Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Bu prosedürün genel amacı, optik fiberler kullanılarak damlacık mikroakışkan floresan tespitinin basit bir uygulamasını göstermektir. Bu yöntem, nadir fenotiplerin tanımlanması ve enzimlerin yönlendirilmiş evrimi gibi yüksek verimli biyolojik taramadaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, damlacık mikroakışkanlarında floresan tespitinin basit ve ucuz bir uygulamasına izin vermesidir.

Başlamak için, önceden temizlenmiş üç inç çapında bir silikon gofret yerleştirin bir spin kaplayıcının vakum aynasına. Ardından, gofretin ortasına bir mililitre SU-8 3050 uygulayın ve 80 mikrometre kalınlığında bir fotorezist tabakası sağlamak için gofreti döndürün. Kaplanmış gofreti sıkma kaplayıcıdan çıkarın ve önceden 135 dereceye ısıtılmış bir ocak gözüne yerleştirin.

30 dakika sonra gofreti çıkarın ve tekrar oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Ardından, gofreti düz bir yüzeye yerleştirin ve ilk katman maskesini gofret üzerine hizalayın. Gofret'i üç dakika boyunca toplanmış 190 miliwatt, 365 nanometre LED altında maruz bırakın.

Maruz kaldıktan sonra, gofreti bir dakika boyunca 135 santigrat derecelik bir ocak gözüne yerleştirin ve ardından oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Soğuduktan sonra, gofreti tekrar döndürme kaplayıcıya yerleştirin ve aynaya yapıştırın. Gofretin ortasına ilave bir mililitre SU-8 3050 uygulayın ve 500 rpm'de 20 saniye döndürün.

ardından 5.000 rpm'de 30 saniye gelir. Ardından, gofretleri bir ocak gözünde pişirin. Tekrar oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve ardından maske hizalama yüzeyine geri yerleştirin.

İkinci katman maskesini gofret üzerindeki desenli hizalama işaretleriyle manuel olarak hizalamak için diseksiyon kapsamını kullanın. Düzgün bir şekilde hizalandıktan sonra, kaplanmış gofreti daha önce olduğu gibi aynı koşulları kullanarak 4-1 / 2 dakika maruz bırakın. Maruz kaldıktan sonra, gofreti bir dakika boyunca 135 santigrat derecede bir ocak gözüne yerleştirin, ardından gofreti soğutun ve tekrar sıkma kaplayıcısına yapıştırın.

Gofrete üçüncü kez bir mililitre SU-8 3050 uygulayın ve 100 mikrometre daha fotorezist eklemek için döndürün. Gofretleri çıkarın ve 135 derecelik bir ocak gözünde 30 dakika pişirin. Ardından oda sıcaklığına soğutun ve hizalama yüzeyine yerleştirin.

Üçüncü katman maskesini önceki geometri ile hizalayın ve önceki koşulları kullanarak kaplanmış gofreti dokuz dakika boyunca açığa çıkarın. Maruz kaldıktan sonra, gofreti bir dakika boyunca 135 santigrat derecelik bir ocak gözüne yerleştirin ve ardından oda sıcaklığına soğutun. Soğuduktan sonra, gofreti 30 dakika boyunca karıştırılmış bir geliştirici banyosuna batırarak maskeleri geliştirin.

Son olarak, gofreti izopropanol içinde yıkayın ve ardından 135 santigrat derecede bir ocak gözünde son bir kez bir dakika pişirin. Geliştirilen master'ı kalıplanana kadar 100 milimetrelik bir Petri kabında saklayın. Plastik bir kapta 50 gram silikon baz ile beş gram kürleme maddesini birleştirerek 10:1 PDMS karışımı hazırlayın.

İçeriği döner bir aletle karıştırın ve ardından kurutucu içindeki karışımı 30 dakika veya tüm hava kabarcıkları çıkana kadar gazdan arındırın. Gazdan arındırılmış PDMS'yi üç milimetre kalınlık verecek şekilde hazırlanan master'ın üzerine dökün. Ardından, daha fazla gaz giderme için Petri kabını desikatöre geri yerleştirin.

Tüm baloncuklar çıkarıldıktan sonra cihazı 80 derecede 80 dakika pişirin. Soğuduktan sonra, hem 120 mikrometre hem de 220 mikrometre telegeometrilere cihazın yanından erişilebilmesi için cihazı bir neşter kullanarak kalıptan kesin. Daha sonra sıvı giriş ve çıkışlarını 0,75 mm'lik bir biyopsi zımbası ile delin.

Plazma, cihazı 300 watt'lık bir plazma temizleyicide 20 saniye boyunca önceden temizlenmiş bir cam sürgü ve 1 milibar oksijen plazması ile birlikte özellikli tarafı yukarı bakacak şekilde işlemden geçirin. PDMS cihazının desenli tarafını cam sürgünün plazma ile muamele edilmiş tarafına sıkıca yerleştirerek cihazı yapıştırın. Ardından, cihazı 80 santigrat derecelik bir cihaz fırınına yerleştirin ve monte edilmiş cihazı 40 dakika boyunca geri koyun.

Pişirildikten sonra, kanalları hidrofobik hale getirmek için cihazı florlu bir yüzey işleme sıvısı ile yıkamak için bir şırınga kullanın. Ardından, çözücüyü buharlaştırmak için cihazı hemen 80 derecede 10 dakika pişirin. Optik fiberlerin son beş milimetresinden yalıtımı çıkararak iki lazer uyarma fiberi hazırlayın.

Ayrıca, daha büyük bir optik fiberin son beş milimetresinden yalıtımı çıkararak fiberi floresan sinyali toplamak için hazırlayın. Tüm liflerin uçlarını mikroskop altında inceleyin. Uçlar düz bir yüzeyde bitmiyorsa, uçları bir elyaf çizici ile kesin.

Ardından, 50 miliwatt, 405 nanometre lazere bir lazer fiber kuplör takın ve 105 mikrometre çekirdek fiberlerinden birini lazere takın. Sensörün soyulmuş ucunu bir lazer güç ölçerin yönlendirin ve lazer gücünü en üst düzeye çıkarmak için lazer kuplörün ince ayarlarını kullanın. 50 miliwatt, 473 nanometre lazer kullanarak diğer fiberi ayarlamak için aynı işlemi gerçekleştirin.

Ardından, lazer ışığını engellemek ve yayılan floresansı iletmek için lens tüplerini kullanarak fotoğraf çarpan tüpüne dörtlü bir bant geçiren filtre monte edin. Işığın fotoğraf çarpan tüpüne çarpmadan önce filtrelerden geçmesi için bir fiber kuplör takın. Ardından, toplama fiberini fiber kuplöre takın.

Fabrikasyon mikroakışkan çipi, en az 100 mikrosaniye deklanşör hızına sahip bir dijital kamera ile birleştirilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Yanlardan dikkatlice çalışarak, 473 nanometre lazere bağlı fiberi en uzak yukarı akış 120 mikrometre kanalına yerleştirin. Ana akış kanalını delmemeye dikkat edin.

Ardından, 405 nanometre lazere bağlı fiberi, 300 mikrometre fiber aralığı sağlayarak en uzak aşağı akış 120 mikrometre yüksekliğindeki yan kanala yerleştirin. Son olarak, daha büyük foto çarpan tüpüne bağlı fiberi, iki lazer uyarma fiberine normal olan 220 mikrometre yüksekliğindeki kanala yerleştirin. % 2 iyonik florosüraktif madde içeren HFE 7500 ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırıngayı doldurun ve PE2 hortumu kullanarak algılama cihazının ara yağ girişine monte edin.

Daha sonra, bir şırıngayı karışık bir FITC ve mavi boya emülsiyonu ile doldurun ve PE2 hortumu kullanılarak damlacık reenjeksiyon girişi olarak cihaza bağlı dikey olarak yönlendirilmiş bir şırınga pompasına monte edin. Cihaz çıkışından bir atık kabına uzun bir PE boru bağlayın. Ardından, hem yağ hem de damlacıkların cihazda düzenli olarak birleştiği ve aşağı akışta aktığı görülene kadar pompaların her birini saatte 1.000 mikrolitre hızla çalıştırarak cihazı doldurun.

Akış hızlarını, ara parça yağı saatte 6.000 mikrolitre ve damlacıklar saatte 100 mikrolitre çalışacak şekilde ayarlayın ve algılama bölgesinden geçen damlacıklar arasında önemli bir boşluk bırakın. Ardından, lazerleri açın ve veri edinme programını başlatın. Ardından, temel gürültü tabanının 100 katından daha fazla olan sinyaller sağlamak için fotoğraf çarpan tüpü kazancını ayarlayın.

Son olarak, lazer gücünü, tüm çift tepe noktaları tek, doğrusal ölçekli bir zaman izinde net bir şekilde görülebilecek şekilde ayarlayın. Algılama kanalından akan bir damlacık, lazer bağlantılı optik fiberlerin her birinin önünde ayrı uyarma bölgeleriyle karşılaşır. Algılama fiberi, bir damlacığın bir uyarma bölgesinden diğerine geçmesi için geçen süre ile ilişkili bir tepe ayrımı ile zamansal bir kayma ile yayılan floresanı kaydeder.

Bu, daha fazla ışık filtreleme ve ayrı fotoğraf çarpan tüplerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Tespit şemasının etkinliği, 405 nanometre ve 473 nanometrede uyarılan boyalar içeren karışık bir damlacık emülsiyonu tespit edilerek test edildi. Bu grafik, kabaca 50 hertz'de akarken yeniden enjekte edilen dört damlacık türü arasındaki net ayrımı göstermektedir.

Dedektörün dinamik aralığı ve mutlak hassasiyeti, sadece floresein damlacıkları ölçülerek araştırıldı. Veriler, sistemin 0,1 ila 100 nanomolar arasında değişen boya konsantrasyonlarını tespit etme yeteneğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bir dizi yerleştirilmiş optik fiber ve tek bir fotoğraf dedektörü kullanarak basit ve kompakt bir floresan algılama sisteminin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.