop odasına çıkarın ve onaylı kurumsal biyogüvenlik prosedürleri takip biyolojik tehlikeli atık haline hücrelerin imha edin. </li></ol> 9. Boyuna Takip ve Analiz Zaman atlamalı Verilerinin <ol><li> bir analiz için metodoloji seçinilgi biyolojik süreçler için uygundur. Birçok ImageJ için eklentileri, MATLAB kullanarak programları ve özel platformlar özel uygulamalar için üretilmiştir. Şekiller 4 ve 5&#39;te gösterildiği gibi, aşağıdaki yöntem çekirdeklerin nükleer flüoresan analiz izleme kapsar. </li><li> ImageJ kullanılan kanallar için tif görüntü yığınlarını açın. Alternatif olarak, Bioformats eklentisi kullanarak doğrudan ImageJ satın alma programı açık yerli dosyaları. </li><li> aydınlık görüntü veya (eğer kullanılıyorsa) nükleer etiket kanalını kullanarak bir hücrenin çekirdeğinde içinde faiz (ROI) bir bölge çizin ve ROI yöneticisi ekleyin. Not: görüntülü hücreler nükleer etiketi varsa (örneğin, histon H2B EGFP.), Daha sonra otomatik hücre izleme süresi faiz (ROI) bireysel çekirdekleri temsil bölgeleri oluşturmak için kullanılabilir. </li><li> dahaki sefere noktasına geçin ve aynı nucleu içinde ROI konumlandırmaks. ROI yöneticisi ROI ekleyin. </li><li> Izlemek ve hücresel bir olay (mitoz, apoptoz, vb.) Veya hücre artık izlenebilir kalmayıncaya kadar bireysel hücre için İB&#39;leri yapmaya devam (yani., Çerçevenin dışına taşır veya deney biter). </li><li> ROI onlar alanında bulunmaktadır zaman içinde hücreler için kurulduğunda, ilgi floresan kanalları üzerine onları üst üste. Her bir zaman noktası için her kanalda floresans ortalama yoğunluğu ölçülür. daha sonra kullanmak üzere ROI listesini kaydedin. <ol><li> Çeşitli ölçümler farklı deneyler uygulamalar için ROI içinde yapılabilir. (Örneğin. ROI, entegre yoğunluğu, vb içinde ortalama yoğunluğu.) Analitik yöntemi seçmek için bir menüyü getirmek için ... Analiz → Set Ölçümleri tıklayın. </li></ol></li><li> Izlerken tek tek hücrelerin hücre kaderi (örn., Apoptoz, bölünme, hayatta kalma) unutmayın. Bu hayatta kalma eğrileri ve furthe yaratılması için izinr populasyon çözümlemesi. </li><li> Her iki kanal için ortalama yoğunluğu ile, terapötik (Şekil 5B, Cı) yanıt olarak hücre döngüsü dinamikleri görüntülemek için bir dağılım grafiği oluşturur. Not: Lineer zaman tek tek hücreler için oluşturulan veya izlenen bir hücre popülasyonu üzerinden ortalaması olabilir. Kantitatif görüntüleme kanser tedavi tepki olarak karmaşık tepkiler ve hücre ilişkilerin kurulması için çok önemli olabilir. Uzun vadeli time-lapse mikroskopi, uzunlamasına izleme ve veri analiz mikroskopisi ve analiz araçları türü için birçok seçenek ile, bir çok adımlı bir süreçtir ve Şekil 1&#39;de verilen genel hatlarıyla izlemektedir. </li></ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Time-lapse Mikroskopi ve Boyuna İzleme Avantajları bu araştırmacılar, bireysel hücreleri ve kaderlerini yanı sıra tüm nüfusu izlemenize olanak sağlar olarak mikroskop ilaç yanıtının uzunlamasına çalışmalar için ideal bir araçtır. bir hücre popülasyonu içinde, ilaç yanıtındaki değişkenliği, anti-kanser terapötik tasarımı için önemli bir sorundur. tek hücre Boyuna izleme araştırmacılar bu değişkenliği gözlemlemek ve hücre popülasyonu ile ilgilidir olarak yatan mekanizmaları ve...

Canlı hücre mikroskopi ve tek hücre boyuna izleme yeni bir teknik değildir. Erken mikroskoplar, meraklıları ve bilim adamları tek hücreler ve organizmalar, onların davranışlarını ve gelişimini 1-3 gözlenen ve inceledik. 1950&#39;lerde Vanderbilt Üniversitesi&#39;nde geç David Rogers ünlü bir örnek, bir Staphylococcus aureus bakterisi ve fagositoz 4 sonunda sürecini kovalayan bir kan yaymasında bir insan nötrofil gösterir. Bu canlı hücre film tek bir deneyde gözlenen ve korelasyon nasıl birden çok işlem mükemmel bir örnektir: Bir kimyasal degrade, mekanik ve hücre hareketi hızı algılama, hücre dinamikleri, yapışma, ve bir patojenin fagositozu şekillendirir. tam otomatik mikroskopları ve son derece hassas dijital kameralar gelişi hücre biyolojisi değişen f temel soru sormak için mikroskobu kullanarak araştırmacılar bir çok artan sayılarda sonuçlandıHücreler 5,6 taşımak ve dinamikleri ve membran ticaretini 9-11 organel 7,8 bölmek nasıl rom. Floresan olmayan, 1953 yılında Frits Zernike için Nobel Ödülü topladı faz-kontrast (PC), ve diferansiyel girişim kontrast da dahil olmak üzere aydınlık mikroskobu (DIC) mikrotübül demetleri dahil hücre ve çekirdeklerin aynı zamanda alt hücresel yapıların gözlem için izin , kromozomlar, nükleol, organel dinamikleri ve kalın aktin lifleri 12. Genetik floresan proteinleri kodlanmış ve organeller karşı floresan boyaların geliştirilmesi önemli ölçüde time-lapse mikroskopi 13-15 etkiledi. Bu yazının odağı değil iken, hücre sferoidler ve in situ (Intravital mikroskopi) konfokal ve multiphoton mikroskopi kullanılarak görüntüleme yaklaşımının başka genişleme temsil ve kullanımı ve bu yaklaşımları 16-19 tartışmak seçkin makaleleri vardır. Anti-Canc hücre tepkilerier ilaçlar veya doğal ürünler moleküler ve hücresel ölçekte belirlenir. Anlamak hücre yanıtları ve kaderleri aşağıdaki tedavisi genellikle tek hücreleri ölçmek nüfus ortalama deneyleri (örn., Immünoblotting, bütün kuyu ölçüleri), ya da immunofluorescent algılama ile sabit zaman noktaları ve akım sitometri, içerir. bir popülasyon içindeki ilaç tek hücre yanıtlarında heterojenliği, tümörler, özellikle de doygunluğuna aynı ilaç ile muamele edilir hücre hatları ve tümör boyunca görülen yanıt olarak değişkenlik bazı açıklayabilir. Belirli bir tek hücre ya da hücrelerin bir popülasyonu aşağıdaki uzunlamasına yaklaşımlar uzun süreli moleküler cevap yollarının doğrudan çalışma için olanak sağlayan daha az sık ama çok güçlü bir yaklaşım, farklı fenotipleri (örn., Hücre ölümü veya hücrenin bölme), gözlem hücre-hücre bir popülasyon içindeki değişkenliği ve nasıl bu faktörler popülasyon yanıtı dinamikleri 20-22 katkıda bulunur. Iyimser, güçlü olmakgözlemlemek ve uyuşturucu bazen başarısız neden çalışmak ve en iyi nasıl bunları kullanmak için nasıl anlayışımızı geliştirmemize yardımcı olacaktır tek hücre yanıtlarını ölçmek için. Uzun vadeli time-lapse mikroskobu, uzunlamasına izleme ve ilaç yanıtları analiz tekniği birçok araştırmacı tarafından kullanılabilir ve fenotip yanıtları 20,21 gözlemlemek için sadece iletilen ışık kullanarak, basit olabilir. yaklaşımının ana bileşenleri şunlardır: ilgi hücreleri uygun hazırlanması, çevre haznesi ile otomatik mikroskop, kamera kazanmak ve zaman atlamalı yorumlayan görüntüleri saklamak, yazılım ve ölçmek ve hücreleri analiz etmek için bir bilgisayar ile entegre ve herhangi bir floresan biyosensörler. Biz aydınlık ve / veya widefield epifluorescent mikroskopi kullanılarak sürece birkaç gün kültür hücreleri time-lapse mikroskobu yürütmek için birçok ipuçları ile ayrıntılı bir protokol sağlar. kültüründe yetiştirilebilir herhangi bir hücre hattı için kullanılabilir Bu protokolanti-kanser tedavilerinin kendi yanıtlarını incelemek için. Biz elde edilen verilerin örneklerini sunmak ve kısaca farklı prob türleri, avantaj ve uzun vadeli time-lapse ve boyuna izleme dezavantajlarını tartışmak çok farklı genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler ve faz-kontrast mikroskobu örneği kullanılarak analiz, ne olabilir, olmayan doğrudan yaklaşımlar ve biz yaklaşımı kullanılarak kabul değil deneyimsiz araştırmacıların ilgi ve değer olacağını umuyoruz bazı değişimlerden anlaşılması zor ve deneyimli araştırmacılara bu yaklaşım için öğrendim.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paklitaksel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>mikrotübül stabilize edici ilaç</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>topoizomeraz II inhibitörü</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>ve</td><td>XPO1/CRM1 inhibitörü, hediye</td></tr><tr><td>Kinesin-5 inhibitörü</td><td>Merck Serono</td><td>hediye</td><td>, ayrıca American Custom Chemicals Corporation'dan temin edilebilir. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Hücre büyüme ortamı</td><td>HyClone (Fisher) veya Mediatech</td><td></td><td>birçok şirket mevcut</td></tr><tr><td>%5 CO2/denge havası, sertifikalı</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Çanak, 20 mm cam tabanlı</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>birçok şirket mevcut</td></tr><tr><td>35 mm 4 kuyulu Çanak, 20 mm cam tabanlı</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>birçok şirket mevcut</td></tr><tr><td>35 mm Çanak, ızgara cam alt</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>birçok şirket mevcut</td></tr><tr><td>Çok kuyulu, cam alt</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>birçok şirket mevcut</td></tr><tr><td>Olympus IX81 ters epifloresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB denetleyici</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Önceki Bilimsel</td><td>Lümen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>ÖNCEKİ Proscan III motorlu sahne</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV odası</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Çevre Kontrol Ünitesi</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD denetleyicili</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon lazer fırlatma</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA hafif motor</td><td>lümencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT kulüp odası</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

looking glass sayesinde: time-lapse mikroskopi ve tek hücre boyuna izleme anti-kanser therapeutics eğitim için

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

anti-kanser ilaçları ile tek hücre yanıtı Popülasyon yanıtı belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır ve bu nedenle genel bir sonuç önemli bir faktördür. Bağışıklık, akım sitometri ve sabit hücre deneyleri genellikle hücreler anti-kanser ilaçlar nasıl tepki incelemek için kullanılır. Bu yöntemler önemlidir, ancak onlar birkaç eksiklikler var. kanser ve normal hücreler arasındaki ve farklı kanser kaynaklı hücreler ve geçici ve nadir yanıtları arasındaki ilaç yanıtları değişkenlik nüfus ortalama analizleri kullanılarak doğrudan izlemek ve uzunlamasına bunları analiz edebilmek olmadan anlamak zordur. mikroskop, özellikle de görüntü canlı hücreler için uygundur. teknolojideki ilerlemeler, sadece hücre izleme değil, aynı zamanda hücresel yanıtların çeşitli gözlem sağlayan bir çözünürlükte rutin görüntü hücreleri sağlamaktadır. Biz sürekli time-lapse görüntüleme sağlayan detaylı bir yaklaşım tarifesasen sürece genellikle 96 saat kadar istediğiniz gibi ilaç yanıtı sırasında hücreler. yaklaşımın çeşitleri kullanılarak, hücreler hafta içinde izlenebilir. genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler sayısız süreçler, yolları ve tepkilerinin istihdam ile takip edilebilir. Bu izleme ve hücre büyümesi ve hücre döngüsü ilerlemesinin, kromozom dinamiği, DNA hasarının ölçme ve hücre ölümünü içerir örnekleri göstermektedir. Biz de teknik ve esnekliği çeşitlerini tartışmak ve bazı ortak tuzaklar vurgulayın.

Uzun vadeli time-lapse mikroskopi ve doğrudan uzunlamasına izleme ilaç yanıtı sırasında birçok anti-kanser etkileri çalışma için izin verir. Şekil 1 &#39;de genel hatları sonra hücreler çeşitli örnekleri takip anti-kanser ilaçları ile tedavi edilen doğrulanmış floresan haberci ifade gösterilmiştir ve farklı yaklaşımlar kullanılarak analiz edilmiştir. Tek başına faz kontrast mikroskop çok bilgilendirici ve sağl...

Burada, anti-kanser terapötiklerine yanıt olarak tek hücreleri uzunlamasına izlemek için uzun süreli hızlandırılmış mikroskopi yöntemini açıklıyoruz.

Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Bu prosedürün genel amacı, kültürdeki tek hücrelerde anti-kanser terapötik yanıtı gözlemlemektir. Bu yöntem, heterojen terapötik yanıt ve hücre kaderi dahil olmak üzere kanser araştırmaları alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Başlamak için, sertifikalı steril bir laminar akışlı kabin altında, metin protokolüne uygun olarak kültür sertifikalı kaplarda HT1080 hücrelerini hazırlayın ve hücreleri nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.Görüntülemeden iki gün önce, 12 kuyucuklu, no. 1.5 cam tabanlı bir tabağın istenen sayıdaki kuyucuğuna kuyucuk başına 50.000 HT1080 FuGENE hücresi ekleyin. Deney başlangıcında yaklaşık %60 konfluens sağlamak için ekilen hücre sayısını, hücrelerin büyüme hızına ve kullanılan tabağa göre ayarlayın.Çevresel hazneyi yaklaşık %80 nemle ve numune konumundaki sıcaklığı 37 °C olacak şekilde ayarlayın. Üretici talimatlarını takip ederek su rezervuarının steril distile su ile doldurulduğundan emin olun. Ardından çevresel hazneyi istenen sıcaklık ayarına getirin, mikroskop tablasına yerleştirin ve sabitleyin.Sahne üst odası ile sahne eki arasında herhangi bir boşluk varsa, odayı içine yerleştirmeden önce sahne eki açıklığının kenarlarına parafin film parçaları yerleştirerek odayı sahneye sabitleyin. Hareket artefaktlarına yol açabilecek bağlantıların odayı çekmediğinden emin olun. Odanın içine su dolu bir dummy kap yerleştirin, odanın 37 °C'ye dengelenmesini bekleyin ve ardından stabil bir sıcaklık sağlayın.Görüntüleme kurulumunu yapmak için mikroskobu, bilgisayarı ve gerekli tüm çevre birimlerini açın. Işık kaynağının türüne bağlı olarak, ihtiyaç duyulana kadar açmayı bekleyin. Objektif taretini düşük konumda tutarak, 20x 0,7 sayısal açıklıklı objektifi seçin.Ardından, numuneyi objektifin üzerine konumlandırın; bu işlem, numune hazneye yerleştirildiğinde hücrelerin bulunmasını kolaylaştıracaktır. Metin protokolüne uygun olarak, görüntülenecek hücreleri çevresel hazneye aktardıktan sonra, stabil bir ortamı korumak için hazneyi mühürleyin ve atmosferik gazı açın. Sonrasında, pozlama sürelerini sınırlayarak ve daha düşük yoğunluklu ışık kullanarak fototoksisiteyi önleyecek görüntüleme koşullarını seçin.Görüntülenecek her pozisyon için X, Y ve Z düzlemlerini ve istenen dalga boylarını belirleyin. Çoğu hücresel sürecin uzun süreli zaman atlamalı görüntülerinde, her on ila yirmi dakikada bir görüntü alın. Daha yüksek zaman çözünürlüğü, daha fazla veri noktası ve daha sağlam hücre takibi sağlar, ancak daha fazla entegre ışık maruziyetine ve daha büyük veri setlerine yol açar.HT1080 FuGENE dinamik yeşil ve kırmızı floresan proteinlere sahip olduğundan, aşağıdaki pozlama sürelerini kullanın ve iki kere iki binleme uygulayın. Gelişmiş ayarlar altında, varsayılan ayarları kullanarak yazılım kontrollü otomatik odaklamayı etkinleştirin. Önerilen adım boyutu ile 10 mikrometre değerinde bir otomatik odaklama aralığı tanımlayın.Termal sürüklenmeyi azaltmak için, deneysel kapta medyanın yarısını, 37 °C'ye ısıtılmış ve istenen ilacı içeren medya ile değiştirin. Son olarak, time-lapse kaydını başlatın ve metin protokolüne göre görüntüleri elde edin. Bu videolar, sadece p53 durumları bakımından farklılık gösteren, kinesin-5'i inhibe ederek mitotik arrest ile sonuçlanan bir anti-kanser ilaç ile tedavi edilmiş, eşleştirilmiş bir çift meme kanseri kaynaklı MCF7 hücre hattı örneğini göstermektedir.Bu şekilde görüldüğü üzere, p53 stabil p53 knockdown yoluyla uzaklaştırıldığında, hücreler mitozu terk ettikten sonra duraklamak yerine, duraklamak yerine ikinci bir mitoz evresine girdikleri ve bölünme gerçekleşmeden mitozu terk ettikleri tekrarlayan döngülere girerler. Burada, kromatin belirteci Histone 2b'nin mCherry'ye ve beta tubulin'in EGFP'ye füzyon edilmiş halini stabil olarak eksprese eden serviks karsinomu türevli HeLa hücreleri gösterilmektedir. Mikrotübül stabilize edici ilaç paklitaksel ile tedavi edildiklerinde, mitoz sırasında kromozom dizilimi ve ayrışması bozulur; bu durum, DNA hasarına meyilli nükleer şişkinliklerin ve mikronükleusların oluşumuyla sonuçlanır.Bu hücre hattı, CDT1 için turuncu ve geminin için yeşil renkli iki floresan ubikitin hücre döngüsü göstergesini stabil olarak ko-eksprese eder ve hücre döngüsü boyunca normal şekilde ilerler. Aynı hücreler CDK46 inhibitörü ile etkileşime girdiğinde, hücreler G2 fazından geçer ve normal şekilde bölünür, ardından G1 fazında güçlü bir şekilde duraklar; bu durum, büyüyen tümörlerde etkili sitostatik etkiler oluşturma potansiyelini göstermektedir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir hücrenin yanıtını çıkarım yapmak yerine, günlerce süren bir süreçte gerçek zamanlı olarak doğrudan takip edebilmenizdir.

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, bir fare modelinde tümörlere bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığını izlemek için bir yöntemi göstermektedir. Luciferaz ile transdüksiyonlu efektör T hücreleri, deri altı tümör hücresi ksenogrefti olan bir fareye enjekte edilir. Daha sonra T hücrelerine ve tümör hücrelerine bağlanan bispesifik antikorlar sokulur. T hücrelerinin lokalizasyonu, biyolüminesan görüntüleme kullanılarak izlenir ve sinyalin büyüklüğü tümöre T hücresi infiltrasyonunun derecesini gösterir.

Tümörlere Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Trafiğini İzlemek için İn Vivo Bir Teknik

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Bu iletişim kuralı insan akciğer tümörü dilimleri içinde fluorescently eşleşmiş antikorlar ile etiketli görüntü ikamet tümör infiltre CD8 T hücreleri bir yöntem açıklanır. Bu teknik CD8 T hücre göç confocal mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı analiz izin verir.

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

In vivo immünfloresans lokalizasyonu (IVIL) yöntemi, in vivo tümör hedeflemesi ve ekzo immünboyama kombinasyonu nu kullanarak canlı organizmalarda onkolojik amaçlarla antikor ve antikor konjugatörlerinin in vivo biyodağılımını incelemek için kullanılabilir. Yöntemler.

Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Bu çalışmada kanser hücrelerine karşı makrofaj fagositik aktivite, özellikle 4T1 fare meme karsinom hücreleri görüntülendi. Canlı hücre kokültür modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Bu değerlendirme, çok noktalı hızlandırılmış video geliştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi.

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Bu çalışma, 3D hücre invazyonu ve göçü gibi dinamik süreçler sırasında plazma zarı üzerindeki proteinlerin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için yararlı olan, pediatrik diffüz orta hat glioma hücre hattına uygulanan bir canlı 3D hücre immünositokimyası protokolü sunmaktadır.

Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Burada, T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorların anti-tümör etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için yapılan çalışmalarda, bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığının tümörlere in vivo izlenmesini kolaylaştırmak için insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

Öğrenin, zaman atlamalı mikroskopi ile HT1080 hücrelerinde tek hücre düzeyinde anti-kanser ilaç yanıtlarını uzun süreli izleme yöntemini. Bu teknik, kanser hücrelerinin ilaçlara karşı gösterdiği heterojen yanıtları ve hücre kaderini gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

Daha fazla video keşfet