Name: EAK 16-II ile FACS Arıtılmış Timik Epitel Hücreleri 3-D Toplama Teşvik / EAKIIH6 Kendi toplanan Hidrojel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Keşfedin, EAK16-II/EAKIIH6 peptitleri kullanarak timik epitel hücrelerinin 3 boyutlu hidrojel içinde toplanmasını. Bu biyobozunur yöntem, timus biyomühendisliği ve hücre tedavileri için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma R21 AI113000 (ATM) ve R01 AI123392 (YF) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen hibe desteklenmiştir.

Deneylerde kullanılan tüm hayvanlar Allegheny Sağlık Ağı / Allegheny Şarkıcı Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından incelenen ve onaylanan protokol çerçevesinde Allegheny-Singer Araştırma Enstitüsü&#39;nde hayvan tesisine yerleştirilmiştir bulundu. 1. kollagenaz Timüsü özümsemek <ol><li> Hasat timüs bezleri. <ol><li> Timus bezleri hasat için 3-5 haftalık C57BL6 / J karbondioksit fareler (CO 2) odasına euthanize. Ayrıntılı olarak, 3-5 dakika boyunca CO2 indüksiyonu altında bölme fareler yerleştirin ve kalp ya da solunum doğrulayarak ölüm teyit etmektedir. </li><li> Sırtında karkas yatırın ve% 70 etanol ile vücut ıslak. deri yoluyla karın üzerinde keskin, düz diseksiyon makas ile küçük bir yatay bir kesi yapmak. onun tersyüz böylece her iki ucunda (baş ve bacaklar) deriyi çekin. </li><li> diseksiyon makas hemen altında yatay bir kesim olundüşük kaburga ve yanlara diyafram kesti. Bir forseps ile kılıç şeklinde sürecini tutun ve her iki tarafta yukarı geçmeden kaburga orta kesti. timus açıkça görülebilecek şekilde kaburga / sternum yukarı çekin. Not: Thymus, doğrudan kalbin üstüne yatıyor 2 lob oluşur ve beyaz saydam renk olduğunu. </li><li> yavaşça kepçe ve bağ dokusu ve yıkama çözeltisi içinde transfer kapalı timus lobları çekin kavisli bir forseps kullanarak (Malzeme listesi bakınız). </li></ol></li><li> 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute orta 1640), 0.025 mg / ml saflaştınlmış kolajenaz, 10 mM HEPES [4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit] ve 0.2 mg / ml karıştırılarak sindirim çözeltisi hazırlayın 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde DNase I. kullanılana kadar 37 ° C su banyosu içinde sindirim çözeltisi tutun. Not: hazırlanan sindirim solüsyonunun miktarı bir 5 ml polistiren yuvarlık tabanlı birlikte inkübe edilebilir en fazla beş yetişkin fare Thymi için yeterlidiralt tüp. </li><li> 5-6 ml RPMI-1640 ihtiva eden bir 60 mm doku kültürü çanağı timus aktarın. </li><li> Lenfositler dışarı akmasına izin vermek, küçük parçalar halinde 28 G insülin şırınga iğnesi (yaklaşık 1 mm 3 kare) ile timus teşrih. </li><li> cam Pasteur pipeti ile petri olan RPMI-1640 ile timik parçaları durulayın. çanak eğin ve timik fragmanları dibe edelim. Yavaş yavaş aspire ve bir cam pipet kullanarak RPMI-1640 süpernatant atın. Solüsyon daha az opak olana kadar cam pipet ile 4-5 kez 5-6 ml RPMI-1640 ile bu durulama adımı yineleyin. Not: Cam pipetler bu aşamada tavsiye edilir, timik fragmanlar timik dokuların aşırı kaybına neden plastik sopa eğilimindedir beri. Prosedürün geri kalanı için, plastik pipet kullanın. </li><li> Adım 1.5&#39;de tarif edildiği gibi son yıkamadan sonra, süpernatant atılır. 3 mi sindirim çözeltisi ekleyin ve 5 ml&#39;lik yuvarlak dipli bir p haline timus parçaları ve çözeltisiniolystyrene tüp. </li><li> tüp rotator Tüp 12 rpm&#39;lik bir dönme hızında 6 dakika için 37 ° C de inkübe edilir. </li><li> kuluçkadan sonra timik fragmanları yerçekimiyle tüpün dibine yerleşmek sağlar. Pasteur pipeti ile süpernatan toplamak ve yıkama solüsyonu 10 ml bir 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne aktarılır. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj, supernatant atmak ve 10 ml yıkama solüsyonu hücreleri tekrar süspansiyon. buz üzerinde tutun. </li><li> Yineleyin yuvarlak alt polistiren tüp 5 ml timik parçaları iki kez 1.6-1.8 adımları. Aynı 50 ml tüp içinde süpernatant havuz. Not: Santrifüj, ikinci ve üçüncü yıkama için gerekli değildir. </li><li> 50 ml santrifüj tüpüne tüp ve transferi herhangi bir geri kalan parçaları parçalamak için son sindirimden sonra, yukarı pipetleyin ve 2 ml plastik pipet serolojik aşağı. </li><li> Santrifüj 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de 50 ml tüp, çamaşır Buffe 10 ml süpernatan, tekrar süspansiyon aspire100 mikron hücre süzgecinden r ve filtre. buz üzerinde tutun. </li></ol> Kesintili Yoğunluk Gradyan ile TECS 2. zenginleştirilmesi <ol><li> 2.4 mi yoğunluk gradyan ortamı (su içinde iyodiksanol ağ / hac% 60) ve 9.6 ml yıkama solüsyonu karıştırılarak% 21 yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlayın. </li><li> 2.5 ml yıkama tamponunda 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 300 xg&#39;de adım 1.11 50 ml toplama tüpü ayrışmış timik hücreleri Santrifüj. </li><li> Hücre süspansiyonu 20 ml RPMI-1640 ortamı ekleyin. </li><li> elektronik bir pipet ile 10 ml&#39;lik bir serolojik pipet% 21 yoğunluk gradyan çözeltisi 12 ml doldurun. 50 ml santrifüj borusu içeren hücrelerin alt serolojik pipet ucu yerleştirin ve yoğunluk gradyan çözeltisi yerçekimi ile tüpün dibine drenaj sağlar. <ol><li> Yavaşça farklı yoğunluktaki iki kat üreten bitirmek için pipetlemeyin yoğunluk gradyan çözüm sınırdışı. </li></ol></li><li> 600 x g&#39;de santrifüj foR bir sallanan kepçeli rotor oda sıcaklığında 20 dakika. yavaş düzeyde yavaşlama hızını ayarlayın. </li><li> Yeni 50 ml tüp üst tabaka ve arayüz aktarın. Not: TECS çoğu arayüzü tutulur. Lenfositler Santrifüj işleminden sonra tüpün dibine çöker. Bu hücreler, başka amaçlar için kullanılmak üzere ise, üç kez 20 ml yıkama solüsyonu ile pelet yıkayın. Yıkama tamponu, 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 4 ° C&#39;de 6 dakika boyunca 400 xg&#39;de adım 2.6 ve santrifüj tüpe 40 ml yıkama solüsyonu ekleyin. Bir pipet ile süpernatant, aspire kaldırmak için. </li><li> Adım 2.7 açıklandığı gibi yıkama ve aspirasyon 2 kez daha tekrarlayın. </li><li> yıkama çözeltisi, 2 ml ve yeniden süspanse hemasitometre ile hücre sayımı. </li></ol> FACS ile 3. Yalıtımlı Tecs <ol><li> Yıkama solüsyonu ve transfer 1x10 6 hücre / 100 ul konsantrasyonunda adım 2.9 hücreleri ayarlayın(Akış sıralayıcı tarafından tavsiye edilen şekilde polipropilen veya polistirenin,) 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir tüp hücre. </li><li> 1x10 6 hücre başına 2 ul anti-Fc reseptörü IgG ekleyin ve 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (: 150 seyrelti, örnek başına 10 ul 1) ve anti-EpCAM, anti-CD45 ekleyin (1: 100 seyrelti, örnek başına 10 ul) antikorları ve en fazla 20 dakika süreyle 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 6 dakika boyunca 400 x g&#39;de 2 ml yıkama çözeltisi ve santrifüj ile hücreler yıkanır. Bir pipet ile süpernatant aspire. </li><li> 1 mi 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 100 mikron süzgeç süzülür. </li><li> sıralama enstrüman hücreleri uygulayın. Yan dağınık ışık (SSC) / ileri-dağınık ışık (FSC) paneli (ölü hücreler), 13 sıralamak için CD45- EpCAM + için seçilen nüfus ardından kapı üzerinde küçük hücreler hariç lenfosit ve TEC nüfusu seçin. </li></ol> 4. GTEC / EAK Agregalarının eneration Not: reaktif hazırlama ve laminer kaputun altında karıştırma hücreyi içeren adımları uygulayın. <ol><li> steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, anti-His-tag IgG 4 ul anti-EpCAM IgG 8 ul ve PA / G 2.6 ul karıştırılarak pA / G Adaptör kompleksleri hazırlamak, ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Yıkama çözeltisi ve pipet düşük buharlaşmalı, 96 gözlü yuvarlak tabanlı doku kültürü plakası, bir oyuk 100 ul 5x10 4 hücre / ml aşama 3,7 kriteri Tecs ayarlayın. hücrelere 14.6 ul pA / G Adaptör kompleksleri ekleyin. 4 ° C&#39;de 20 dakika süreyle sallanan bir platform üzerinde plaka koyun. </li><li> 200 ul yıkama çözeltisi ile bir kez yıkanır. 6 dakika boyunca 400 x g&#39;de plaka santrifüj. Bir mikropipet ile süpernatant atın. </li><li> 200 ul% 10 sukroz çözeltisi ile bir kez yıkanır. 6 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. Bir mikropipet ile süpernatant atın. </li><li> 30 ul 10% s yeniden süspanse hücrelerioyuk başına terile sukroz çözeltisi. </li><li> EAKIIH6 10 ul (7.5 mg / ml) ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> TEC karışımına EAK16-II &#39;nin 20 ul (10 mg / ml) eklenir. </li><li> jelleşme başlatmak için sisteme tam ortam 100 ul ekle. Oda sıcaklığında 15-20 dakika süre ile bir çalkalama platformunda plaka koyun. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübatör içinde plaka koyun ve% 5 CO2. 2-4 saat sonra, tam bir ortamda bir 100 ul ilave edin. </li><li> kullanılana kadar her gün orta değiştirin. <ol><li> Aspire bir mikropipet kullanarak ve yavaşça kuyunun duvarına pipet koyarak önceden ısıtılmış orta 100 ul eklemek jel bozmadan yüzeyden orta 100 ul. </li></ol></li></ol> TEC / EAK Agregalarının 5. Karakterizasyonu <ol><li> In vivo TEC / EAK agrega fonksiyonunu incelemek için, bir atimik çıplak böbrek kapsülü altında O / N kültür ve nakli sonrasında TEC / EAK hidrojel toplamakFare, daha önce prosedür 11,14 tarif kullanarak. </li><li> 4-6 hafta anti-CD4 bir kokteyli ile nakli ve lekeyi yayınlamak çıplak farelerde, -CD8, -CD45 EDTA içeren, kan toplama tüpüne 50-100 ul kan örnekleri hasadı çevre T hücrelerinin gelişimini izlemek ve -CD3 12 antikorları. </li><li> Tek hücre analiz yazılımı 12 kullanılarak akış sitometrisi ile çevresel kan lökositleri (FCM) T-lenfositlerin oranı analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+deletion+of+insulin+induces+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes.</a> The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).</li>
<li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li>
<li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li>
<li>Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+colloidal+suspension+of+hydrophobic+compounds+with+an+amphiphilic+self-assembling+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+the+ionic+peptide+EAK16%3A+the+effect+of+charge+distributions+on+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly.</a> Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).</li>
<li>Saunders, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fluorogen+activating+proteins+into+self-assembling+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials.</a> Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).</li>
<li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+the+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).</li>
<li>Wen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coassembly+of+amphiphilic+peptide+EAK16-II+with+histidinylated+analogues+and+implications+for+functionalization+of+beta-sheet+fibrils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo.</a> Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide-based+material+platform+for+displaying+antibodies+to+engage+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells.</a> Biomaterials. 32, 249-257 (2011).</li>
<li>Tajima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+mini+functional+thymic+units+with+EAK16-II%2FEAKIIH6+self-assembling+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel.</a> Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+Thymus+Organoids+to+Restore+Thymic+Function+and+Induce+Donor-Specific+Immune+Tolerance+to+Allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts.</a> Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+deletion+of+insulin+induces+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes.</a> The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+central+tolerance+of+ICA69+induces+multiple+organ+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity.</a> J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).</li>
<li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li>
<li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations%3A+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).</li>
<li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).</li>
<li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+identification%2C+and+purification+of+murine+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells.</a> J Vis Exp. , e51780(2014).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+monocytes+from+whole+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Separation of monocytes from whole human blood.</a> ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).</li>
<li>Li, X., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+subcellular+membrane+vesicles+of+epithelial+and+nonepithelial+cells+by+OptiPrep+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation.</a> Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+method+using+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+significantly+reduces+cytokine+chemokine+production+from+human+islet+preparations%2C+leading+to+prolonged+beta-cell+survival+during+pretransplantation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture.</a> Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).</li>
<li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%3A+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li>
<li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role for central tolerance.</a> Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Sci Rep. 3, 1860(2013).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

TECS timus stroma baskın nüfus ve timüs bezlerinin yapısı ve fonksiyonu için temel rolleri oynarken, onlar toplam timik sellülarite sadece yaklaşık 0.1-0.5% temsil etmektedir. Bunlar aynı zamanda, hücre ölümü, yüksek yüzdeleri zaman, yani, tedavi hücre dışı matrisin (ECM) ile ilgili Tecs ayırmak için, kollajenaz sindirimi aşağıdaki koşullar kırılgan hücrelerdir. Onların nadir (~ 200.000 fare timus başına) ve kırılganlık o TECS izole etmek zor bir görev yaptı. TEC izole yüksek oranda saflaştırılmış kollajenaz so...

Timus edinilmiş bağışıklık sisteminin işlevi için önemlidir patojen reaktif, kendine dayanıklı T hücrelerinin çeşitli nüfusun oluşturulması için primer lenfoid organıdır. Bu timik stroma sünger benzeri üç boyutlu (3-D) matris boyunca göç, gelişmekte olan timositleri, lenfosit progenitör hücreler olarak kemik iliğinden göç dinamik bir organdır, soy-şartname ve farklılaşma tabi, ve sonunda da göç olgun T hücreleri. bu iyi programlanmış sürecin başarısı büyük ölçüde göç timositlerde ve konut timik epitel hücreleri (Tecs) kurulması ve timus mikroçevresinin bütünlüğünü korumak için gerekli olan timik stroma baskın nüfus arasındaki çapraz konuşma bağlıdır. anatomik bir konumda ve eşsiz fonksiyon esas alınarak, TECS iki alt ayrılabilir: kortekste Tecs yanıtlayabiliyor olan (cTECs)Kendi kendine MHC (majör histokompatibilite kompleks) seçilmesi olan kişidir T hücreleri (pozitif seçim) ve otoreaktif T hücreleri (negatif seçim) 1,2 ortadan kaldırmak için gerekli olan medullada Tecs (mTECs) yazılmıştır. Birçok faktör (örneğin, yaşlanma, enfeksiyon, radyasyon, ilaç tedavileri) tehlikeye adaptif bağışıklık sonuçlanan timik epitele geri dönüşü olmayan hasarlara neden olabilir. Çok sayıda girişimlerine rağmen, timus fonksiyonu yeniden nedeniyle timik mikro çoğaltmak zorluk zorlu olmuştur. 2-B ortamında kültürlenmiştir Tecs hızlı thymopoiesis 3,4 kritik genlerin ekspresyonunu azaltmak ise Özellikle, timik üç boyutlu (3-D) konfigürasyonu, Tecs hayatta kalma ve işlevi için önemlidir. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) ve C-ucu histidinylated analog EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH), düşük molekül ağırlıklı, deiyonize Su sağlama içinde çözünür olan amfifilik oligopeptitlerdir20 mM NaCI (insan vücut sıvısı normal tuz konsantrasyonunun 154 mM) daha yüksek iyonik güce maruz kaldığı zaman R, β-fibriller oluşturur jelleşme ama geçer. Bu çevre duyarlı özellik 3D yapıları oluşturmak üzere onları çok yönlü yapı taşlarını yapar. kompleksleri, protein ilaçları ve diğer biyomoleküllerin demirlemek için bir adaptör olarak hizmet verebilir (: EAKII-H6 üzerinde His-tag takma mekanizması, hangi anti-His IgG&#39;ler / Fc bağlayıcı rekombinant protein A / G (pA / G αH6) sağlar örneğin hidrojel karma yapısını 5-8, antikorlar). Daha önce hidrojel üzerine bağlanan flüoresan etiketli IgG molekülleri kadar 13 gün 9 enjeksiyon yerinde muhafaza edilebileceğini göstermiştir. ΑH6 Dahası,: Anti-CD4 IgG&#39;lerin ile sabitlenen pA / G adaptörleri EAK16 II / EAKIIH6 (EAK) hidrojel ilave edildi, CD4 + T hücreleri, spesifik olarak 10 ele geçirildi. benzer bir teknik kullanılarak, yakın zamanda göstermiştir ki TECS C 3-D-çekiş(: PA / G: αEpCAM αH6) TEC-özel anti-EpCAM antikorları taşıyan adaptör kompleksleri ile EAK hidrojel terfi ould. Çıplak farelerin böbrek kapsülleri altına nakledildiklerinde, EAK hidrojel gömülü TEC kümeleri etkili in vivo 11,12 işlevsel T hücrelerinin gelişimini destekler. Burada hızlı ve etkin bir floresan aktive hücre (FACS) ile Tecs arındırmak ve EAK hidrojel sistemi ile 3-D TEC agrega üretmek için bizim yöntemini gösterir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > TEC İzolasyon< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 70 Etanol</td><td>Decon Laboratuvarları</td><td>2701 (1 Galon)</td> <td>Etanol 200 Geçirmez, deiyonize su</td></tr><tr><td>Diseksiyon makası, düz</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forseps, düz</td><td>Güzel Bilim Araçları, Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forseps, kavisli</td><td>Güzel Bilim Araçları, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama solüsyonu</td><td></td><td></td><td>1x PBS, %0.1 BSA, 2&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (Fosfat tamponlu salin)</td> <td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Sığır serum albümini)</td> <td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (etilendiamintetraasetik asit)</td> <td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Sindirim çözeltisi</td><td></td><td></td><td>9 ml RPMI-1640, 0.025 &nbsp; mg / ml Liferaz TM Araştırma notu, 10 &nbsp; mM HEPES, 0.2&nbsp; mg / ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberaz TM Araştırma Sınıfı</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>"saflaştırılmış kollajenaz" olarak anılır1</td></tr><tr><td>&nbsp; M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm doku kültürü kabı</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp; cc U-100 İnsülin şırıngası 28&nbsp; 1/2&nbsp; G</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Polistiren yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml cam pipet</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-678-27E Timik</td><td>parçaları durulamak için kullanın. Timik parçalar plastik pipetlerle duvara yapışma eğilimindedir.</td></tr><tr><td>MACSmix tüp döndürücü</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp; &mikro; m Hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyan ortamı: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Polipropilen yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD16 / CD32 (Fc Blok)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Seyreltilmemiş, 2&nbsp; &mikro; örnek başına l</td></tr><tr><td>Anti-fare CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>1:150, 10&nbsp'de kullanın; &mikro; örnek başına l</td></tr><tr><td>Anti-fare CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>1:100, 10&nbsp'de kullanın; &mikro; örnek başına l</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek hücre analiz yazılımı</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Jel Assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td> <td>"anti-His-Tag IgG"</td></tr> <tr><td>Saflaştırılmış anti-fare CD326 (EpCAM)</td> <td>BioLegend</td><td>118202</td> <td>"anti-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>Rekombinant protein A/G</td><td>Pierce Biyoteknoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Safe-Lock Tüpleri, Biopur, Steril</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>, "1.5&nbsp; ml mikrosantrifüj tüpü "</td></tr><tr><td>96 kuyulu, Doku kültürü plakası, Düşük buharlaşma kapaklı yuvarlak tabanlı</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan platform: Nutator Mikser no.1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%10 sükroz</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Steril damıtılmış su ile hazırlayın</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAEAKAK-CONH2)</td> <td>American Peptide Company & nbsp;</td><td></td><td>özel sentezlenmiş, 10&nbsp; mg / ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)</td> <td>Amerikan Peptit Şirketi&nbsp;</td><td></td><td>Özel sentezlenmiş, 7.5&nbsp; mg / ml</td></tr><tr><td>Tam orta</td> RPMI-1640<td></td><td></td><td>,% 10 FBS,% 1 Pen / Strep,% 1 L-glutamin,% 1 NEAA, 5 nbsp; mM HEPES, 50&nbsp; &mikro; M 2-Merkaptoetanol</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Kullanmadan önce ısı inaktive</td></tr> edildi <tr><td>Kalem / Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin 200 & nbsp; mM (100x)</td> <td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (esansiyel olmayan amino asit) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1 &nbsp; M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Platform çalkalayıcı: Oryantal Dansöz</td><td>Stovall Yaşam Bilimleri A.Ş.</td><td>Modeli: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

eak 16-ii ile facs arıtılmış timik epitel hücreleri 3-d toplama teşvik / eakiih6 kendi toplanan hidrojel

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Yaşlanma veya patolojik hakaretlerle ilişkili timus evrimi, olgun T hücrelerinin çıktısının azalmasına neden olur. Başarısız bir timusun fonksiyonunu eski haline getirmek, istilacı patojenlere karşı etkili T hücresi aracılı edinilmiş bağışıklık tepkisini sürdürmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, timik epitel hücrelerinin (TEC'ler) hayatta kalması ve işlevi için kritik olan timik stroma'nın benzersiz 3D mikro ortamının yeniden üretilmesinin zorlukları nedeniyle, timus rejenerasyonu ve yeniden canlandırılmasının zor olduğu kanıtlanmıştır. Amfifilik EAK16-II oligopeptitlerinin ve histidinillenmiş analog EAKIIH6 kendi kendine birleşme özelliğine dayalı olarak TEC agregalarının oluşumunu teşvik etmek için yeni bir hidrojel sistemi geliştirdik. TEC'ler, yoğunluk gradyanı ile izole edilmiş timik hücrelerden zenginleştirildi, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile sıralandı ve anti-His IgG'lerle birlikte protein A / G adaptör kompleksleri üzerine tutturulmuş anti-epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAM) antikorları ile etiketlendi. Hücre agregatlarının oluşumu, TEC'lerin EAKIIH6 ve EAK16-II oligopeptitleri ile inkübe edilmesi ve daha sonra jelleşmeyi başlatmak için ortamın iyonik konsantrasyonunun arttırılmasıyla desteklendi. EAK hidrojel içine gömülü TEC agregatları, atimik çıplak farelere nakledildiğinde in vivo olarak fonksiyonel T hücrelerinin gelişimini etkili bir şekilde teşvik edebilir.

CD45- stromal hücreler ettirecek yoğunluk gradyan ayırma protokolü kullanılarak etkinliğini incelemek için, arayüz ve çökelen lenfosit pelet iki hasat hücreleri, anti-CD45 ve anti-EpCAM antikor ile boyandı. Hem anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) ve anti-MHC Sınıf II antikorlar yanı sıra diğer CTEC ve MTec alt kümeleri tespit etmek boyama kokteyli alındı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, rutin TECS 15-20 kat zenginleşme yakın yakalamayı başardık. <p class="jove_cont...

Bu video, FACS izolasyonu için timik epitel hücrelerini (TEC'ler) yoğunluk gradyanı ile zenginleştirmek için bir protokol göstermektedir. Ayrıca, TEC agrega oluşumunu teşvik etmek için EAK16-II/EAKIIH6 peptitlerinin kullanımını da gösterir. EAK16-II/EAKIIH6 hidrojelin mikro ortamları, TEC'lerin hayatta kalmasını ve işlevini sürdürmek için gerekli 3 boyutlu konfigürasyonu sağlar.

EAK 16-II ile FACS Arıtılmış Timik Epitel Hücreleri 3-D Toplama Teşvik / EAKIIH6 Kendi toplanan Hidrojel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Bu prosedürün genel amacı, timik epitelyal kendi kendine sağkalımı ve işlevi desteklemek için üç boyutlu bir yapıda timik epitel hücre agregasyonunu teşvik etmede EAK 16-II/EAKIIH6 peptidinin kullanımını göstermektir. Bu yöntem, timus biyomühendisliği alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, EAK-16-II/EAKIIH6 peptid kullanması, timik epitel hücre agregasyonunu teşvik etmesi, biyolojik olarak parçalanabilir olması ve enjeksiyonlar için kullanılma potansiyeline sahip olmasıdır.Timusu hasat etmek için, üç ila beş haftalık bir C57 siyah 6J fareyi sırtüstü pozisyona getirerek başlayın ve saçı %70 etanol ile ıslatın. Keskin, düz diseksiyon makası kullanarak karın derisinden küçük bir yatay kesi yapın. Daha sonra karın boşluğunu ortaya çıkarmak için kesiğin her iki tarafındaki cildi çekin.Ardından, en alt kaburganın hemen altında yatay bir kesim yapın ve diyaframa yanlamasına kesin. Forseps kullanarak, ksifoid işlemini çekin ve göğsün her iki tarafı boyunca kaburgaların ortasından kesin. Kaburgaları ve sternumu yukarı çekin, böylece timus açıkça görülebilir.Daha sonra, kavisli bir forseps kullanarak, timusun loblarını bağ dokusundan nazikçe ç

promoting-3-d-aggregation-facs-purified-thymic-epithelial-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video hazırlanması 2-dGuo tedavi timus kültürler gösterilmiştir reaggregate.

Thymus Kültürler Reaggregate

Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

Burada kendi kendine montaj 3-boyutlu iskele kültür insan nöral progenitör hücrelerin kullanımını tanımlamak. Biz flow sitometri ile analiz edilecek daha sonra örneğin iskeleleri hücreleri serbest bırakmak için bir protokol mevcut. Bu protokol detaylı mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için diğer hücre türlerine adapte olabilir.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

Aşağıdaki protokol tiyol-ene fotoğrafı tıklama reaksiyonlar oluşturduğu adım büyüme PEG-peptid Hidrojellerde pankreatik β-hücreleri encapsulating için teknikler sağlar. Bu malzeme platformu hücre kapsülleme için cytocompatible mikroçevrede sunuyor, ama aynı zamanda hidrojellerin bünyesinde oluşturulan hücre yapılarının kullanıcı kontrollü hızlı iyileşme sağlar sadece.

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Medüller timik epitel hücrelerinin in vitro olarak incelenmesi, mevcut 2D kültür sistemleri in vivo senaryoyu taklit etmediği için büyük ölçüde başarısız olmuştur. Burada tarif edilen 3D kültür sistemi - modifiye edilmiş bir cilt organotipik kültür modeli - mTEC proliferasyonunu, farklılaşmasını ve rastgele gen ekspresyonunun sürdürülmesini özetlemede üstün olduğu kanıtlanmıştır.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Hücre dışı matriks ligandlar poliakrilamid hidrojeller üzerine uyumlu yüzeyler üzerinde sınırlı kolonilerde insan embriyonik kök hücrelerin kültürünü sağlamak için desenli olabilir. Bu yöntem, doku geometrisi, hücre tarafından oluşturulan kuvvetler ve kader özellikleri arasındaki etkileşimi incelemek için çekiş kuvveti mikroskobu ve biyokimyasal tahlillerle kombine edilebilir.

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Bu makale, hücre dışı matris sertleşmesini ve fibroblast aktivasyonunu incelemek için fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklamaktadır.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Burada, timik epitel hücresi (TEC) olgunlaşmasını ve uzun süreli bakımı ve ayrıca in vitro timopoezi desteklemeyi amaçlayan 3D fibrin hidrojellerde büyütülen insan iPSC'den türetilmiş timus organoidlerinin oluşumu için bir protokol açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu

Keşfedin, EAK16-II/EAKIIH6 peptitleri kullanarak timik epitel hücrelerinin 3 boyutlu hidrojel içinde toplanmasını. Bu biyobozunur yöntem, timus biyomühendisliği ve hücre tedavileri için temel oluşturur.

EAK 16-II ile FACS Arıtılmış Timik Epitel Hücreleri 3-D Toplama Teşvik / EAKIIH6 Kendi toplanan Hidrojel

Daha fazla video keşfet