Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme
12 Haziran 2016
Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.
Bu prosedürün genel amacı, yüksek çözünürlüklü, intravital multifoton mircrospy aracılığıyla tümör mikroçevresindeki dinamik olayları görselleştirmektir. Bu yöntem, vasküler geçirgenlikte hangi dinamik olayların yer aldığı ve çok hücreli etkileşimler gibi tümör mikro çevresi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tümör mikroçevresindeki olayların kinetiğinin gözlemlenebilmesi ve ölçülebilmesidir.
Prosedüre başlamadan önce, iki foton lazeri ve dedektörler dahil olmak üzere tüm mikroskop ve lazer bileşenlerini açın. Ve sahneyi önceden ısıtmak için ısıtma kutusunu 30 santigrat dereceye ayarlayın. Mikroskop tablasını ve tabla ekini %70 etanol ile silin.
Sahne kuruduğunda, kapak camı ile optik teması sürdürmek için 25 x 1.05 NA mikroskop objektifine büyük bir damla su damlatın ve ek görüntüleme portunun üzerine 1.5 numara kalınlığında bir kapak camı yerleştirin. Ardından, 30 santimetrelik bir polietilen boru parçası kesin. Lastik pedi kapak camının üzerine yerleştirin.
Forseps kullanarak, 31 gauge bir iğneyi plastik bağlantı parçasından çıkarın ve iğne göbeğinin körelmiş ucunu boruya yerleştirin. PE borunun diğer ucuna 31 gauge iğne yerleştirin ve takın. Ardından, bir cc'lik bir şırıngayı steril PBS ile doldurun ve şırıngayı 31 gauge iğneye takın.
Borudaki ve iğnedeki tüm havayı boşaltmak için PBS'yi kullanın. Daha sonra, biri 200 mikrolitre uygun vasküler etikete sahip bir şırınga ve diğeri uygun enjekte edilebilir proteine sahip bir şırınga. Ameliyata başlamadan önce, ayak parmağını çimdiklemeye yanıt vermeden uygun anesteziyi onaylayın ve anestezi uygulanmış fareye göz merhemleri uygulayın.
Daha sonra, kuyruk dolaşımını artırmak için hayvanı bir ısı lambasının altındaki cerrahi bir platforma yerleştirin. İki dakika sonra, kuyruğu %70 etanol ile sterilize edin ve 31 gauge kateterin ucunu yanal kuyruk damarına iki ila üç milimetre yerleştirin. Ardından, iğneyi kuyruğun uzunluğu boyunca damara paralel tutmak için kateterin üzerine bir santimetre uzunluğunda bir laboratuvar bandı yerleştirin.
Kateter sabitlendiğinde, ventral ve tümör yüzeylerini %70 etanol ile temizleyin. Cildi karın üzerine kaldırın ve karın ventral orta hattı boyunca yaklaşık bir santimetre deri altı kesi yapmak için steril makas kullanın ve peritonun delinmesini önlemeye dikkat edin. Tümörü ortaya çıkarmak için meme bezini ve tümörü bağlayan bağ dokusunu peritondan nazikçe kesin.
Daha sonra, makas ve forseps kullanarak, tümörün açıkta kalan yüzeyinden fasyayı ve yağı nazikçe çıkarın. Tümör açığa çıktığında, fareyi önceden ısıtılmış görüntüleme aşamasına aktarın. Kapak camını sabitlemek için laboratuvar bantları kullanın, ardından tümörü mikroskop objektifinin üzerindeki kapak kaymasını kaplayan bir lastik pedin deliğine yerleştirin.
Hayvan pozisyonundayken, dokuyu nemli tutmak ve kapak kaymasıyla, optik teması sürdürmek için lastik ped haznesini PBS ile doldurun. Hayvanın yaşamsal belirtilerini izlemek için boynuna bir nabız oksimetresi prob tasması sensörü yerleştirin ve ısıtma kutusunu hayvanın üzerine yerleştirin. Ardından, tümörün yüzeyindeki floresan tümör hücrelerine ve akan kan damarlarının bulunduğu alana odaklanmak için mikroskop IP'lerini kullanın.
Bir ilgi alanı seçildikten sonra, mikroskobu çoklu foton görüntüleme moduna geçirin ve hedefi istenen başlangıç konumuna taşımak için odak ayarlayıcıyı kullanın. Ardından, z serisinin üst sınırını ayarlamak ve ikinci harmonik üretim kanalındaki tümörün yüzeyindeki kollajen lif ağını görselleştirmek için Z pozisyonu üst düğmesine tıklayın. Ardından objektifi istenen görüntüleme derinliğine getirin ve z serisinin alt sınırını ayarlamak için z konumu alt düğmesine tıklayın.
Ardından, adım boyutu alanlarına istediğiniz değeri girin. Ardından, Zaman Atlama Paneline geçin ve uygun atlama süresini girin. Görüntüleme parametreleri belirlendikten sonra, katetere bağlı şırıngayı bir vasküler etiketleme boyası şırıngası ile değiştirin ve solüsyonun damara girmesine dikkat ederek maksimum 200 mikrolitre boya solüsyonunu yavaşça uygulayın.
Enjeksiyondan sonra, PBS şırıngasını katetere geri koyun ve z adımlı hızlandırılmış görüntülemeye başlayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, PBS şırıngasını enjekte edilebilir proteini içeren şırınga ile değiştirin ve hatta herhangi bir kabarcık sokmamaya dikkat edin. Daha sonra protein süspansiyonunu fareye yavaşça enjekte edin ve şırıngayı PBS içeren bir şırınga ile değiştirin.
Makrofajlar, fagositik mikrofajlarda biriken floresan işaretli 70 kilodalton ve dekstran ile izlenebilir. Tümör hücrelerinin ve mikrofajların ikili olarak etiketlenmesi, bu iki hücre tipi ile doğrudan etkileşimin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. Tümör vasküler geçirgenliğindeki değişiklikleri görselleştirmek için, vasküler boşluğu etiketlemek için kuantum noktaları da kullanılabilir.
Yeterince büyük olduklarından, interarteriyel boşluklardan kolayca yayılmazlar. Sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme, vasküler geçirgenlik olaylarının yakalanmasını ve dekstran ekstravazasyon ve klerens kinetiğinin nicelleştirilmesini kolaylaştırır. Bu örnek görüş alanında, ekstra vasküler TMR sinyali ile kanıtlandığı gibi, vaksküler di-ekstravazasyonun zirvesi 29 ila 34 dakika arasında gözlenir.
Vasküler geçirgenliği indüklemek için ek vasküler boyalar veya proteinler enjekte etmek, vasküler geçirgenliği düzenleyen sinyalizasyon olayları hakkında bilgi sağlayabilir. Gerçekten de, enjeksiyonun ilk birkaç saniyesinde, 10 kilodalton dekstran FITC'nin vaskülatürden ekstravaze olduğu gözlenebilirken, dekstran TMR'deki 155 kilodalton vasküler boşlukla sınırlı kalır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa bir saat içinde tamamlanabilir.
Bu prosedürü denerken, tümörün yüzeyine zarar vermeden bağ dokusunu nazikçe çıkarmayı ve tümör yüzeyini nemli tutmayı unutmamak önemlidir. Bu hücresel dinamik prosedürünü takiben, bu tür tümör hücresi göçü, tümör hücresi göçünün ve intravazasyonun yönlülüğü hakkında ek soruları yanıtlamak için görselleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, intervital multifoton mikroskobu ile bir tümör mikroçevresindeki dinamik seluluar olayların nasıl görselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, tümör mikroçevresindeki dinamik olayları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çok fotonlu mikroskobinin kullanımını açıklamaktadır. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğünde genişletilmiş zaman atlamalı görüntülemeye olanak tanıyarak damar geçirgenliği ve çok hücreli etkileşimler hakkında bilgiler sunar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Mikroskopi
Arka Plan
- Çok fotonlu mikroskopi, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.
- Özellikle canlı dokuların incelenmesinde kullanışlıdır.
- Tümör mikroçevresi karmaşık ve dinamiktir.
- Hücresel etkileşimlerin anlaşılması, kanser araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Tümör mikroçevresindeki dinamik olayları görselleştirmek.
- Vasküler geçirgenliğin kinetiğini ölçmek.
- Çok hücreli etkileşimleri in vivo gözlemlemek.
Kullanılan Yöntemler
- İntravital çok fotonlu mikroskopi.
- Genişletilmiş zamanrağmenli görüntüleme.
- Tek hücre çözünürlüklü teknikler.
- Mikroskobun ve numune tablasının hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Tümör mikroçevresindeki dinamik olaylar başarıyla görselleştirildi.
- Vasküler geçirgenlik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlendi.
- Çok hücreli etkileşimler yüksek çözünürlükte belgelendi.
- Yöntem, olay kinetiğini ölçme yeteneğini kanıtladı.
Sonuçlar
- Çok fotonlu mikroskopi, kanser araştırmaları için güçlü bir araçtır.
- Gerçek zamanlı görüntüleme, tümör biyolojisine dair değerli bilgiler sağlar.
- Bu teknik, kanser dinamikleri konusundaki anlayışımızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Tümör mikroçevresindeki çok hücreli dinamiklerin gerçek zamanlı görselleştirilmesi, metastaz ve anjiyogenezi anlamak için kritik olan vasküler geçirgenlik ve tümör hücresi motilitesi gibi geçici olayların doğrudan gözlemlenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, uç nokta analizlerinin yakalayamadığı kinetik veriler sağlayarak onkoloji hedef doğrulamasında mekanistik risk azaltımını destekler. Stromal-tümör etkileşimlerinin zamansal çözünürlüğünü yakalayarak, bu yöntem preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır ve terapötik adayların önceliklendirilmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tümör ilerlemesini tetikleyen stromal-tümör etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Canlı dokudaki çok hücreli olayların doğrudan gözlemi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Yolak risk azaltma ve portföy önceliklendirmesine bilgi sağlamak için vasküler geçirgenliğin ve hücre hareketliliğinin kinetiğini ölçer.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tümör mikroortamında temel dinamikleri belirleyerek, sonraki tarama aşamaları için doğrulanmış biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Dekstran ekstravazasyonunun ve temizlenmesinin zaman içindeki ölçülebilir çıktıları aracılığıyla analiz standardizasyonunu sağlar.
- Ölçeklenebilirlik Değeri: Boylamsal çalışmalar için standartlaştırılmış cerrahi hazırlık ve görüntüleme parametreleri ile platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Canlı fare modellerinde insan benzeri çok hücreli etkileşimleri yakalayarak hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Preklinik Süreklilik: Vasküler geçirgenliğin kinetik biyobelirteçlerini sağlayarak keşif ve preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Riskten Arındırılmış Kararlar: Tümör mikroçevresi modülasyonunun gerçek zamanlı fonksiyonel okumalarına dayalı olarak devam/dur kararlarının verilmesini sağlar.
İş Akışı ve Süreç Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre olarak, etki mekanizması çalışmalarında fonksiyonel çıktılar şeklinde vasküler geçirgenliğin ve hücresel hareketliliğin kinetik analizine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Tümör hücresi migrasyonunun ve intravazasyon olaylarının yönelimini gerçek zamanlı olarak görselleştirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: 29–34 dakika arasındaki dekstran ekstravazasyon pikleri gibi kantitatif, zamana bağlı çıktılar sağlayarak bileşik etkilerinin karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Analitik: Vasküler permeabilite ve hücresel temizlenmeye yönelik kinetik eğriler oluşturarak doz-yanıt ve hedef etkileşim analizlerini kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Farmakolojik modülasyon sonrası vasküler dinamiklerdeki ölçülebilir değişiklikler aracılığıyla preklinik validasyon ile bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış etiketleme ve cerrahi protokollerle, onkoloji projeleri boyunca tekrarlanan kullanımlar için yeniden kullanılabilir bir intravital görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tümör-stroma sinyal yolaklarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörülebilir güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış vasküler etiketleme, cerrahi hazırlık ve zaman atlamalı görüntüleme parametreleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Etkisiz modülatörlerin erken tespitine olanak tanıyarak geç aşama başarısızlık riskini azaltır ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Gerçek zamanlı vasküler geçirgenlik değişiklikleri üzerinden hedef etkileşimini nicelleştirerek riske göre ayarlanmış ilerlemeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Çok fotonlu mikroskopi, intravital cerrahi ve floresan işaretleme stratejileri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Çok foton kapasiteli mikroskoplara, ayarlanabilir lazerlere ve ikinci harmonik ile floresan kanalları için hassas detektörlere bağımlıdır.
- İşaretleme protokollerinin (örneğin, vaskülarizasyon için kuantum noktaları, makrofajlar için dekstran) ve görüntüleme parametrelerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Tümör modelleri arasında adaptasyon değerlendirmelerini içerir; cerrahi erişimin ve optik pencere uygunluğunun doğrulanmasını gerektirir.
- Uzun süreli görüntüleme sırasındaki fototoksisite riskleri ile sınırlıdır; güç optimizasyonu ve hayvan yaşamsal bulgularının izlenmesini gerektirir.
