Name: Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Keşfedin bitki dokularında fotosentez membranlarının süpramoleküler organizasyonunu kriyotarama elektron mikroskobu ile. Bu yöntem, tylakoid membranlarının yerel hücresel bağlamda yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz elektron mikroskobu görüntüleme tarayarak onun yararlı tavsiyeler için Andres KAECH (Zürih Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma ABD-İsrail Binational Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu (hayır verin. ABD-4334-10, ZR), İsrail Bilim Vakfı (hayır verin. 1034/12, ZR) ve İnsan Frontier Bilim Programı tarafından desteklenen (RGP0005 / 2013 ZR). elektron mikroskobu çalışmaları Weizmann Bilim Enstitüsü Irving ve Nano için Cherna Moskowitz Merkezi ve Bio-Nano Görüntüleme yürütülmüştür.

Yüksek basınçlı Dondurma Leaf Dokuların 1. Cryo-sabitleme Not: Bu bölüm, bir dondurma-kırık deney için yaprak dokularının yüksek basınçlı dondurma yürütmek açıklamaktadır. Bitki örneklerinde ilgili hususlar için 29 bkz. Bu, bazı değişikliklerle doku ya da örneklerin diğer türleri için uyarlanabilir. <ol><li> Bir traş makinesi bıçak köşesi kullanılarak, (Şekil 1), bir 0.1 / 0.2 mm alüminyum trombosit 0.1 mm boşluğunun alt kazıyın. en az bir düzine trombositler (6 örnek) hazırlayın. Diskin çevresi üzerinde bıçak işaretleri oluşturmak için değil dikkatli olun. <ol><li> çizilmemesi sonra, mutlak etanol diskleri yıkama kurumaya bırakın ve temiz bir tabak içinde tutun. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak, yüksek basınçlı dondurma makinesi hazırlayın. izopropanol ile yüksek basınçlı dondurma makinenin alkol odasına doldurun. </li><li> Bir ev yapımı vakum destekli infiltrasyonu hazırlayınN cihazı sıvıyla yaprak dokusunda bulunan gaz değiştirmek için kullanılır. <ol><li> Sıkıca bir 10 ml şırınga sonuna kadar 200 ul pipet bağlayın. ucu ~ 1 cm kesin. sıkıca kesme ucu sığdırmak için 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kapağı bir delik açın. Vakum şırınga pistonu çekerek tüp içinde oluşturulabilir. </li></ol></li><li> Bir jilet kullanarak bitkiden yaprak küçük bir parça kesin ve cımbızla 1-heksadekanda ile yarım dolu bir mikrosantrifüj tüp içine yaprak yerleştirin. nazikçe vakum oluşturmak için piston çekerek sıvı ile yaprak arası boşluk sızmak, yaklaşık 30 saniye basılı tutun ve sonra pistonu yavaşça serbest bırakın. </li><li> cımbız kullanarak tüpten yaprak parçasını çıkarınız. 0.2 mm&#39;den kalın olması durumunda bir jilet ile yaprak Trim ve trombosit uyacak küçük bir parça kesti. </li><li> donma Makinenin tutucu içine çizilmiş tarafı temiz bir platelet yerleştirin ve sonra le kesim parça yertrombosit içine af. 1-heksadekanda ile yaprak çevreleyen kalan boşluğu doldurmak. yaprak bakan çizik, başka trombosit kullanarak sandviç kapatın. </li><li> Kapatın ve tutucu sıkın ve makinenin haznesine takın. Sonra (~ 300 2100 bar - 500 ms) dondurmak için &#39;Jet&#39; düğmesine basın ve hızlı bir şekilde sıvı azot içine tutucu aktarın. Dikkatle sandviç kırık özen önceden soğutulmuş cımbız kullanarak sahibinden dondurulmuş sandviç çıkarın. Not: Kapalı dondurulmuş sandviç hemen kırılan dondurma veya daha sonra kullanmak için sıvı nitrojen içinde muhafaza olabilir. sıvı azot kullanırken koruyucu kıyafet ve gözlük kullanın. </li></ol> 2. Freeze-kırık ve çift katmanlı Kaplama 27,28 <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, platinyum / karbon (Pt / C) ve karbon buharlaşması için iki tüfek de dahil olmak üzere kullanımı için dondurma parçalama makinesi hazırlayın. 45 derece Pt / C silahı yerleştirin birnd 90 derecede karbon tabancası. <ol><li> Ön programı Pt / C (kaplama oranı 0,02-0,04 nm / saniye) bir 2-mil tabakanın bir kaplama düzeni ile (0.1 nm / saniye ° &#39;de) bir karbon 6 nm katman. <ol><li> donma-kırık makinenin ekranında kurulumuna girin. Kaplama şeması kaydedilecek bir kullanıcı numarası seçin. </li><li> &#39;Katman 1&#39; için Pt / C seçin. Bir zaman çerçevesi seçin örneğin., 5 dk (kaplama tamamlamak için gereken gerekli zamanı aşmak için). 2 nm kalınlığında tanımlamak için yukarı-aşağı okları kullanın. </li><li> seçin karbon dışında, 2. adımları tekrarlayın 2.1.1.2 Layer taşımak ve 6 nm&#39;lik bir kalınlığa tanımlamak için &#39;Katman&#39; düğmesine basın. </li></ol></li><li> Test ve silah operasyonu ayarlayın. <ol><li> Seç &#39;Katman 1&#39;. &#39;GUN1&#39; düğmesine basarak Pt / C silahı seçin ve dondurarak kırık makinesinin buharlaşma kontrol ünitesindeki &quot;ON&quot; butonuna basın. buharlaşma oranını izlemek ve unt gerilim ve emisyon düğmeleri kullanarak ayarlayın0.04 nm / sn - il 0.02 oranında ulaştı. Basın &#39;KAPALI&#39; Pt / C silahı kapatmak için. </li><li> Seç &#39;Layer 2&#39;. select &#39;GUN2&#39; dışında, 2.1.2.1 tekrarlayın ve 0.1 nm / sn ~ bir buharlaşma oranı ayarlayın. </li></ol></li></ol></li><li> (Hidratlı veya susuz yaprakları, sırasıyla) -140 ˚C veya -160 ˚C için donma kırık sistemi sahne soğutun. Makineye vakum cryo transfer servisi takın ve sıvı azot ile odasını doldurun. -7 10 X 8 mbar - soğutuldu donma-fraktür odasındaki basınç genelde 1 arasındadır. </li><li> Yükleme istasyonu içine dondurma kırılma örnek tutucu (3 mm trombositlerin için uygundur) yerleştirin. sıvı azot ile yükleme istasyonu odasını boyayın. </li><li> yüksek hassasiyetli sınıf cımbız kullanarak tek sahibi birinin üzerine iki dondurulmuş sandviç yükleyin. yerine güvenli sığar olmadığını kontrol etmek yuvasını ters çevirin sonra tutucu içine ilk sandviç sıkın ve. İkinci sandviç için tekrarlayın. </li><li> Ddonma kırık makineden soğutulmuş mekik etach ve yükleme istasyonuna bağlayın. , Mekik vanasını açın tutucu içine geri çekme kolunu tanıtmak ve yerine oturtun. mekik içine tutucu ile yeniden kol-tanıtmak ve yükleme istasyonu düğmesini kullanarak mekik vanasını kapatın. dondurarak kırık makinesine transfer takın ve geri çekme kolu ile odasına tutucu tanıtmak. makineden mekik ayırın. </li><li> o sandviç üst trombositler knock off gibi bir yüksekliğe donma kırık mikrotom bıçak hizalayın. </li><li> mikrotom bıçakla, hızlı sandviç kırmak ve daha sonra hemen bıçak enkaz yapışan tarafından örneklerin bulaşmasını önlemek için o kadar yükseltmek ve su molekülleri tarafından olası kontaminasyon örnekleri korumak için yeni maruz kalan düzlemin üzerinde soğutulmuş deklanşör açmak odası. </li><li> Coat platin ve karbon örnekleri. <ol><li> sc üzerinde &#39;Layer 1&#39; Enterreen. &quot;ON&quot; butonuna ardından &#39;GUN1&#39; düğmesine basarak Pt / C tabancası açın. buharlaşma oranını incelemek ve 0.02 ulaştığında - 0.04 nm / sn, aynı anda örnekleri ortaya çıkarmak ve biriken tabakasının kalınlığını izlemek için &#39;Tedbir&#39; düğmesine basın. Not: kalınlığı önceden seçilmiş değere ulaştığında Gun otomatik olarak kapanacaktır. </li><li> Pt / C buharlaşma tamamlandığında çekim ile örnekleri örtün. </li><li> &#39;Katman 2&#39; geçmek için &#39;Katman&#39; düğmesine basın. Tekrar (karbon) &#39;GUN2&#39; ve 0.1 nm / saniye ~ bir buharlaşma hızını seçme hariç olmak üzere, 2.8.1 ve 2.8.2 adımları tekrarlayın. </li></ol></li><li> -120 ˚C için donma kırık sistemi sahne ısıtın. </li></ol> 3. Elektron Mikroskop Cryo-taramaya <ol><li> cryo çalışmaları için taramalı elektron mikroskobu hazırlayın. <ol><li> ana menü ve onaylayın Sahne / Sahne initialise seçin. </li><li> Seç Araçları / Goto Panel ve listeden seçerek &#39;Airlock&#39; panelini açın. &#39;Close Sütun Odası Vana&#39; düğmesine tıklayın. &#39;Vakum&#39; sekmesinin altında Vent butonuna tıklayarak mikroskop odasına havalandırın. </li><li> Seç Araçlar / Goto Paneli ve &#39;Sahne Noktaları Listesi&#39; panelini açın. Numune tutucu kabul edilmesi için uygun koordinatlara sahne taşımak için cryo değişim konumunu seçin. Not: &#39;cryo-döviz pozisyonu&#39; vakum transfer ünitesinin pozisyonu ile uyum içinde olması için ayarlanmıştır. </li><li> eldiven temiz bir çift ile numune odasına açın ve mikroskop ana sahneye cryo-sahne yerleştirin. odasına kapatın ve &#39;Vakum sekmesi&#39; altındaki Pompa düğmesine tıklayın. </li><li> -120 ˚C için mikroskop soğutun. sıvı azot ile mikroskop Dewar doldurun. Sahnenin sıcaklığı altında -120 ˚C düşer kez -120 ˚C için cryo-devret kontrol ünitesindeki ısı fonksiyonunu etkinleştirin. </li></ol></li><li> Avmikroskop cryo transfer servisi ach ve (adım 2.5 gibi) mikroskop cryo aşamasında içine geri çekilme kolunu kullanarak örnek tutucu aktarın. mikroskop mekik ayırın. </li><li> Airlock Masası&#39;nda &#39;Açık Sütun Odası Vana&#39; butonuna tıklayın. </li><li> joystick&#39;i kullanarak - dikkatle objektif lens (2 mm çalışma mesafesi 1) yakın örnek tutucu taşıyın. &#39;Delikler&#39; Tab 10 mikron diyafram seçin. &#39;Gun&#39; sekmesinde EHT alanını çift tıklatın. EHT hedef için 10 (kV) girin ve Tamam&#39;a tıklayın. alt EHT sekmesine tıklayın ve &#39;EHT On&#39; seçeneğini seçin. </li><li> &#39;Dedektörlerinin&#39; sekmesinde Dedektörleri açılan listeden &#39;InLens&#39; seçin. Uygun gibi görüntüleme koşulları (odak, parlaklık ve kontrast, ışın hizalama, astigmatizma) optimize edin. </li><li> &#39;Tarama&#39; sekmesine tıklayın. ışın zararı en aza indirmek için (piksel başına NSEC 100 bir bekleme süresine tekabül &#39;Tarama Hızı = 1&#39;), bir hızlı tarama seçin ve1024 x 768 piksel bir &#39;Store çözünürlük&#39;. &#39;Gürültü Azaltma&#39; açılır listesinden &#39;Satır Ort&#39; seçeneğini seçin. arama için 30 satır - 20 N değerini ayarlayın. Kırık hücreler ve kloroplastların (Şekil 2A ve 2B) ile bölgeler aramak için (klavyedeki Kontrol sekmesine basarak) &#39;Merkezi Noktası&#39; fonksiyonunu kullanarak örnek taşıyın. </li><li> (- 70 kX 50) (Şekil 2C ve 2D) düşük büyütmelerde kırık kloroplast görüntü kazanır. Ilginç kloroplast kırık yüzleri yakınlaştırmak ve yüksek büyütme görüntüler elde etmek için (klavyedeki kontrol-shift-sekmesine basarak) &#39;Merkezi Özelliği&#39; fonksiyonunu kullanın (100-200 Kx, 3 Şekiller ve 4). Görüntü elde etmek için adım 3.6 ile aynı parametreleri kullanın, ancak gürültü azaltma 30 N&gt; 100 Line Ort değerini değiştirin. <ol><li> Ana mikroskop kontrol ünitesindeki veya &#39;Tarama&#39; sekmesine basın Freeze Taramayı durdurmak ve kaydetmek için&#39;Kaydet TIFF&#39; düğmesine basarak resim. </li></ol></li></ol> 4. Görüntü Analizi Not: Bu bölüm Fiji 31 açık kaynak paketi kullanarak dondurarak kırık SEM görüntüleri zar parçacıklarının segmentasyon için kısa yordam açıklanır. Benzer sonuçlar diğer görüntü analiz yazılımı ile elde edilebilir. <ol><li> Ana program penceresinin içine resim dosyasını sürükleyerek Fiji Açık görüntüsü. Görüntü Türü / / 8-bit seçerek 8-bit görüntü dönüştürmek. Resim Seç / / Parlaklık / Kontrast ayarlama ve gerektiğinde (Şekil 5A) ayarlayın. </li><li> Düz Çizgi aracını kullanarak, bir çizgi gömülü görüntü ölçek çubuğunun boyutunu çizin. / Set Scale Analiz seçin. Doğru ölçek bilgisi (uzunluk Bilinen mesafe ve Birim) girin ve Tamam&#39;a tıklayın. Bu düzeltilmiş ölçekli görüntü kaydetme. </li><li> Seçin Süreci / Filtreler / Gauss bulanıklığı (1.5 nm çapında) ve OK (Şekil 5B) tıklayın. </li><li> Resim Seç / / Aut ayarlayıno Yerel Eşik (Niblack yöntemini kullanarak) ve OK (Şekil 5C) tıklayın. </li><li> Düzen / Invert ve Süreç seçin / Binary / Havza (Şekil 5D). </li><li> Serbest Seçim aracıyla faiz (ROI) bölgenin etrafında bir sınır çizin. / Seçerek Düzenleme / Seçime Göre ROI yöneticisi seçimi ekleyin Manager veya &#39;T&#39; tıklayarak ekleyin. </li><li> Dış Düzen / Temizle (Şekil 5E) seçin. </li><li> , / Set Ölçümleri Analiz seçin uygun parametreler (örneğin, alan, uygun elips) seçin. </li><li> Analiz seçin / Parçacıklar analiz edin. seçeneği &#39;kenarlarında hariç tut&#39; ve Tamam&#39;a tıklayın gerekirse, &#39;Yöneticisi Ekle&#39; ve partiküllerin boyutu için uygun bir aralık girin ve &#39;sonuçlarını görüntüle&#39; işaretleyin. Sonuç Şekil 5F&#39;de gösterilmektedir. </li><li> Kaydedilen ölçekli görüntülü dosyayı (adım 4.2) açın. &#39;Göster Tüm seçin ve ROI Yöneticisi&#39; Etiketler &#39;kaldırın. Seçilen seçe gözdenles Orijinal görüntünün üzerine koydu ve elle ekleyebilir veya YG Müdürü düğmeleri &#39;Ekle&#39; veya &#39;Sil&#39; kullanarak seçimleri kaldırın. Serbest Seçim aracını ve ROI Yöneticisi (Şekil 5G ve 5H) ve &#39;Update&#39; düğmesini kullanarak gerekli her türlü seçimleri düzeltin. </li><li> Elde edilen ölçümler kullanarak verileri analiz edin. Sonuçları penceresinde, / Sonuçlar tıklayın elde etmek özetler, örneğin, ortalama Alanı ve Binbaşı ve ROI Yöneticisi&#39;nde listelenen parçacıkların küçük eksenlerini anlamına gelir. Sonuçları / Dağıtım tıklayın (örneğin Alan gibi) Parametre seçmek ve bu parametre için bir histogram görüntülemek için Tamam&#39;a tıklayın. </li></ol>

<ol><li>Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+consequences+of+grana+stacking+of+thylakoid+membranes+in+vascular+plants%3A+a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective.</a> Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).</li>
<li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+Faces+of+Frozen+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fracture Faces of Frozen Membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).</li>
<li>Branton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Etching+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze-Etching Nomenclature.</a> Science. 190 (4209), 54-56 (1975).</li>
<li>Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Differentiation+of+Stacked+and+Unstacked+Chloroplast+Membranes+-+Freeze-Etch+Electron+Microscopy+of+Wild-Type+and+Mutant+Strains+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas.</a> J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).</li>
<li>Simpson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Fracture+Studies+on+Barley+Plastid+Membranes+.6.+Location+of+the+P700-Chlorophyll+a-Protein-1%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1.</a> Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).</li>
<li>Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Particle+Movements+Associated+with+Unstacking+and+Restacking+of+Chloroplast+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Invitro.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes.</a> Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).</li>
<li>Miller, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chloroplast+Membrane+Lacking+Photosystem-I+-+Changes+in+Unstacked+Membrane+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).</li>
<li>Miller, K. R., Cushman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Membrane+Lacking+Photosystem-II+-+Thylakoid+Stacking+in+the+Absence+of+the+Photosystem-II+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle.</a> Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).</li>
<li>Miller, K. R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Thylakoid+Outer+Surface+-+Coupling+Factor+Is+Limited+to+Unstacked+Membrane+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions.</a> J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).</li>
<li>Simpson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Fracture+Studies+on+Barley+Plastid+Membranes+.3.+Location+of+the+Light-Harvesting+Chlorophyll-Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Carlsberg+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein.</a> Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).</li>
<li>Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Identification+of+the+Exoplasmic+Face+Particles+on+the+Freeze-Fractured+Thylakoid+Membranes+-+a+Study+Using+Double+and+Triple+Mutants+from+Chlamydomonas-Reinhardtii+Lacking+Various+Photosystem-Ii+Subunits+and+the+Cytochrome+B6%2FF+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex.</a> Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).</li>
<li>Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Cytochrome+B6%2FF+Complex+.2.+Localization+of+the+Complex+in+the+Thylakoid+Membranes+from+Spinach+and+Chlamydomonas-Reinhardtii+by+Immunocytochemistry+and+Freeze-Fracture+Analysis+of+B6%2FF+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants.</a> Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).</li>
<li>Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Relationship+between+Light+Harvesting+Complex+and+Photosystem-1+and+Photosystem-2+in+Stacked+and+Unstacked+Chloroplast+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes.</a> J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).</li>
<li>Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+structure%3A+from+chlorophyll+granules+to+supra-molecular+architecture+of+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes.</a> Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).</li>
<li>Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition%2C+architecture+and+dynamics+of+the+photosynthetic+apparatus+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants.</a> Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).</li>
<li>Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+and+Organelles+of+Dehydrated+Selaginella+and+Tortula+Retain+Their+Normal+Configuration+and+Structural+Integrity+-+Freeze-Fracture+Evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence.</a> Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).</li>
<li>Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+use+of+intact+plant+tissues+in+freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).</li>
<li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture%2Ffreeze-etch+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> J. Vis. Exp. (91), e51694(2014).</li>
<li>Kirchhoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-light-induced+formation+of+semicrystalline+photosystem+II+arrays+in+higher+plant+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts.</a> Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).</li>
<li>Johnson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotective+Energy+Dissipation+Involves+the+Reorganization+of+Photosystem+II+Light-Harvesting+Complexes+in+the+Grana+Membranes+of+Spinach+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts.</a> Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).</li>
<li>Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+photosystem+II+organization+in+grana+thylakoid+membranes%3A+evidence+for+a+structured+arrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement.</a> Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).</li>
<li>Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Light-harvesting+superstructures+of+green+plant+chloroplasts+lacking+photosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems.</a> Plant Cell Environ. , (2015).</li>
<li>Goral, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-harvesting+antenna+composition+controls+the+macrostructure+and+dynamics+of+thylakoid+membranes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis.</a> Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).</li>
<li>Charuvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection+Conferred+by+Changes+in+Photosynthetic+Protein+Levels+and+Organization+during+Dehydration+of+a+Homoiochlorophyllous+Resurrection+Plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant.</a> Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).</li>
<li>Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Mechanisms+of+Desiccation+Tolerance+in+Selected+Angiosperm+Resurrection+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Stress%22%5BJournal%5D)">An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants.</a> Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).</li>
<li>Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalther%2C+P+%22Biological+Low-Voltage+Scanning+Electron+Microscopy%22">Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy</a>. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).</li>
<li>Walther, P., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-layer+coating+for+field-emission+cryo-scanning+electron+microscopy--present+state+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications.</a> Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).</li>
<li>Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-layer+coating+for+high-resolution+low-temperature+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy.</a> J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).</li>
<li>Hess, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreparation+methodology+for+plant+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryopreparation methodology for plant cell biology.</a> Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).</li>
<li>Nevo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+Thylakoid+Membrane+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Photosynth%22%5BJournal%5D)">Architecture of Thylakoid Membrane Networks.</a> Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu yazıda anlatılan teknik cryo-tarama elektron mikroskobu ile iyi korunmuş yüksek basınçlı donmuş bitki dokularının kapsamında dondurularak kırık membranların soruşturma sağlar. Bu prosedürler kullanılarak en büyük avantajı, numune hazırlama tamamen fiziksel olmasıdır; kimyasallar veya dehidratasyon içeren hiçbir adım gereklidir. Bu nedenle, yakın bir Yerli durumda 26,32 biyolojik yapılar üzerinde çalışma sağlar. Yaprak dokuları kullanmanın yararı bir kloroplast içinde, yani kendi ana fizyolojik bağ...

Oksijenik fotosentez, antik siyanobakteri menşeli, kloroplast organelle gelişmesine yol açmıştır endosimbioz olaylarla yosun ve kara bitkileri tarafından miras. Bütün günümüz oksijenik fototroflardır olarak, fotosentetik elektron taşıma ve proton motif kuvvet üretimi ve indirgeme gücü &#39;tilakoit&#39; membranlar olarak adlandırılan düzleştirilmiş kese benzer kesecikler içinde yürütülmektedir. Bu membranlar fotosentezin ışık güdümlü reaksiyonlar yürütmek ve enerji iletimi için bir ortam sağlamak protein kompleksleri ev. Bitkiler ve (bazı) alg tilakoit membranlar iki ayrı morfolojik etki alanlarına ayrılır: &#39;stroma lamel&#39; olarak adlandırılan &#39;grana&#39; ve granaları birbirine istiflenmemiş membranlar denilen sıkı appressed zar bölgeleri, 1. bitki ve alg tilakoit membranlarda çeşitli donma-fraktür çalışmaları 1970&#39;lerde başlayarak gerçekleştirilmiştir. Ne zaman donma-kırık, membranlarHücresel bölmeye bağlı bir exoplasmic yüzü (EF) ve bir protoplazmik yüz (PF) üreten, kendi hidrofobik çekirdek 2 boyunca bölünmüş olan yarı-zar sınırları, aslında Branton ve arkadaşları tarafından icat olarak. ., sırasıyla &#39;s&#39; ve &#39;u&#39; ifade eden &#39;yığılmış&#39; ve &#39;unstacked&#39; zar bölgeleri ile, EF&#39;lerine, EFU, Proje Fişlerini ve Pfu: 1975 yılında 3 Bitki ve alg thylakoid dört farklı kırılma yüzleri var. bölünmüş veya kırık olmayan membran protein kompleksleri, E veya zarın P tarafı biriyle kalması eğilimi var. Thylakoid&#39;in farklı kırılma yüzeyleri farklı büyüklüklerde olan ve yoğunluklarını 4 ve ardından çok sayıda soruşturma içeren ilk gözlem, açık reaksiyonlar yürütmek görülen parçacıklar ve membran protein kompleksleri ile tanımlanması ve korelasyon yol 5-13 (ayrıca bkz 14,15 değerlendirmeleri). fretilakoit membranların eze-kırık deneyler genellikle izolasyon işlemi sırasında oluşabilecek yapısal ve / veya supramoleküler kuruluşta herhangi bir değişiklik riski, (ama 16,17 bakınız) kloroplastlar veya izole tilakoit membranlarda hazırlıkları yürütülmektedir. Kırık ardından kopyaları daha sonra karbon (C) ve kalın bir tabaka ile platin / karbon (Pt / C), buharlaştırma ile hazırlanır, ve biyolojik madde 18 son olarak sindirim. Replicas transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından görüntülenmiştir. Geleneksel dondurarak kırık-çoğaltma tekniği farklı için supramoleküler fotosentez membranların organizasyon ve adaptasyon eğitimi için önemli bir araç, örneğin olarak hizmet vermeye devam etmektedir., Hafif, koşullar 19-23. Craterostigma 24 pumilum homoiochlorophyllous diriliş bitki bizim son çalışmada, biz supramoleküler organizasyon o değişiklikleri incelemeyi amaçladıkdehidrasyon ve rehidrasyon sırasında f tilakoit membranlar yanı sıra genel hücresel organizasyonu. homoiochlorophyllous Resurrection tür özgünlüğü onların fotosentetik cihaz koruyarak, kendi bitkisel dokularda (yaprak) içinde kuruma koşulları hayatta mümkün olmasıdır. Su kullanılabilir olduğunda, bu bitkiler kurtarmak ve birkaç gün ila 25 saat içinde fotosentez etkinliğini devam ettirir. Bu çalışma için, donma-kırık yaprak örneklerinin cryo-tarama EM (SEM) görüntüleme yüksek basınçlı örnek cryo-Hareketsizleştirmesi için dondurma ile kombine edildi. Bu işlemler kendi ana devlete 26 yakın bir devlet olarak dondurulmuş sulu biyolojik örnekler görselleştirmek için bir araç sağlar. Bir ana yararı örnekleri herhangi bir ardışık adımlarda ile dondurularak kırılma ve kaplamanın hemen sonra incelenir olmasıdır. hidrasyon durumu hazırlanması sırasında korunur gibi bu, farklı bağıl su içeriği (RWC) bitkilerin araştırılmasında özellikle uygundur. NasılHiç, bir kritik dezavantaj fotosentez komplekslerinin büyüklüğünün doğru ölçümü için gerekli olan yüksek büyütme, tarandığında dondurulmuş sulu numuneler özellikle, görüntüleme sırasında kiriş hasar muzdarip olabilir olmasıdır. Bunun üstesinden gelmek için, bir yöntem &#39;çift katmanlı kaplama&#39; (DLC) özel cryo-SEM görüntüleme koşulları yararlanılmıştır ile birlikte 27,28 denir. Bunlar önemli ölçüde daha az ışın duyarlı numunelerin sonuçlandı ve fotosentetik protein supramoleküler örgütü ve diriliş bitki C diğer hücresel bileşenleri hakkında değerli bilgiler aydınlatılması için izin in situ yüksek büyütme oranlarında pumilum.

<table><tbody><tr><td>Etanol abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-hekzadesen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0.1/0.2 Trombosit</td><td>Mühendislik Ofisi M. Wohlwend GmbH, İsviçre</td><td>241</td><td>Trombositler 3 mm çapında ve 0,5 mm kalınlığındadır (Tip A) ve 0,1/0,2 mm derinliğinde boşluklar (çap 2 mm). Benzer trombositler Leica Microsystems'den de elde edilebilir.</td></tr><tr><td>Yüksek hassasiyetli dereceli cımbız</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72706-01</td><td>Dumont (İsviçre) Durostar tarzı #5 cımbız; Diğer yüksek hassasiyetli cımbızlarla değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Yüksek basınçlı dondurma makinesi</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>Yüksek basınçlı dondurma alternatifleri: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Mikro Sistemler; 4. EM HPM 100, Leica Mikro Sistemler; 5. EM BUZ, Leica Mikro Sistemler.</td></tr><tr><td>Donma-kırılma sistemi</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>Kriyo hazırlama yükleme aşaması</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>Tek yönlü donarak kırma için numune tutucu</td><td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>3 mm çapında numune taşıyıcılar için kelepçe tutucu</td></tr><tr><td>Vakumlu kriyo-transfer mekiği</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>Taramalı elektron mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SEM aşaması</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü edinme yazılımı</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Fiji/Image J, Ulusal Sağlık</td><td>Enstitüsü http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından freeze-kırık yaprak dokular içinde fotosentez membranlarının supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Dondurularak kırık numunelerin Cryo-taramalı elektron mikroskobu (SEM) yakın yerli koşullarında biyolojik yapıların soruşturma sağlar. Burada, yaprak örneklerinde içinde fotosentetik (tilakoit) membranların supramoleküler örgütü incelemek için bir teknik açıklar. Bu yüksek basınçlı yaprak dokularının dondurma, dondurma-kırılma, çift katmanlı bir kaplama ve son olarak kriyo-SEM görüntü alma ile elde edilir. çift ​​katmanlı kaplama yönteminin kullanımı yüksek büyütme elde veriyor (&gt; 100,000X) dondurulmuş sulu numuneler için en az ışın hasar yanı sıra en az şarj etkileri ile görüntüler. Açıklanan prosedürler kullanılarak in situ, diriliş bitki Craterostigma pumilum dehidrasyonu sırasında gerçekleşecek fotosistem ve hafif hasat anten protein kompleksleri supramoleküler dağılımındaki değişiklikler araştırıldı.

Şekil 1 yüksek basınçlı dondurulmuş, donma-kırık Craterostigma pumilum yaprak parçalarını içeren trombosit cryo-SEM görüntüleri gösterir. Bazı örneklerde ise, kırık hücrelerin büyük bölgeleri (Şekil 1A) elde edilir. Diğerlerinde, yaprak parçası sıkıca üst diske bağlı kalır ve onunla (Şekil 1B) boyunca çaldı edilir. Ancak, hatta ikinci durumda, bazı yaprak dokusu hala yaprak &quot;kalıntılarını&quot; görüntüleme suretiyle de tahs...

Burada donarak kırılmış bitki dokularını incelemek için bir prosedürü açıklıyoruz. Yüksek basınçlı donmuş yaprak numuneleri, dondurularak kırılır ve çift katmanlı kaplanır, bu da minimum ışın hasarı ile yüksek büyütmelerde kriyo-taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenen iyi korunmuş donmuş hidratlı numuneler verir.

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Bu tekniğin genel amacı, dondurularak kırılmış yaprak doku örneklerinin kriyojenik taramalı elektron mikroskopisi ile fotosentetik membranların supramoleküler organizasyonunu incelemektir. Bu yöntem; hücrelerin ve organellerin morfolojik karakterizasyonu, membrana entegre protein komplekslerinin dağılımı ve biyominerallerin lokalizasyonu gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dondurularak kırma işleminin yaprak dokuları üzerinde gerçekleştirilmesidir; böylece tilakoid membran supramoleküler organizasyonu, doğal organel ve hücresel bağlam içerisinde incelenmiş olur.Bu yöntem burada biyolojik bir örnek üzerinde gösterilmiş olsa da jeller, polimerler ve ilaç iletim sistemleri gibi örneklere de uygulanabilir. Genel olarak, bu prosedürlerde yeni olan kişilerin, tüm örneklerin iyi dondurulmayabileceği veya düzgün şekilde kırılmayabileceği konusunda dikkatli olmaları gerekir. Yüksek basınçlı dondurma ile yaprak dokularının kriyofiksasyonunu gerçekleştirmek için, 0,1 ila 0,2 milimetrelik bir alüminyum plakçığın 0,1 milimetrelik boşluğunun tabanını bir jilet köşesiyle çizerek başlayın.Altı örnek için en az bir düzine trombosit hazırlayın. Ardından trombositleri yıkamak için mutlak etanol kullanın ve onları temiz bir kapta tutun. Yüksek basınçlı dondurma cihazını hazırladıktan sonra, örnek kutusunu sıvı azot ile doldurun.Bir jilet yardımıyla bitkiden küçük bir yaprak parçası kesin ve bir cımbız kullanarak dokuyu, yarıya kadar heksadekan ile doldurulmuş bir mikrosantrifüj tüpünün içine yerleştirin. Yaprak dokusunun hücreler arası boşluklarını infiltre etmek için, metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanmış infiltrasyon cihazının ucunu mikrosantrifüj tüpü kapağındaki deliğe yerleştirin ve vakum oluşturmak için pistonu geri çekin. Yaklaşık 30 saniye sonra pistonu serbest bırakın.Ardından, bir cımbız kullanarak yaprak parçasını tüpten çıkarın. Bir lam üzerine sığacak kadar küçük bir parça kesmek için jilet kullanın. Gerekiyorsa, yaprağı 0.2 mm'den daha düşük bir kalınlığa gelecek şekilde kırpın.Doku çökmesini önlemek için, yüksek basınçlı dondurma öncesinde yapraklara sıvı infiltrasyonu uygulanır. Vitrifiye bir örnek elde etme şansını maksimize etmek için örnek kalınlığı 200 mikronun altında tutulur. Temiz bir lamı, çizikli yüzeyi yukarı bakacak şekilde dondurma makinesinin tutucusuna yerleştirin.Ardından, kesilen yaprak parçasını plaka üzerine yerleştirin. Sandviç yapısını kapatmak için çizikleri yaprağa dönük başka bir plaka kullanmadan önce, plakanın geri kalan boşluğunu doldurmak için heksadekan kullanın. Tutucuyu kapatın ve sıkın.Jet düğmesine basarak numuneyi dondurun. Ardından, tutucuyu hızla sıvı azota aktarın. Sandviçi tutucudan çıkarmak için ön soğutmalı cımbız kullanın ve bunu yaparken örneği kırmamaya dikkat edin.Prosedürde iki kritik adım bulunmaktadır: rastgele bir süreç olan ve başarısı yalnızca cryo-SEM'de değerlendirilebilen dondurarak kırma (freeze-fracture) ile minimum demet hasarıyla yüksek büyütmeli görüntüler elde etmek için gerekli olan çift katmanlı kaplama. Dondurarak kırma cihazını üretici talimatlarına göre hazırlayıp programlarken, platin karbon veya Pt/C tabancasını 45 dereceye, karbon tabancasını ise 90 dereceye yerleştirin. Dondurarak kırma sistemi tablasını eksi 140 veya eksi 160 °C'ye soğutun.Ardından vakumlu kriyojenik transfer mekiğini cihaza takın ve mekik haznesini doldurmak için sıvı azot kullanın. Dondurma-kırılma (freeze-fracturing) numune tutucusunu yükleme istasyonuna yerleştirin ve yükleme istasyonu haznesini sıvı azotla doldurun. Sonra, yüksek hassasiyetli pensler kullanarak dondurulmuş sandviçi tutucuya yerleştirin ve sabit olacak şekilde sıkıştırın.Ardından, sandviçin yerine sabitlendiğini kontrol etmek için tutucuyu ters çevirin ve aynı işlemi ikinci bir sandviç için tekrarlayın. Soğutulmuş mekiği dondurma-kırılma (freeze-fracture) makinesinden ayırın ve yükleme istasyonuna bağlayın. Sonra mekik valfini açın, geri çekme kolunu tutucunun içine yerleştirin, kolu sabitleyin ve tutucuyla birlikte kolu tekrar mekiğe yerleştirin.Mekik, dondurarak kırma cihazına yeniden takıldıktan sonra, geri çekme kolunu kullanarak tutucuyu hazneye yerleştirin. Şimdi, dondurarak kırma mikrotom bıçağını, sandviçlerin üst plakalarını koparacak şekilde yüksekliğe göre hizalayın. Mikrotom bıçağı ile sandviçleri hızla kırın.Ardından, bıçağa yapışan kalıntıların numuneleri kontamine etmesini önlemek için bıçağı hemen yukarı kaldırın. Oda içerisindeki su moleküllerinin neden olabileceği olası kontaminasyondan numuneleri korumak için soğutulmuş panjuru yeni açığa çıkarılan düzlemin üzerine yerleştirin. Daha sonra numuneleri platinle kaplamak için ekranda Katman 1'i görüntülemek amacıyla Setup düğmesine basın.Ardından, önce GUN 1 butonuna, ardından ON butonuna basarak Pt/C tabancasını açın. Buharlaştırma hızını inceleyin ve hız saniyede 0.02 ila 0.04 nanometreye ulaştığında, örnekleri aynı anda maruz bırakırken biriktirilen tabakanın kalınlığını izlemek için Measure butonuna basın. Karbon kaplama yapmak için GUN 2'yi seçip ardından ON butonuna basın.Buharlaşma hızı yaklaşık 0.1 nanometers per second olduğunda, Ölç buttonuna basın ve aynı anda örnekleri açığa çıkarmak için perdeyi hareket ettirin. Kaplama tamamlandığında, tablasını minus 120 degrees Celsius'e ısıtın. Taraman elektron mikroskobunu kriyojenik çalışma için hazırlamak amacıyla, ana menüden Stage, Stage Initialize seçeneklerini belirleyin ve onaylayın.Vacuum sekmesi altında, mikroskop haznesini tahliye etmek için Vent düğmesine tıklayın. Ardından Tools, Goto Panel seçeneklerini belirleyip Stage Points List panelini açın. Numune tutucuyu kabul etmek için sahneyi uygun koordinatlara taşımak üzere CRYO EXCHANGE konumunu seçin.Temiz bir çift eldiven giyerek numune haznesini açın ve kriyostage'i mikroskobun ana tablasına yerleştirin. Hazneyi kapatın ve Vakum sekmesi altında Pompa düğmesine tıklayın. Ardından, mikroskop duor'unu sıvı nitrojen ile doldurarak mikroskobu soğutun.Sahne sıcaklığı -120 °C'nin altına düştüğünde, sahneyi -120 °C'ye ısıtmak için kriyotransfer ünitesindeki ısıtma fonksiyonunu etkinleştirin. Şimdi kriyotransfer mekiğini mikroskoba takın ve numune tutucuyu geri çekme kolunu kullanarak mikroskop kriyo sahnesine transfer edin. Joystick yardımıyla, numune tutucuyu dikkatli bir şekilde objektif lensine yaklaştırın.Apertures sekmesinde, 10 mikronluk apertürü seçin. Ardından, Gun sekmesinde, EHT Target alanına çift tıklayın, EHT hedefi için 10 kilovolt değerini girin ve OK'ye tıklayın. Daha sonra, hızlandırma voltajını açmak için alttaki EHT sekmesine tıklayın ve EHT On seçeneğini belirleyin. Detectors sekmesinde, açılır listeden InLens seçeneğini seçin. Ardından Scanning sekmesine tıklayın; demet hasarını minimize etmek için hızlı bir tarama olan bir değerinde bir tarama hızı ve 1024 x 768 piksel boyutunda bir depolama çözünürlüğü seçin.Gürültü Azaltma (Noise Reduction) açılır listesinden Çizgi Ortalaması (Line Average) seçeneğini belirleyin ve arama yapmak için n değerini 20 ila 30 çizgi arasında ayarlayın. Ardından, klavyedeki Control ve Tab tuşlarına tıklayarak, kırılmış hücrelerin bulunduğu bölgeleri tanımlamak amacıyla eş zamanlı olarak büyütme yaparken merkez nokta fonksiyonunu kullanarak numuneyi ilgi alanlarına taşıyın. Kırılmış hücrelerin bulunduğu bölgeleri belirledikten sonra, kırılmış bir kloroplast bulmak için büyütme yaparak numuneyi tarayın.Ardından, gürültü azaltma için hat ortalama n değerini 100'den büyük bir değere ayarlayın. Tarama (Scanning) sekmesinde, taramayı durdurmak için Dondur (Freeze) düğmesine basın. Klavyede Control Shift Tab tuşlarına basarak, ilgi çekici kloroplast kırılma yüzeylerine yakınlaşmak için merkez-özellik fonksiyonu kullanılır ve öncekiyle aynı parametreler kullanılarak yüksek büyütmeli görüntüler alınır.Son olarak, görüntüyü kaydetmek için Save TIFF butonuna basın. Görüntü analizini metin protokolüne göre gerçekleştirin. Bu şekil, geniş bir kırılmış hücre bölgesine sahip olan, yüksek basınçla dondurulmuş ve dondurularak kırılmış bir Craterostigma Pumilum yaprak parçasını içeren bir trombositin cryo-SEM görüntüsünü göstermektedir.Bu örnekte yaprak parçası eksiktir; ancak plaka üzerindeki bıçak kanallarına yapışmış bazı yaprak dokuları kalmıştır. Başarılı bir kırılma tespit edildikten sonra, kırılmış kloroplastlar gibi ilgi çekici bölgeleri belirlemek için hücrelerin düşük büyütmeli görüntüleri alınır. Tilakoid membran kırılma yüzeylerini belirlemek için tekil kırılmış kloroplastların görüntüleri alınır.Bu örnekte, C.Pumilum yapraklarındaki tilakoid membranların yüksek büyütmeli bir görüntüsü gösterilmektedir. Dört farklı kırılma yüzeyi ayırt edilebilir: Yığılmış ve yığılmamış membranların ekzoplazmik kırılma yüzeyleri (sırasıyla EF'ler ve EFu'lar) ve yığılmış ve yığılmamış membranların protoplazmik yüzeyleri (sırasıyla PF'ler ve PFu'lar).Fotosistem II veya PS2, hem yığılı grana membran bölgelerinde (EFs) hem de stromalamellar membran bölgelerinde (EFu) bulunur. Hidrate durumda, PS2 yoğunluğu EFs'lerde EFu'ya göre yaklaşık üç kat daha yüksektir ve bu durum iki yüzeyi birbirinden ayırır. C. pumilum'un dehidrasyonu sırasında, EFs'lerdeki PS2 yoğunluğu kademeli olarak azalır ve hidrate koşullardaki yoğunluğunun yaklaşık yarısına ulaşır.Özellikle, %5 ila 10 bağıl su içeriğine kadar gerçekleşen daha ileri bir dehidrasyon sonucunda, PS2 kompleksleri sıralar ve diziler şeklinde organize olur. Dondurarak kırma replika tekniğinin geliştirilmesi, membran protein komplekslerinin boyutlarının ve biyolojik membranlar içindeki düzenlemelerinin incelenmesinin önünü açmıştır. Dondurarak kırmanın, kriyojenik-SEM'de yüksek basınçlı dondurma ile kombinasyonu; doku ve hücresel seviyelerden makromoleküler seviyeye kadar çeşitli örnek türlerinin, doğal durumlarına yakın bir halde farklı boyut ölçeklerinde araştırılmasına olanak tanır.Burada gösterilen tekniğe ek olarak, enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi (EDS) gibi yöntemler de cryo-SEM'de uygulanabilir; örneğin, alkalize biyomineraller için kullanılabilir.

studying-supramolecular-organization-photosynthetic-membranes-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Temel teknikler ve transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için biyolojik örneklerin ve nanomateryallerin dondurularak kırık işleme iyileştirmeler açıklanmıştır. Bu teknik ultrastrüktürel özellikleri ve biyolojik membranların uzmanlık ifşa ve malzeme bilimleri ve nanoteknoloji ürünleri ultrastrüktürel düzeyde boyutlu ve konumsal verilerin elde edilmesi için tercih edilen bir yöntemdir.

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Yüksek kaliteli transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri elde etmek, özellikle bol miktarda büyük su dolu vakuollere ve havalandırılmış alanlara sahip bitki hücreleri söz konusu olduğunda zordur. Tandem yüksek basınçlı dondurma ve hızlı dondurma ikamesi, mükemmel ultrastrüktürel korumaya sahip numuneler üretirken TEM için tesis numunelerinin hazırlanma süresini büyük ölçüde azaltır.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Bu makale, makromoleküllerin doğala yakın durumlarında yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerini elde etmek için kullanılan kriyo-elektron mikroskobu metodolojisini açıklamaktadır. Yöntem, bir makromolekülün 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için tasarlanan tek parçacık yaklaşımını kullanarak daha fazla bilgisayarlı işleme için uygun görüntüler verir.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

Körte su dağılımının gözlemlenmesi, odunsu bitkilerde suyun akış dinamikleri ile ilgili önemli bilgiler sağlar. Bu çalışmada, örnek hazırlama sırasında su durumundaki artifaktüel değişiklikleri ortadan kaldıran bir kriyostat ve Cryo-SEM kullanarak situ 'da xylem su dağıtımını gözlemlemek için pratik bir yaklaşım gösteririz.

Cryo-scanning Electron mikroskop ile görselleştirilen Woody bitkilerde xylem su dağılımı

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Keşfedin bitki dokularında fotosentez membranlarının süpramoleküler organizasyonunu kriyotarama elektron mikroskobu ile. Bu yöntem, tylakoid membranlarının yerel hücresel bağlamda yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi (Video) | JoVE Journal

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Daha fazla video keşfet