Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

Bu prosedürün genel amacı, kimerik antijen reseptörü ile modifiye edilmiş insanlaştırılmış fare oluşturmaktır. Bu yöntem, HIV enfeksiyonuna ve diğer kronik enfeksiyonlara ve malignitelere karşı kök hücre bazlı tasarlanmış bağışıklığın etkinliğinin test edilmesiyle ilgili olarak HIV ve immünoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bir bağışıklık yetmezliği mekanizması ve bağışıklık sistemini güçlendirmenin ve daha iyi anti-viral veya anti-tümör bağışıklığı oluşturmak için bir tedavi geliştirmenin yolları gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, büyük miktarda deneysel manipülasyon yapabilmesidir. İnsanlaştırılmış BLT fareleri modeli, insan bağışıklığını taklit eder ve bu durumda HIV enfeksiyonuna karşı hücre bazlı gen terapileri için klinik öncesi testlere izin verir. Prosedürü gösterecek olan Valerie Rezek ve Brianna Lam, onlar benim laboratuvarımdan teknisyenler.

Timusu yaklaşık bir milimetrelik küçük parçalar halinde kesmek için neşter kullanarak başlayın, takviye edilmiş RPMI ortamı içeren bir tabakta küp şeklinde doğranmış. Daha sonra, her bir timus parçasını 96 oyuklu bir plaka üzerinde tek bir oyuğa yerleştirmek için kavisli künt forseps kullanın. Dokunun kurumaması için tüm kuyucuklara 100-200 mikrolitre ortam ekleyin.

Timus olmayabilecek veya bağ dokusu bağlı olan herhangi bir dokuyu ortadan kaldırmak için dokuyu mikroskop altında görselleştirin. Daha sonra, onaylanmış timus parçalarını çıkarın, bunları bir T25 hücre kültürü şişesinde birleştirin. Şişeye yedi mililitre antibiyotik takviyeli RPMI ortamı ekleyin ve karıştırmak için hafifçe sallayın.

Daha sonra şişeyi doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bu adım, dokunun bakteriyel kontaminasyonunu önler. CD34 pozitif HSC'lerin fetal karaciğerden izolasyonuna, karaciğeri IMDM içeren bir tabakta küp şeklinde yaklaşık üç milimetrelik küçük parçalara kesmek için iki neşter kullanarak başlayın.

Herhangi bir beyaz bağ dokusunu çıkarın ve atın. Daha sonra, karaciğer parçalarını ve ortamı çıkarmak ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 16 gauge künt iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Dokuyu tamamen homojenize etmek için nazikçe beş ila yedi kez daha alın ve dışarı atın.

10 mililitre IMDM besiyeri hazırladıktan sonra, kollajenaz, hyaluronidaz, antibiyotikler, Dnasé ve anti fungal ile takviye edin. Ortamı 0,22 mikronluk bir filtreden geçirin. Ardından filtrelenmiş ortamı karaciğer süspansiyonuna ekleyin.

Karaciğer süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik konik tüpü kapattıktan sonra, sızıntıları önlemek için parafilm gibi kendinden sızdırmaz bir filmle sıkıca kapatın. 37 santigrat derece inkübatörde bir tüp döndürücüde 90 dakika döndürün. İnkübasyonun ardından, sindirilmiş hücre süspansiyonunu 100 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik yeni bir tüpe süzün.

Toplam hacmi 50 mililitreye çıkarmak için süspansiyona PBS ekleyin. Bunu, her biri 25 mililitre hücre süspansiyonu içeren iki adet 50 mililitrelik tüpe bölün. Ficoll gibi 10 mililitre yoğunluklu bir santrifüj ortamı ile her tüpteki hücreleri yavaşlatın ve nazikçe altına alın.

Ara vermeden 20 dakika boyunca 1200 kez g'de döndürün. Santrifüjlemeyi takiben, arayüzü her tüpten dikkatlice çıkarın ve iki ayrı 50 mililitrelik tüpe aktarın. PBS ile her bir arayüz tüpünün hacmini 50 mililitreye getirin.

Ve sonra yedi ila 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Hücre peletlerini yüzde iki FBS içeren 50 mililitre PBS ile üç kez birleştirin ve yıkayın, her seferinde yedi ila 10 dakika boyunca 300 kez g'de döndürün. Son dönüşün ardından, peleti 50 mililitre RPMI ortamı artı yüzde 10 FBS'de yeniden askıya alın.

Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Ardından, üreticinin protokolüne göre bir CD34 sıralama kiti kullanarak CD34 pozitif hücreleri hemen sıralayın ve hem CD34 pozitif hem de CD34 negatif fraksiyonunu kaydedin. Şişeden timus parçalarını ve ortayı 60 milimetrelik bir tabağa dökün.

Bazı pozitif yer değiştirmeli pipet uçlarını buz üzerinde açık 1,5 mililitrelik steril vidalı kapaklı tüplere koyarak soğutun. Ayrıca, hücre peletlerini ve matrigel gibi bir miktar jelatinimsi protein karışımını buzun üzerine yerleştirin. Alıcı fareleri, onaylanmış bir hayvan protokolüne göre enjekte edilebilir bir anestezik ile uyuşturun.

Bir pençe sıkarak farenin anestezi seviyesini kontrol edin. Tutam için bir reaksiyonun olmaması, cerrahi bir anestezi düzlemini gösterir. Her farenin sol tarafını, sırtın merkezi ile mide arasında kalçadan omuza kadar tıraş edin.

Deri altına kilogram başına altı miligram seyreltilmiş Carprofen'i hayvanın omzuna veya kasık üçgenine enjekte edin. Trokarın kanülünü 60 milimetrelik bir tabakta PBS ile yıkayın. Bir çift künt kavisli forseps kullanarak, 60 milimetrelik çanaktan bir parça timusu kanülün açıklığının hemen içine yerleştirin, ardından dokuyu kanüle aspire etmek için trokarı geri çekin.

Ardından, hücre peletinin bulunduğu tüpe beş mikrolitre soğuk jelatinimsi protein karışımı eklemek için pozitif yer değiştirmeli bir pipet ve soğutulmuş bir uç kullanın. Ve hücre süspansiyonunu oluşturmak için hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunu kanülün açıklığına pipetleyin ve iğneyi yüklemek için trokarı yavaşça geri çekin.

Farenin traşlı bölgesini povidon iyot ve ardından üç kez izopropenil ile temizleyin. Dalağın yerini gösteren derinin altındaki en koyu noktayı belirleyin. Böbrek, dalağın dorsalinde yaklaşık beş milimetredir.

Pençe kıstırmasının bir reaksiyonu olmadan uygun bir anestezi seviyesi sağladıktan sonra, cildi kaldırmak için kavisli forseps kullanın ve dalağa paralel olarak ciltte 15 milimetrelik bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. Daha sonra aşağıdaki periton tabakasında benzer bir kesim yapın. Erkeklerde, böbrek kolayca görülebilir, bu nedenle sadece karın üzerine bastırılarak ekstrüde edilir.

Böbreği bir hemostat veya bir çift kavisli künt forseps ile destekleyin. Kadınlarda, yumurtalıklar böbreğin kolay çıkarılmasını engelleme eğilimindedir. Bir hemostat kullanarak, yumurtalığı alın ve böbreği dikkatlice açığa çıkarın.

Böbrek kapsülünün arka ucunda küçük bir delik açmak için iğne uçlu forseps kullanın. Kanülün açıklığı tamamen böbrek kapsülü tarafından kaplanana kadar trokarı bu deliğe ve böbrek boyunca kaydırın. Böbrek kapsülünün altındaki dokuyu nazikçe çıkarın ve trokarı geri çekin.

Timus parçasının iğne ile geri çıkmadığından emin olmak için kavisli forseps kullanın. Daha sonra, peritonu forseps ile yukarı kaldırın ve böbreği tekrar yerine itmek için hemostatı nazikçe kullanın. Peritonda cerrahi dikiş ile bir çift düğümlü dikiş bağlayın.

Ayrıca cildi kapatmak için iki Autoclips Wound klipsi yerleştirin. Şimdi transdüksiyon CD34 pozitif hücreleri karıştırın ve 100 mikrolitrelik bir hacimde altı hücreye 0.5 kez 10 kez bir insülin şırıngasına aspire edin. Bu hücreleri retro orbital ven enjeksiyonu yoluyla fareye enjekte edin.

Enjeksiyondan sonra, her göze küçük bir damla kayganlaştırıcı sürün ve fareyi bir kafese yan yatırın. Tüm fareleri implante ettikten sonra, hayvanların vicdanlılıklarını yeniden kazandıklarını ve onları barınma odasına geri göndermeden önce ayakta olduklarını onaylayın. Fareler ameliyattan 10 hafta sonra sakrifiye edildi ve kan, dalak, timus ve kemik iliği alındı.

Elde edilen hücreler anti-insan CD45 ve anti-insan CD4 antikorları ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Burada görüldüğü gibi, CD4 kimerik antijen reseptörü modifiye hücreleri, akış sitometrisi ile çoklu lenfoid dokularda tespit edilebilir. CD4 kimerik antijen reseptörü modifiye edilmiş hücreler birden fazla soya farklılaşabilir.

Burada, CD4 kimerik antijen reseptörü modifiye edilmiş farelerden splenositler hasat edildi ve T ve B hücrelerinin belirteçleri için boyandı. T ve B hücre belirteçleri için negatif olan hücreler, monosit ve makrofaj belirteçleri ve doğal öldürücü hücreler için pozitifti. HIV ile enfekte CD4 kimerik antijen reseptör farelerinden alınan splenositler, HIV ile enfekte olmuş veya enfekte olmamış T one hücreleri ile uyarıldı ve hücre içi sitokin üretimi gösterildi.

Bu videoyu izledikten sonra, kimerik antijen reseptörleri ile modifiye edilmiş insanlaştırılmış BLT farelerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 48 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sabit bir hızda çalışmayı unutmamak ve ameliyat edilen farenin durumuna çok dikkat etmek önemlidir.

Yeni başlayanlar için, daha değerli dokular ve kök hücrelerle çalışmadan önce cerrahi ve göz enjeksiyonları yapmak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, HIV ve diğer bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların, insanlaştırılmış fare modelinde hastalık patogenezini ve bağışıklık temelli tedavileri keşfetmelerinin yolunu açtı.