Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, kültürdeki tek hücrelerde anti-kanser terapötik yanıtı gözlemlemektir. Bu yöntem, heterojen terapötik yanıt ve hücre kaderi dahil olmak üzere kanser araştırmaları alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Başlamak için, sertifikalı steril bir laminar akışlı kabin altında, metin protokolüne uygun olarak kültür sertifikalı kaplarda HT1080 hücrelerini hazırlayın ve hücreleri nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.

Görüntülemeden iki gün önce, 12 kuyucuklu, no. 1.5 cam tabanlı bir tabağın istenen sayıdaki kuyucuğuna kuyucuk başına 50.000 HT1080 FuGENE hücresi ekleyin. Deney başlangıcında yaklaşık %60 konfluens sağlamak için ekilen hücre sayısını, hücrelerin büyüme hızına ve kullanılan tabağa göre ayarlayın.

Çevresel hazneyi yaklaşık %80 nemle ve numune konumundaki sıcaklığı 37 °C olacak şekilde ayarlayın. Üretici talimatlarını takip ederek su rezervuarının steril distile su ile doldurulduğundan emin olun. Ardından çevresel hazneyi istenen sıcaklık ayarına getirin, mikroskop tablasına yerleştirin ve sabitleyin.

Sahne üst odası ile sahne eki arasında herhangi bir boşluk varsa, odayı içine yerleştirmeden önce sahne eki açıklığının kenarlarına parafin film parçaları yerleştirerek odayı sahneye sabitleyin. Hareket artefaktlarına yol açabilecek bağlantıların odayı çekmediğinden emin olun. Odanın içine su dolu bir dummy kap yerleştirin, odanın 37 °C'ye dengelenmesini bekleyin ve ardından stabil bir sıcaklık sağlayın.

Görüntüleme kurulumunu yapmak için mikroskobu, bilgisayarı ve gerekli tüm çevre birimlerini açın. Işık kaynağının türüne bağlı olarak, ihtiyaç duyulana kadar açmayı bekleyin. Objektif taretini düşük konumda tutarak, 20x 0,7 sayısal açıklıklı objektifi seçin.

Ardından, numuneyi objektifin üzerine konumlandırın; bu işlem, numune hazneye yerleştirildiğinde hücrelerin bulunmasını kolaylaştıracaktır. Metin protokolüne uygun olarak, görüntülenecek hücreleri çevresel hazneye aktardıktan sonra, stabil bir ortamı korumak için hazneyi mühürleyin ve atmosferik gazı açın. Sonrasında, pozlama sürelerini sınırlayarak ve daha düşük yoğunluklu ışık kullanarak fototoksisiteyi önleyecek görüntüleme koşullarını seçin.

Görüntülenecek her pozisyon için X, Y ve Z düzlemlerini ve istenen dalga boylarını belirleyin. Çoğu hücresel sürecin uzun süreli zaman atlamalı görüntülerinde, her on ila yirmi dakikada bir görüntü alın. Daha yüksek zaman çözünürlüğü, daha fazla veri noktası ve daha sağlam hücre takibi sağlar, ancak daha fazla entegre ışık maruziyetine ve daha büyük veri setlerine yol açar.

HT1080 FuGENE dinamik yeşil ve kırmızı floresan proteinlere sahip olduğundan, aşağıdaki pozlama sürelerini kullanın ve iki kere iki binleme uygulayın. Gelişmiş ayarlar altında, varsayılan ayarları kullanarak yazılım kontrollü otomatik odaklamayı etkinleştirin. Önerilen adım boyutu ile 10 mikrometre değerinde bir otomatik odaklama aralığı tanımlayın.

Termal sürüklenmeyi azaltmak için, deneysel kapta medyanın yarısını, 37 °C'ye ısıtılmış ve istenen ilacı içeren medya ile değiştirin. Son olarak, time-lapse kaydını başlatın ve metin protokolüne göre görüntüleri elde edin. Bu videolar, sadece p53 durumları bakımından farklılık gösteren, kinesin-5'i inhibe ederek mitotik arrest ile sonuçlanan bir anti-kanser ilaç ile tedavi edilmiş, eşleştirilmiş bir çift meme kanseri kaynaklı MCF7 hücre hattı örneğini göstermektedir.

Bu şekilde görüldüğü üzere, p53 stabil p53 knockdown yoluyla uzaklaştırıldığında, hücreler mitozu terk ettikten sonra duraklamak yerine, duraklamak yerine ikinci bir mitoz evresine girdikleri ve bölünme gerçekleşmeden mitozu terk ettikleri tekrarlayan döngülere girerler. Burada, kromatin belirteci Histone 2b'nin mCherry'ye ve beta tubulin'in EGFP'ye füzyon edilmiş halini stabil olarak eksprese eden serviks karsinomu türevli HeLa hücreleri gösterilmektedir. Mikrotübül stabilize edici ilaç paklitaksel ile tedavi edildiklerinde, mitoz sırasında kromozom dizilimi ve ayrışması bozulur; bu durum, DNA hasarına meyilli nükleer şişkinliklerin ve mikronükleusların oluşumuyla sonuçlanır.

Bu hücre hattı, CDT1 için turuncu ve geminin için yeşil renkli iki floresan ubikitin hücre döngüsü göstergesini stabil olarak ko-eksprese eder ve hücre döngüsü boyunca normal şekilde ilerler. Aynı hücreler CDK46 inhibitörü ile etkileşime girdiğinde, hücreler G2 fazından geçer ve normal şekilde bölünür, ardından G1 fazında güçlü bir şekilde duraklar; bu durum, büyüyen tümörlerde etkili sitostatik etkiler oluşturma potansiyelini göstermektedir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir hücrenin yanıtını çıkarım yapmak yerine, günlerce süren bir süreçte gerçek zamanlı olarak doğrudan takip edebilmenizdir.