Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

Bu prosedürün genel amacı, kimerik antijen reseptörü ile modifiye edilmiş insanlaştırılmış fareler oluşturmaktır. Bu yöntem, HIV enfeksiyonu ve diğer kronik enfeksiyonlar ile malignitelere karşı kök hücre tabanlı mühendislik ürünü immünitenin etkinliğinin test edilmesi hususunda, HIV ve immünoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunlar arasında immün yetmezlik mekanizması ve bağışıklık sistemini geliştirme yolları ile daha iyi antiviral veya antitümör immünite oluşturacak bir tedavinin geliştirilmesi yer almaktadır.

Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda deneysel manipülasyona olanak sağlamasıdır. İnsanlaştırılmış BLT fare modeli, insan immünitesini taklit eder ve bu durumda HIV enfeksiyonuna karşı hücre tabanlı gen tedavileri için klinik öncesi testlerin yapılmasına imkan tanır. Prosedürü laboratuvarımdan teknisyenler olan Valerie Rezek ve Brianna Lam uygulamalı olarak gösterecekler.

Takviye edilmiş RPMI ortamı içeren bir kap içerisinde, timusu skalpel kullanarak yaklaşık bir milimetreküp boyutunda küçük parçalara ayırarak başlayın. Ardından, her bir timus parçasını 96 kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna yerleştirmek için kavisli küt uçlu pensler kullanın. Dokunun kurumaması için tüm kuyucuklara 100-200 µL ortam ekleyin.

Timus dokusu olmayabilecek veya kendisine bağ dokusu yapışmış olan kısımları ayıklamak için dokuyu mikroskop altında inceleyin. Ardından, onaylanan timus parçalarını çıkarıp bir T25 hücre kültürü flaskına aktarın. Flaska yedi mililitre antibiyotikli RPMI besiyeri ekleyin ve karıştırmak için hafifçe sallayın.

Ardından flaskı doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bu adım, dokunun bakteriyel kontaminasyonunu önler. IMDM içeren bir kap içerisinde, karaciğeri iki skapel kullanarak yaklaşık üç milimetreküp boyutunda küçük parçalara bölerek fetal karaciğerden CD34 pozitif HSC'lerin izolasyonuna başlayın.

Beyaz bağ dokusunun tamamını temizleyin ve atın. Ardından, karaciğer parçalarını ve besiyerini çekip 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 16 gauge kör uçlu iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Dokuyu tamamen homojen hale getirmek için beş ila yedi kez daha nazikçe çekip boşaltın.

10 mililitre IMDM medyumu hazırladıktan sonra, bunu kollajenaz, hyaluronidaz, antibiyotikler, Dnaz ve antifungal ile destekleyin. Medyumu 0,22 mikronluk bir filtreden geçirin. Ardından, filtrelenmiş medyumu karaciğer süspansiyonuna ekleyin.

Karaciğer süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik konik tüpü kapattıktan sonra, sızıntıları önlemek için parafilm gibi kendi kendini sızdırmaz hale getiren bir film ile sıkıca kapatın. 37 degrees celsius inkübatördeki bir tüp rotatöründe 90 dakika boyunca döndürün. İnkübasyonun ardından, sindirilmiş hücre süspansiyonunu 100 micron hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 50 mililitrelik tüpe filtreleyin.

Toplam hacmi 50 mililitreye tamamlamak için süspansiyona PBS ekleyin. Bunu, her biri 25 mililitre hücre süspansiyonu içeren iki adet 50 mililitrelik tüpe paylaştırın. Her tüpteki hücrelerin altına, Ficoll gibi bir yoğunluk santrifügasyon medyumu ile 10 mililitre yavaşça ve nazikçe ekleme yapın.

Kesintisiz olarak 20 dakika boyunca 1200 ×g hızında santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, her tüpteki ara fazı dikkatlice uzaklaştırın ve iki ayrı 50 ml'lik tüpe aktarın. Her bir ara faz tüpünün hacmini PBS ile 50 ml'ye tamamlayın.

Ardından 300 ×g'de yedi ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletlerini birleştirin ve her seferinde 300 ×g'de yedi ila 10 dakika döndürerek, yüzde 2 FBS içeren 50 mL PBS ile üç kez yıkayın. Son döndürme işleminin ardından peleti 50 mL RPMI medyumu artı yüzde 10 FBS içinde yeniden süspande edin.

Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Ardından, üretici protokolüne uygun olarak bir CD34 ayırma kiti kullanarak CD34 pozitif hücreleri hemen ayıklayın ve hem CD34 pozitif hem de CD34 negatif fraksiyonları saklayın. Flask içindeki timus parçalarını ve besiyerini 60 millimetrelik bir petri kabına boşaltın.

Pozitif deplasmanlı pipet uçlarını, açık 1,5 mililitre steril vidalı kapaklı tüplerle buz üzerinde bekleterek soğutun. Ayrıca, hücre peletlerini ve matrigel gibi jelatinöz protein karışımından bir hacmi buz üzerine yerleştirin. Alıcı fareleri, onaylanmış bir hayvan protokolüne uygun olarak enjekte edilebilir bir anestezik ile anesteziye alın.

Bir patiyi sıkarak farenin anestezi düzeyini kontrol edin. Sıkmaya karşı bir reaksiyonun olmaması, cerrahi anestezi düzleminde olunduğunu gösterir. Her farenin sol tarafını, sırtın merkezi ile karnı arasındaki bölgeden kalçadan omuza kadar tıraş edin.

Hayvanın omuz veya inguinal üçgenine, kilogram başına altı miligram seyreltilmiş Carprofen'i deri altına enjekte edin. Trokarın kanülünü 60 milimetrelik bir kap içindeki PBS ile yıkayın. Küt uçlu eğri bir penset kullanarak, 60 milimetrelik kaptan bir timus parçasını kanül açıklığının hemen içine yerleştirin ve ardından dokuyu kanül içine aspire etmek için trokarı geri çekin.

Ardından, hücre peletinin bulunduğu tüpe beş µL soğuk jelatinimsi protein karışımı eklemek için pozitif yer değiştirme pipeti ve soğutulmuş bir uç kullanın. Hücre süspansiyonunu oluşturmak için nazikçe karıştırın. Hücre süspansiyonunu kanülün ağzına pipetleyin ve iğneyi doldurmak için trokarı yavaşça geri çekin.

Farenin tıraşlanmış bölgesini önce povidon iyot, ardından izopropenil ile üç kez silin. Dalağın konumunu belirten cilt altındaki en koyu noktayı tespit edin. Böbrek, dalağın yaklaşık beş milimetre dorsalinde yer alır.

Pençez sıkıştırma uyarısına karşı bir tepki gözlemlenmeyerek uygun anestezi seviyesi sağlandıktan sonra, cildi kaldırmak için kavisli pens kullanın ve dalala paralel olacak şekilde ciltte cerrahi makasla 15 milimetrelik bir insizyon yapın. Ardından, altındaki periton tabakasında benzer bir kesi yapın. Erkeklerde böbrek kolayca görünürdür, bu nedenle karına basitçe bastırarak dışarı çıkarılabilir.

Böbreği bir hemostat veya bir çift kavisli küt uçlu pensle destekleyin. Dişilerde yumurtalıklar, böbreğin kolayca çıkarılmasını engelleme eğilimindedir. Bir hemostat kullanarak yumurtalığı kavrayın ve böbreği dikkatlice açığa çıkarın.

Böbrek kapsülünün posterior ucunda küçük bir delik açmak için iğne uçlu forseps kullanın. Kanülün ağzı böbrek kapsülü tarafından tamamen kapatılana kadar trokarı bu delikten içeri ve böbrek boyunca kaydırın. Böbrek kapsülü altındaki dokuyu nazikçe dışarı itin ve trokarı geri çekin.

Timus parçasının iğneyle birlikte geri çıkmadığından emin olmak için kavisli pensi kullanın. Ardından, peritonyumu pensle kaldırın ve böbreği nazikçe eski yerine itmek için hemostatı kullanın. Peritonyuma cerrahi sütürle çift düğümlü bir dikiş atın.

Cildi kapatmak için iki adet Autoclips Wound klipsi yerleştirin. Şimdi transdükse edilmiş CD34 pozitif hücreleri karıştırın ve 100 µL hacimdeki 0,5 × 10⁶ hücreyi bir insülin şırıngasına aspire edin. Bu hücreleri, retro-orbital ven enjeksiyonu yoluyla fareye enjekte edin.

Enjeksiyondan sonra, her bir göze küçük bir damla göz kaydırıcısı sürün ve fareyi yan tarafının üzerine gelecek şekilde kafesine geri yatırın. Tüm farelere implantasyon yapıldıktan sonra, hayvanları barındırma odasına geri götürmeden önce bilinçlerinin yerine geldiğini ve hareket edebildiklerini doğrulayın. Fareler ameliyattan 10 hafta sonra sakrifiye edildi ve kan, dalak, timus ve kemik iliği toplandı.

Elde edilen hücreler anti-human CD45 ve anti-human CD4 antikorları ile boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Burada görüldüğü üzere, CD4 kimerik antijen reseptörü modifiye edilmiş hücreler, akış sitometrisi ile birden fazla lenfoid dokuda tespit edilebilir. CD4 kimerik antijen reseptörü modifiye edilmiş hücreler, birden fazla soy hattına farklılaşabilir.

Burada, CD4 kimerik antijen reseptörü modifikasyonlu farelerden splenositler toplandı ve T ile B hücresi belirteçleri için boyandı. T ve B hücresi belirteçleri için negatif olan hücreler, monosit, makrofaj ve doğal öldürücü hücre belirteçleri için pozitifti. HIV ile enfekte CD4 kimerik antijen reseptörlü farelerden alınan splenositler, HIV ile enfekte veya enfekte olmamış T one hücreleri ile stimüle edildi ve hücre içi sitokin üretimleri gösterildi.

Bu videoyu izledikten sonra, kimerik antijen reseptörleri ile modifiye edilmiş insanileştirilmiş BLT farelerinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde 48 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, istikrarlı bir hızla çalışmaya ve ameliyat edilen farenin durumuna çok dikkat etmeye özen göstermek önemlidir.

Yeni başlayanlar için, daha değerli olan dokular ve kök hücrelerle çalışmadan önce cerrahi ve göz içi enjeksiyonları konusunda pratik yapmak önemlidir. Bu teknik geliştirildikten sonra, HIV ve diğer bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların, humanize fare modelinde hastalık patogenezini ve immün temelli tedavileri keşfetmelerine olanak sağlamıştır.