Antik Biyolojik Topluluklar barındırmıştır İç Araştırma Dondurulmuş Çekirdek dış bölümünden Eksojen Malzeme Kaldırma

Kriyosfer, geçmiş çevresel koşullar altında hayatta kalmış korunmuş organizmalara erişim sağlar. Bu prosedürün genel amacı, donmuş karotlardan ekzojen materyallerin başarıyla toplanması ve uzaklaştırılması yoluyla gizli çeşitliliği ortaya çıkarmaktır. Bu yöntem, buzul buzundan ve permafrosttan geri kazanılan organizmaları tanımlayarak, belirli zaman dilimleri hakkındaki değerli tarihsel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Kontaminasyon girişinin yüksek olasılığı göz önüne alındığında, sahada aseptik bir karot toplamak zordur. Bu nedenle, bu tekniğin temel avantajı, kontaminasyon giderme işleminin kontrollü bir laboratuvar ortamında gerçekleşmesidir. Kazıma ve dekontaminasyon adımlarının öğrenilmesi zor olabileceği için, bu protokolün görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Bu işlem gerçekten iki kişilik bir iştir, bu nedenle özellikle çok fazla sabır ve ekip çalışması gerektirir. Bu prosedürü laboratuvarımdan iki destek bilim insanı, Karen Foley ve Robert Jones uygulamalı olarak göstereceklerdir. Bu protokol titiz bir temizlik gerektirmektedir.

Aşağıdakileri dört saat boyunca pişirmek için 450 °C'ye ayarlanmış bir fırın kullanın: Steril nükleik asit içermeyen metal raflar, cam malzemeler, metal pensler ve cam yünü. Yeniden kontaminasyonu önlemek için kalın folyo sargı kullanın.

Ardından, %85 etanolü ve ultra saf suyu 0,22 mikronluk filtreler kullanarak filtre sterilizasyonundan geçirin. Bu sıvılar 4 °C veya altında tutulmalıdır, aksi takdirde örneğin çatlamasına neden olarak kontaminasyonu kolaylaştıracaktır. Etanolü -20 °C'de saklayın.

Suyu 4 °C'de saklayın. Ardından, plastik bir cetveli önce %70 etanol, sonra DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNase dekontaminasyon solüsyonu ile sterilize edin. Her bir solüsyonu uyguladıktan hemen sonra silin.

Ardından cetveli steril, nükleik asit içermeyen bir Whirl-Pak torbasında saklayın. Sonra, önce duvarları, yerleri ve içerideki metal çalışma tezgahını %1'lik çamaşır suyu ile ovalayarak soğuk oda alanını hazırlayın. Daha sonra oda sıcaklığını yaklaşık eksi 11 derece Celsius'a ayarlayın.

Hazırlıklar tamamlandıktan sonra, odanın veya numunelerin kontamine olma olasılığını azaltmak için soğuk odadayken hafif iş tulumları, nitril eldivenler ve maskeler giyin. Bu prosedür, iki kişinin tandem şeklinde çalışmasını gerektirir. Yeniden kontaminasyon için mevcut olan birçok fırsat göz önüne alındığında, bu durum zorlayıcı olabilir.

Başarıyı sağlamak için birbirimizi izliyor, iletişim kuruyor ve eldivenlerimizi sık sık değiştiriyoruz. Her şey hazırlandığında, sterilize edilmiş malzemeleri ve numuneleri soğuk odaya getirin ve çamaşır suyu ile temizlenmiş masaya yerleştirin. Buna, hazırlanmış S.marcescens kültürleri de dahildir.

Öncelikle permafrost örneği, hazırlanmış bir alüminyum folyo tabakası üzerine yerleştirilir. Ardından, örneğin dış kısmı steril bir köpük tapa kullanılarak seyreltilmiş bir S.marcescens kültürü ile hafifçe inoküle edilir. Daha sonra, örneği bir tepsinin üzerindeki steril metal bir rafa yerleştirin.

Şimdi, çelik mikrotom bıçağı %70 ethanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNase dekontaminasyon solüsyonu ile steril şekilde silinir. Ardından, araştırmacı A nitril eldivenlerini aynı şekilde temizler. Daha sonra A, örneği tepsinin üzerinde 45 derecelik bir açıyla tutar.

A, her kazımadan sonra örneği döndürürken, B steril bıçağı kullanarak tüm karotun dış kısmından, uçlar dahil, yaklaşık beş milimetreyi nazikçe kazır. Gerektiğinde, bıçak üç solüsyonla yeniden temizlenmelidir. Ardından, A karotu döndürürken, B filtre sterilize edilmiş %95 ethanol'ü karotun üzerine hızlı ve dikkatli bir şekilde döker.

Ardından, çekirdek hızla suyla durulanır. Tepsinin üzerindeki metal raf değiştirilir ve çekirdek yeni rafa yerleştirilir. Araştırmacı nitril eldivenlerini temizler ve ardından çekirdeği tepsinin üzerindeki temiz bir rafa yerleştirir.

Bu sırada B, tüm çekirdeği DNA dekontaminasyon çözeltisiyle püskürtür ve ardından filtre sterilizasyonlu su ile durular. Sonrasında B, tüm çekirdeği RNaz dekontaminasyon çözeltisiyle püskürtür ve ardından su ile bir kez daha durular. Son olarak, çekirdek steril bir Whirl-Pak torbasına yerleştirilir.

Laminer akışlı bir biyolojik güvenlik kabininde, cam bir kabın üzerine metal bir raf yerleştirerek başlayın. Ardından, örneği metal rafın üzerine yerleştirin. Örneğin dış yüzeyinin yaklaşık 10 dakika boyunca iki ila beş milimetre çözülmesini sağlayın.

Bu süre boyunca, çekirdeği her iki dakikada bir 90 derece döndürün. Çözme işleminin ardından, bir pens yardımıyla bir miktar cam yünü tutun ve bakterileri toplamak için çekirdeğin tüm yüzeyini silin. Ardından, cam yününü kullanarak iki plakayı ekimleyin.

Ardından, cetvel kullanarak çekirdeğin dış boyutlarını ölçün ancak çekirdeğe dokunmayın. Ayrıca, inokülumun canlı olduğunu doğrulamak için, daha önce çekirdeğin dış kısmını katkılamak için kullanılan orijinal kültürle iki ek plak ekimi yapın. Sonrasında, çekirdeği büyük steril bir torbaya aktarın ve minus 80 degrees Celsius sıcaklıkta saklayın.

İnoküle edilen plakları 23 °C'de bir hafta boyunca inkübe edin ve ardından bu sıcaklıkta kırmızıya dönen S.marcescens kolonileri açısından inceleyin. Bu protokol bir dizi kritik adım içerse de, en önemlilerinden biri Serratia Marcescens büyümesini kontrol etmektir. Görünür S.marcescens kolonisi yoksa, bir sonraki çözme aşamasına geçin.

Eğer S.marcescens kolonileri varsa, çekirdekten beş milimetre daha kazıyın ve prosedürü tekrarlayın. Soğuk oda sıcaklıklarına maruz kalan orijinal kültürden S.marcescens'in büyüyüp büyümediğini kontrol edin. Örnekler, Alaska'nın Fox bölgesinde bulunan 110 metrelik bir tüneldeki buz ve permafrosttan toplanmıştır.

Tünel, buz bakımından zengin silte ve alüvyona erişim sağlamıştır. Örnekler üç paralel şeklinde toplanmıştır. New Hampshire'daki tesislerde, açıklanan protokoller uygulanmıştır.

Karotlardan büyütülen bakterilerin 16S rRNA geni dizilenmiştir. Pseudomonas türleri baskın çıkmış ancak Planctomycetia ile ilişkili üyeler de mevcuttu. Ayrıca, Serratia türlerinin yokluğu özellikle dikkat çekiciydi; bu durum, dekontaminasyon protokolünün ekzojen DNA'yı yeterince uzaklaştırdığını göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, buz ve permafrost karotlarının nasıl başarıyla dekontamine edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, soğuk oda işlem adımları uygun şekilde yürütülürse 30 ila 45 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, dokunduğunuz her şeye ve her yere karşı dikkatli olmanız kritik öneme sahiptir.

Şüpheye düştüğünüzde, sadece eldivenlerinizi değiştirin ve yeniden sterilize edin. Bu prosedürün ardından, söz konusu zaman dilimi için tür kompozisyonunun ne olduğu veya bu çevresel koşullar altında hangi fonksiyonel özelliklerin baskın olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için amplikon sekanslama ve shotgun metagenomik gibi diğer yöntemler uygulanabilir.