Name: Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Öğrenin damlacık mikroakiskanlarda optik elyaf kullanarak çok renkli floresan algılama yöntemini. Bu teknik yüksek verimli biyolojik tarama ve enzim evrimi çalışmaları için basit ve uygun maliyetli bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, 84389.01.44908 numaralı DARPA hibesi, bir NSF KARİYER ödülü (DBI-1253293), bir NIH keşif/gelişimsel araştırma hibesi (CA195709) ve NIH Yeni Yenilikçi Ödülleri (HD080351, DP2-AR068129-01) ve UCSF kaynak tahsis programından bir New Directions hibesi ile desteklenmiştir.

1. SU8 Ana Fabrikasyon <ol><li> tasarım yazılımı kullanarak üç katmanlı imalat için mikroakışkan yapıları tasarlamak ve 10 mikron çözünürlükte devre kartı film üzerine bir satıcı tarafından basılan tasarımları var. Cihaz tasarımı detayları ekli referans 6&#39;da verilmiştir ve kanal geometrileri, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Katmanlar, her imalat tabaka 8&#39;den özellikleri yan yana koymak yardımcı hizalama işaretleri içermelidir. </li><li> spin kaplayıcı bir ön temizliği 3 inç çaplı silisyum gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 80 um bir tabaka kalınlığına sağlayan 1,750 rpm&#39;de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır. </li><li> gofret çıkarın ve 30 dakika süre ile 135 ° C sıcak plaka üzerinde pişirilir. gofret sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Bir paralel 190 m altında 1. katman maskesine kaplı gofret Açığa3 dakika için LED mil W, 365. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 1 dakika boyunca oda sonra serin bir 135 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin. </li><li> Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 40 um&#39;lik bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka ile sonuçlanan, 5,000 rpm&#39;de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın. </li><li> 1.3 desenli geometri üzerine 2. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 4 dakika 30 saniye boyunca 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin. </li><li> Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. daha sonra, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde 30 SU8-3050 1 ml uygulamasan 1000 rpm&#39;de, 100 um bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka elde edilir. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın. </li><li> 1.3 desenli geometri üzerine 3. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 9 dakika süreyle 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin. </li><li> 30 dakika boyunca, propilen glikol monometil eter asetat içinde karıştırılan bir banyoda daldırarak maskeleri geliştirir. 1 dakika için 135 ° C bir sıcak plaka üzerindeki izopropanol ve fırında gofret yıkayın. polidimetilsiloksan (PDMS) kalıplama için 100 mm Petri kabındaki geliştirilen usta yerleştirin. </li></ol> 2. PDMS Cihaz İmalatı <ol><li> plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g silikon taban 50 g birleştirerek 1 PDMS: 10 hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir döner aracı ile içeriğini karıştırın. deg30 dakika boyunca bir desikatör içinde karışım olarak veya tüm hava kabarcıkları bertaraf kadar devam eder. </li><li> Master üzerinde 3 mm kalınlığında vermek ve daha fazla gaz alma için desikatörde geri yerleştirmek için PDMS dökün. Bir kez tüm kabarcıklar kaldırılır, 80 dakika boyunca 80 ° C &#39;de cihaz fırında. </li><li> desenli tarafı ile temiz bir yüzey üzerinde bir neşter ve yer kullanarak kalıp cihazı kesin ve 0.75 mm&#39;lik biyopsi yumruk ile akışkan giriş ve çıkış yumruk. 120 mikron ve 220 mikron boyunda geometrileri cihazın yan erişilebilir, böylece cihaz kesmek gerekir. </li><li> Plazma 300 W plazma temizleyici 20 saniye boyunca 1 mbar O 2 plazmada 3 inç cam slayt tarafından önceden temizlenmiş 2 inç ile birlikte yukarı özelliği tarafı, cihazı davranın. cam slayt plazma ile işlenmiş yüzüne PDMS cihazın desenli tarafını yerleştirerek PDMS cihaz Bond. 80 ° C sıcaklıkta fırında Cihazı ve 40 dakika boyunca monte edilmiş cihazın fırında. </li><li> kanal Renderflorlanmış bir yüzey işleme sıvısı ile cihaz temizlemek için bir şırınga kullanılarak hidrofobik. 10 dakika çözücünün buharlaşması için hemen 80 ° C&#39;de cihazı fırında. </li></ol> Optik Bileşenleri 3. hazırlanması <ol><li> 105 mikron çekirdek, 125 mikron kaplama son 5 mm yalıtımı kaldırarak lazer uyarma lif hazırlayın, NA 0.22 fiber optik =. </li><li> Bir 2. özdeş elyaf için 3.1 tekrarlayarak 2. renkli lazer uyarma fiber hazırlayın. </li><li> 200 mikron çekirdek, 225 mikron kaplama için 3.1 yineleyerek floresan sinyalini toplamak için fiber hazırlayın, NA 0.39 fiber optik =. </li><li> ipuçları düz bir yüzeye sona yoksa, bir lif çubukla uçları yeniden tutunmaya - tüm liflerin ipuçlarını inceleyin. </li><li> 50 mW, 405 nm lazer lazer fiber bağlayıcı takın ve lazer 105 mikron çekirdek liflerinin birini ekleyin. Lazer gücünün sensörüne elimden ucunu yönlendirinmetre ve lazer gücünü maksimize etmek lazer coupler ince ayar kullanın. </li><li> 50 mW, 473 nm lazer için 3.5 tekrarlayın. </li><li> Lazer ışığı bloke ve yayılan floresan iletmek için objektif tüpleri kullanarak PMT bir 446/510/581/703 nm dört band geçiren filtreler monte edin. o ışık PMT isabet önce filtreler üzerinden geçecek, böylece fiber kuplörünü takın. </li><li> 3.7 toplandı birimine 3.3 ile fiber takın. </li></ol> 4. Çevrim karıştırılmış bir emülsiyon Üretim <ol><li> 60 mm x 60 mm delik bir akış odak Mikroakiskan dropmaker cihazı edinin. </li><li> % 2 iyonik fluorosurfactant 9 HFE 7500 yağlar ile 1 ml şırınga doldurun. </li><li> 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM: floresein aşağıdaki birleşimleri (FITC) ve dekstran-konjuge mavi boyalar PBS (CB) 1 ml şırınga bir dizi doldurun CB, ve 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> ters MICROS sahnede dropmaker cihaz montebaş ve şırınga pompalarında sulu ve yağlı şırınga. Çift PE-2 boru kullanan cihazlar için şırınga. </li><li> 500 ul / sulu çözeltiler için bir yağ, 250 ul / saat saat sonra şırınga pompaları çalıştıran, 4.3 çözümler içeren 80 um damlacıkların bir karışım oluşturmak. Sulu örneğin her türü için, çapraz bulaşmayı önlemek için yeni bir dropmaker cihazı kullanın. Boş şırıngaya Her bir boya kombinasyonu emülsiyon ~ 200 ul toplayın. </li><li> 4 damlacıklar türleri tek bir koleksiyon şırınga içinde toplanmıştır sonra, defalarca şırınga çevirerek emülsiyonu karıştırın. </li><li> Tekrar sulu çözeltiler, PBS içinde 0.1, 1, 10 ve 100 nM FITC içeren 4.2-4.6 adımları tekrarlayın. </li></ol> 5. Fiber Optik Ekleme <ol><li> &lt;100 mikro-saniye deklanşör hızları yeteneğine sahip dijital kamera ile birleştiğinde ters bir mikroskop sahnede 2. adımda imal mikroakışkan çip yerleştirin. </li><li> yan, INSE dikkatle ÇalışmaAna akış kanalı aracılığıyla ponksiyon özen uzak yukarı 120 mikron kanalı içine 473 nm lazer bağlanmış lif rt. </li><li> , Uzak aşağı 120 mikron yüksek yan kanalı içine 405 nm lazer bağlanmış lif eklemek 300 mikron fiber boşluk sağlar. </li><li> iki lazer uyarım lifleri normal 220 mikron boyunda kanala PMT-birleştiğinde lif yerleştirin. </li></ol> Karışık Emülsiyonlar 6. Floresan Algılama <ol><li> PE-2 boru ile bir algılama cihazı aralayıcı yağı girişine% 2 iyonik fluorosurfactant HFE 7500 dolu bir 5 ml şırıngaya monte edin. </li><li> PE-2 boru kullanılarak cihazın damlacık reenjeksiyon girişine bir dikey olarak yönlendirilmiş şırınga pompa ve çift karışık FITC / CB emülsiyonu içeren şırınga monte edin. atık konteynerine cihaz çıkışından PE-2 boru uzunluğu bağlayın. </li><li> Her iki kadar 1.000 ul / saatte pompaların her çalıştırarak Başbakan cihazYağ ve damlacıkları düzenli cihazda birleştiren ve aşağı akan görülmektedir. </li><li> algılama bölgeye seyahat damlacıklar arasında önemli bir boşluk sağlar boşluk yağı 6.000 ul / saat hızında çalışır şekilde debileri ve 100 ul / saatte damlacıklarını ayarlayın. </li><li> , Lazerler açmak veri toplama programını başlatın ve bazal gürültü zemin 100x daha vardır sinyalleri sağlamak için PMT kazancı ayarlayın. duble zirveleri tek bir doğrusal ölçekli timetrace üzerinde açıkça görülebilir şekilde lazer gücünü ayarlayın. </li><li> en az 20 kHz PMT gerilim timetrace 60 saniye kazanır. Böyle Matlab olarak bilgisayar programına veri almak ve özel bilgisayar programı komut kullanılarak kaydedilen çifti zirvelerinden yükseklikleri ölçülür. Not: Bu ilave bilgi olarak verilmektedir. </li><li> Tekrarlayın 405 nm lazer kapalı olan, 4,7 oluşturulan FITC sadece karışık emülsiyon kullanılarak 6.2-6.7 adımları. </li></ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+Enables+Digital+Detection+of+RNA+with+Droplet+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR.</a> PLOS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+and+modular+multicolour+fluorescence+detector+for+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).</li>
<li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+droplet-based%2C+optofluidic+device+for+high-throughput%2C+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li>
<li>Lithography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html">https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html</a> (2015).</li>
<li>DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Biocompatible+Oil-Water+Interfaces+without+Synthesis%3A+Direct+Interactions+between+Primary+Amines+and+Carboxylated+Perfluorocarbon+Surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants.</a> Anal Chem. 85 (21), (2013).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882(2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li>
<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Fiber optik algılama akışkan kanal ile ilgili olarak, optik fiberlerin hizalanmasını gerektirir. Bizim cihaz çok tabakalı fotolitografiyle imal kılavuz kanalları kullandığından, birbirlerine göre olan maske yerleştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Fiber kılavuz kanallar sıvı kanala çok yakın ise, sıvı sızması için bir potansiyel var; kılavuz kanallar çok uzakta bulunan ya da hizadan ise, algılama fiber tarafından toplanan floresan sinyali önemli ölçüde azalabilir. Tam hizalama fotoğraf desen sırasında birlikte bulunduğu...

Damlacık Mikroakiskan bir taşıyıcı yağ 1 içinde süspansiyon haline sulu damlacıkların çok sayıda deney bölümlere yüksek verimli biyoloji için bir platform sağlar. Damlacıklar tek bir hücre analizi 2, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 3 gibi çeşitli uygulamalarda kullanılan ve evrim 4 enzim edilmiştir. Parlak sinyaller ve hızlı zaman yanıtı kilohertz oranlarında alt nanoliter damlacık hacimleri tespit uyumlu olarak Floresan tahlilleri, damlacık Mikroakiskan için algılama standart modu bulunmaktadır. Birçok uygulama, aynı anda en az iki renk için floresans algılama gerektirir. Örneğin, bizim laboratuar yaygın bir tahlil sonucu için bir algılama kanalı kullanmak damlacık sıralama deneyleri PCR aktive gerçekleştirir ve 5 tahlil negatif damlacık sayılabilir yapmak için ikincil bir arka plan boya kullanır. damlacık Mikroakiskan için tipik algılama istasyonları ba vardırEpifloresans mikroskoplar üzerinde sed ve numune odaklı olmak mikroskop içine boş alan lazerler uyarma ışık tanıtmak için ışık manipülasyonlar düzenleri karmaşık gerektirir. floresan bir damlacık yayılan sonra her algılama kanalı dalgaboyu bandında merkezli bir photomultiplier tüp (PMT) kullanır, böylece yayılan fluoresced ışık süzülür. Epifloresans mikroskop tabanlı optik algılama sistemleri nedeniyle gider, karmaşıklık girişine bir bariyer sağlar ve bakım gereklidir. Optik fiberler fiberler elle ayna tabanlı ışık yönlendirme ihtiyacını ortadan kaldırarak, ve ışık yolları fiber optik konnektörleri kullanarak arabirim sağlayan mikroakışkan cihazlar eklenebilir çünkü araçlar, basitleştirilmiş ve sağlam algılama düzeni inşa etmek sağlarlar. Bu yazıda, optik fiberler An bir dizi kullanarak çok renkli floresan algılama gerçekleştirmek için kompakt ve modüler bir düzeni montaj ve doğrulama tarifda tek fotodetektör 6. Optik fiberler bağımsız lazer bağlanır ve düzenli mekansal uzaklıklar bir L şeklinde bir akış kanalına dik yerleştirilir. Bir flüoresan toplama fiber uyarım bölgelerine paralel yönlendirilmiş olan ve tek bir PMT bağlanır. Bir damlacık farklı zamanlarda lazer ışınları geçer, çünkü PMT tarafından kaydedilen veriler zamansal kullanıcı damlacık her ayrı lazer ışını tarafından heyecan sonra yayılan floresan ayırt sağlar ofset gösterir. Bu zamansal kayma dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler bir dizi kullanarak ayrı Proje Yönetim Ekipleri yayılan ışık ayırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Dedektörün etkinliğini doğrulamak için, biz farklı renk ve konsantrasyon boyalar encapsulating damlacık popülasyonlarında floresan ölçmek. sistemin duyarlılığı tek renkli floresan saptama için incelenmiş, ve 0.1 nM bir 200x hassasiyet göstr kadar konsantrasyonlarda damlacıklar tespit edilebildiğini gösterirLiteratürde 7 bildirilen son elyaf bazlı yaklaşımlar karşılaştırıldığında ovement.

<table><tbody><tr><td>Fotoğraf maskeleri</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" silikon gofretler, P tipi, bakire test sınıfı</td><td>Üniversite Gofretleri</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon elastomer kiti</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>10 ml şırınga</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 gaugue iğnesi</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 polietilen boru</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Yaygın olarak HFE 7500</td></tr><tr><td>İyonik Krytox Yüzey Aktif</td><td></td><td></td><td>Madde olarak bilinir Ref #10'da sentez talimatları</td></tr><tr><td>Dekstran konjuge kaskad mavi boya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Floresein sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Dörtlü bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Fiber bağlantı noktası</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>lens tüpü</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>200 & # 956 ile yama kablosu; M Çekirdek / 225 &#956; 105 & # 956 ile Thorlabs Özel Yama kablosu, bir soyulmuş uç ve bir FC / PC konektörü ile m kaplama fiber</td><td></td><td></td> optik;<td></td></tr><tr><td> M Çekirdek / 125 &#956; bir soyulmuş uçlu ve bir FC/PC konektörlü m kaplama fiber optik</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 & # 956; m elyaf sıyırma aleti</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 & # 956; m fiber sıyırma aleti</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>lazer fiber adaptörü</td><td>OptoEngine</td><td>FC / PC Adaptörü</td><td></td></tr><tr><td>50 <'de 405 nm CW lazer; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>CNI lazerler için</td></tr> distribütör <tr><td>473 nm CW lazer 50&nbsp; mW</td><td>OptoMotor</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

damlacık mikroakiskan için renkli floresan algılama optik elyaf kullanma

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Floresan deneyleri, parlak sinyalleri ve hızlı zaman tepkileri nedeniyle damlacık mikroakışkanlarında kullanılan en yaygın okumalardır. Multipleks deneyleri, enzim evrimi ve moleküler biyoloji ile geliştirilmiş hücre sınıflandırması gibi uygulamalar, iki veya daha fazla floresan renginin tespit edilmesini gerektirir. Boş alan lazerlerini epifloresan mikroskoplara bağlayan standart çok renkli algılama sistemleri hantal, pahalı ve bakımı zordur. Bu yazıda, optik fiberlere bağlı lazerlerle bir mikroakışkan kanalın heyecan verici ayrık bölgeleri ile çok renkli algılama gerçekleştirmek için bir şema açıklıyoruz. Yayılan ışık, tek bir fotodetektöre bağlı bir optik fiber tarafından toplanır. Uyarılma farklı uzamsal konumlarda meydana geldiğinden, yayılan ışığın kimliği zamansal bir kayma olarak kodlanabilir ve daha karmaşık ışık filtreleme şemalarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Sistem, dört benzersiz boya kombinasyonu içeren damlacık popülasyonlarını tespit etmek ve nanomolar altı floresein konsantrasyonlarını tespit etmek için kullanılmıştır.

Optik fiberlerin yerleştirilmesi için izin veren bir PDMS cihazın imalatı değişen yükseklik (Şekil 1) kanalları oluşturmak için çok adımlı bir fotolitografi prosedürü gerektirir. İlk olarak, SU-8 80 um boyunda tabaka silikon yonga üzerine bükülmüş ve akışkan geometrisini oluşturmak için bir maske kullanılarak şekillendirilmiştir. Sonraki, SU-8 ek 40 mikron katman gofret üzerine bükülmüş ve 120 mikron boyunda lazer fiber ekleme kanalları oluşturacak özellikleri oluşturmak...

Damlacık mikroakışkanlarında çok renkli floresan algılama, tipik olarak hacimli ve karmaşık epifloresan mikroskobu tabanlı algılama sistemlerini içerir. Burada, tek bir fotodetektör tarafından toplanan çok renkli verileri geçici olarak kodlamak için bir dizi optik fiber kullanan kompakt ve modüler çok renkli bir algılama şemasını açıklıyoruz.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Bu prosedürün genel amacı, optik fiberler kullanılarak damlacık mikroakışkanlar floresan tespitinin basit bir uygulamasını göstermektir. Bu yöntem, nadir fenotiplerin tanımlanması ve enzimlerin yönlendirilmiş evrimi gibi yüksek verimli biyolojik taramadaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, damlacık mikroakışkanlarda floresan tespitinin basit ve düşük maliyetli bir uygulamasını mümkün kılmasıdır.Başlamak için, önceden temizlenmiş üç inç çapındaki bir silikon gofretle spin coater'ın vakum tablasına yerleştirin. Ardından, gofretin merkezine bir mililitre SU-8 3050 uygulayın ve 80 µm kalınlığında bir fotoresist tabakası oluşturmak için gofreti döndürün. Kaplanmış gofreti spin coater'dan çıkarın ve 135 °C'ye önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerine yerleştirin.30 dakika sonra wafer'ı çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Ardından, wafer'ı düz bir yüzeye yerleştirin ve ilk katman maskesini wafer üzerine hizalayın. Wafer'ı, kolime edilmiş 190 milliwatt, 365 nanometre LED altında üç dakika boyunca pozlayın.Pozlamadan sonra, wafer'ı bir dakika boyunca 135 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı plakaya yerleştirin ve ardından oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Soğuduktan sonra, wafer'ı tekrar spin coater'a yerleştirin ve chuck'a sabitleyin. Wafer'ın merkezine bir mililitre daha SU-8 3050 uygulayın ve 500 r.p.m. hızda 20 saniye boyunca döndürün.ardından 5,000 r.p.m. hızda 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, wafer'ı bir ısıtıcı plaka üzerinde pişirin. Oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin ve ardından tekrar maska hizalama yüzeyine yerleştirin.İkinci katman maskesini, gozlem mikroskobu kullanarak wafer üzerindeki desenli hizalama işaretlerine manuel olarak hizalayın. Doğru şekilde hizalandıktan sonra, kaplanmış wafer'ı öncekiyle aynı koşulları kullanarak 4-1/2 dakika boyunca ışımaya maruz bırakın. Işıma işleminden sonra, wafer'ı bir dakika boyunca 135 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tablaya yerleştirin, ardından wafer'ı soğutup tekrar spin coater üzerine sabitleyin.Wafer üzerine üçüncü kez bir mililitre SU-8 3050 uygulayın ve 100 micrometers ek fotoğrafrezist eklemek için spin kaplama yapın. Wafer'ı çıkarın ve 135 °C sıcaklıktaki bir hotplate üzerinde 30 dakika boyunca pişirin. Ardından, oda sıcaklığına soğutun ve hizalama yüzeyine yerleştirin.Üçüncü katman maskesini önceki geometriyle hizalayın ve kaplanmış gofretle önceki koşulları kullanarak dokuz dakika boyunca pozlama yapın. Pozlama sonrası, gofreti bir dakika boyunca 135 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirin ve ardından oda sıcaklığına kadar soğutun. Soğuma tamamlandığında, gofreti 30 dakika boyunca karıştırılan bir geliştirici banyosuna daldırarak maskeleri geliştirin.Son olarak, gofretle isopropanol ile yıkayın ve ardından bir sıcak plakada 135 °C'de bir dakika boyunca son kez pişirin. Geliştirilmiş ana kalıbı, kalıplama işlemine kadar 100 mm'lik bir Petri kabında saklayın. Bir plastik bardakta 50 g silikon tabanı beş g kürleme ajanı ile birleştirerek 10:1 oranında bir PDMS karışımı hazırlayın.İçerikleri bir döner karıştırıcı ile karıştırın ve ardından karışımı bir desikatör içerisinde 30 dakika boyunca veya tüm hava kabarcıkları giderilene kadar vakumlayın. Gazı alınmış PDMS'yi, üç milimetre kalınlık oluşturacak şekilde hazırlanmış kalıbın üzerine dökün. Ardından, daha fazla gaz giderme işlemi için Petri kabını tekrar desikatöre yerleştirin.Tüm kabarcıklar giderildikten sonra, cihazı 80 °C'de 80 dakika boyunca pişirin. Soğuduktan sonra, hem 120 µm hem de 220 µm telegeometrilerin cihazın yan tarafından erişilebilir olacağı şekilde cihazı bir skalpel kullanarak kalıptan kesin. Ardından, 0,75 mm'lik bir biyopsi pançı ile akışkan girişlerini ve çıkışlarını delin.Önceden temizlenmiş bir lamla birlikte, cihazın desenli yüzeyi yukarı bakacak şekilde, 300 watt'lık bir plazma temizleyicide 1 milibar oksijen plazması ile 20 saniye boyunca plazma işlemi uygulayın. PDMS cihazının desenli tarafını, lamın plazma işlem görmüş tarafına sıkıca yerleştirerek cihazı yapıştırın. Ardından, cihazı 80 derece Celsius sıcaklığındaki bir cihaz fırınına yerleştirin ve monte edilmiş cihazı 40 dakika boyunca bekletin.Pişirme işlemi tamamlandıktan sonra, kanalları hidrofobik hale getirmek için cihazı bir şırınga yardımıyla florlanmış bir yüzey işlem sıvısıyla yıkayın. Ardından, solventin buharlaşması için cihazı hemen 80 °C'de 10 dakika boyunca pişirin. Optik fiberlerin son beş milimetrelik kısmındaki yalıtımı kaldırarak iki lazer eksitasyon fiberi hazırlayın.Ayrıca, daha geniş bir optik fiberin son beş milimetrelik kısmındaki yalıtımı kaldırarak fiberi floresan sinyalini toplamak için hazırlayın. Tüm fiberlerin uçlarını bir mikroskop altında inceleyin. Uçlar düz bir yüzeyle bitmiyorsa, uçları bir fiber çizici ile yeniden düzeltin.Ardından, 50 milliwatt, 405 nanometre bir lazere bir lazer fiber kuplörü takın ve 105 mikrometre çekirdekli fiberlerden birini lazere bağlayın. Soyulmuş ucu bir lazer güç ölçerin sensörüne yönlendirin ve lazer gücünü maksimize etmek için lazer kuplörünün hassas ayarlarını kullanın. 50 milliwatt, 473 nanometre bir lazer kullanarak diğer fiberi ayarlamak için aynı işlemi gerçekleştirin.Ardından, lazer ışığını engellemek ve yayılan floresansı iletmek için lens tüplerini kullanarak fotomultiplier tüp üzerine bir quad bandgeç filtresi yerleştirin. Işığın fotomultiplier tüpe ulaşmadan önce filtrelerden geçmesini sağlayacak şekilde bir fiber kuplör takın. Sonra, toplama fiberini fiber kuplöre bağlayın.Hazırlanan mikroakışkan çipi, en az 100 mikrosaniye enstantane hızına sahip bir dijital kameraya bağlı olan ters bir mikroskobun tablasına yerleştirin. Yanlardan dikkatlice çalışarak, 473 nanometre lazerle eşleştirilmiş fiberi, akış yönünde en yukarıda bulunan 120 mikrometrelik kanala yerleştirin. Ana akış kanalını delmemeye özen gösterin.Ardından, 405 nanometrelik lazere bağlı olan fiberi, 300 mikrometre fiber aralığı sağlayacak şekilde, en uzak akış yönündeki 120 mikrometre yüksekliğindeki yan kanala yerleştirin. Son olarak, daha büyük olan fotomultipliyer tüp bağlı fiberi, iki lazer eksitasyon fiberine dik olan 220 mikrometre yüksekliğindeki kanala yerleştirin. %2 iyonik florosürfaktan içeren HFE 7500 ile dolu beş mililitrelik bir şırıngayı doldurun ve PE2 tüpleme kullanarak tespit cihazının ara yağ girişine monte edin.Ardından, bir şırıngayı FITC ve mavi boya karışımlı emülsiyonla doldurun ve PE2 hortum kullanarak damlacık yeniden enjeksiyon girişi olarak cihaza bağlanan, dikey yönlendirmeli bir şırınga pompasına monte edin. Cihaz çıkışından bir atık konteynerine kadar belirli bir uzunlukta PE hortum bağlayın. Daha sonra, hem yağın hem de damlacıkların cihaz içinde düzenli olarak birleştiği ve akış yönünde ilerlediği görülene kadar, her bir pompayı 1,000 µL/saat hızında çalıştırarak cihazı hazırlayın.Ara boşluk yağı saatte 6.000 microliter, damlacıklar ise saatte 100 microliter hızda akacak şekilde akış hızlarını ayarlayarak, deteksiyon bölgesinden geçen damlacıklar arasında belirgin bir boşluk sağlayın. Ardından, lazerleri açın ve veri toplama programını başlatın. Son olarak, bazal gürültü tabanının 100 katından daha yüksek sinyaller elde etmek için fotomultiplier tüp kazancını ayarlayın.Son olarak, tüm dublet pikleri tek bir, lineer ölçekli zaman izinde net bir şekilde görünecek şekilde lazer gücünü ayarlayın. Deteksiyon kanalından akan bir damlacık, lazer kuplajlı optik fiberlerin her birinin önündeki ayrı eksitasyon bölgeleriyle karşılaşır. Deteksiyon fiberi, bir damlacığın bir eksitasyon bölgesinden diğerine geçmesi için geçen süreyle ilişkili bir pik ayrımına sahip zamansal bir kayma ile yayılan floresansı kaydeder.Bu, daha fazla ışık filtreleme ve ayrı fotomültipliyer tüplere olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Tespit şemasının etkinliği, 405 nanometre ve 473 nanometrede uyarılabilen boyalar içeren damlacıklardan oluşan karışık bir emülsiyon tespit edilerek test edilmiştir. Bu grafik, yaklaşık 50 hertz hızla akıtıldığında, yeniden enjekte edilen dört damlacık tipi arasında net bir ayrım olduğunu göstermektedir.Dedektörün dinamik aralığı ve mutlak hassasiyeti, sadece flurorescein içeren damlacıklar ölçülerek incelenmiştir. Veriler, sistemin 0,1 ila 100 nanomolar arasında değişen boya konsantrasyonlarını tespit edebilme yeteneğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, yerleştirilmiş optik fiber dizisi ve tek bir foto dedektör kullanarak basit ve kompakt bir floresan deteksiyon sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Lensless bir çip üzerinde floresan mikroskobu platformu göstermiştir floresan nesneler, örneğin bir ultra-geniş alanda-görünüm görüntü&gt; &lt;4μm çözünürlük çözme algoritması tabanlı bir basınç örnekleme yöntemiyle 0,6-8 cm2. Böyle bir kompakt ve geniş alan floresan çip üzerinde görüntüleme yöntemidir yüksek verimli sitometri, nadir hücre araştırmaları ve mikroarray-analiz için değerli olabilir.

Bir Chip Lensless Floresan Mikroskopi

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Bu video, hücre-hücre temaslarında hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi tespit etmek için floresan dalgalanma spektroskopisinin kullanımını göstermektedir. Bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgilenilen transmembran yapışma reseptörünü eksprese ederek ve spektral olarak ayrılmış iki floresan etiketi barındıran iki farklı hücre popülasyonunu karıştırarak, farklı renkli floresan ile iki komşu hücrenin reseptörleri arasındaki trans-etkileşim, floresan yoğunluğundaki dalgalanmalardaki...

Hücre Temaslarında Protein Etkileşimini İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Floresan çekirdekli microcavity sensörler silika mikrokapilerler kanal yüksek indeks kuantum nokta kaplama kullanır. Kılcal kanal neden içine pompalanan akışkan kırılma indisi değişiklikler kanal orta analiz etmek için de kullanılabilir microcavity floresan spektrum içinde kayar.

Refraktometrik Algılama Floresan çekirdekli mikro kavitasyonlar sentezi ve İşletilmesi

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Bu eser bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmi tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem sunar. Damlacık manipülasyon ve çoklu nükleotid polimorfizmlerinin tespiti de dahil olmak üzere önerilen yöntem, tüm deney ile, ileri araçların yardımı olmadan, 23 ° C civarındaki gerçekleştirilebilir.

Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Protokol, bireysel insan periferik kan mononükleer hücrelerinin sitokin sekresyon dinamiklerini kantitatif olarak ölçmek için gelişmiş bir mikroakışkan platformu tanımlar. Platform, örnek olarak lipopolisakkarit ile uyarılan her bir hücre için paralel olarak üç adede kadar sitokini (IL-6, TNFa ve IL-1β) ölçer.

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım 

Öğrenin damlacık mikroakiskanlarda optik elyaf kullanarak çok renkli floresan algılama yöntemini. Bu teknik yüksek verimli biyolojik tarama ve enzim evrimi çalışmaları için basit ve uygun maliyetli bir çözüm sunar.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Daha fazla video keşfet