Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

İnsan pluripotent kök hücreleri için bu şablon tabanlı mikro modelleme yönteminin genel amacı, kök hücre farklılaşma modellerini kontrol eden uzamsal çevresel gradyanlar oluşturmak için basit ve sağlam bir araç sağlamaktır. Bu yöntem, hücre-hücre ve hücre matrisi adezyon kuvvetlerindeki uzamsal gradyanların kök hücre farklılaşma kaderlerini düzenlemeye nasıl yardımcı olabileceği gibi, bir insan kök hücre modeli kullanarak doku modellemesindeki temel soruları yanıtlamanıza yardımcı olabilir. Bu yöntemin avantajı, hücrelerin yapışması için hücre yapıştırıcısı ECM desenleri oluşturmak için ek yüzey modifikasyonu gerektirmemesidir.

Bu, yöntemin her hücre hattına özgü çeşitli ECM ve substrat konfigürasyonlarıyla uyumlu olduğu anlamına gelir. Mikro modelleme adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Çünkü şablonun ve hücrelerin hassas ve dikkatli bir şekilde ele alınmasını gerektirir.

Bu prosedür için, PTMS şablonlarının önceden tasarlanmış ve üretilmiş olması gerekir. Benzer şekilde, bazal membran matrisi üzerinde büyüyen insan EFC hücrelerine sahip olun, böylece koloniler prosedürün ilerleyen aşamalarında tohumlamaya hazır olacaktır. Başlamak için, ultra saf suya 700 mikrolitre %70 analitik dereceli etanol içeren bir tabak yükleyin.

Ardından, PDMS şablonunu solüsyonun üzerine yerleştirin ve tabağı gece boyunca kuruması için bir biyo-güvenlik kabinine koyun. Ertesi gün, şablonun altında kabarcık oluşmadığını kontrol edin. Ardından, hücreler şablonun üzerine ekilene kadar tabağı tarlaya koyun.

16.7x çözelti yapmak ve buz üzerinde tutmak için 12 mililitre DMF1.5 ekleyerek insan ESC kalitesinde bazal membran matrisinin bir alikotunu hazırlayın. Substratı 90 saniye boyunca 100 watt oksijen plazması ile muamele edin. Çanağı plazma odasının içine girene kadar açmayın ve tedaviden sonra hızlı bir şekilde üzerini kapatın.

Bu işlem, substrat çözeltiye daldırıldığında kabarcıkların oluşmasını önleyecektir. Şimdi, şablonu 450 mikrolitre hazırlanmış 1.5x bazal membran matris çözeltisi ile kaplayın. Ardından, çanağı parafilm ile kapatın ve beş saat boyunca inkübe edin.

Devam etmeden önce, hazırlanmış HESC kolonilerinin altı kuyucuklu plakasını kontrol edin. Tipik HESC morfolojisini kaybetmiş farklılaşmış hücre kolonilerini tanımlayın ve aspire edin. Hepsi yuvarlak görünmeli, sıkıca paketlenmiş bir epitel morfolojisine sahip olmalı ve belirgin nükleoller ile yüksek bir çekirdek-sitoplazma oranına sahip olmalıdır.

Daha sonra, kaplanmış hücrelerin her bir kuyusunu iki mililitre DMF12 ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, her bir oyuğa accutase gibi bir mililitre sindirim enzimi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede sekiz dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüm kolonileri alt tabakadan ayırmak için plakaya hafifçe vurun.

Daha sonra, kuyuya uygulanan her mililitre sindirim enzimi için her bir kuyucuğu en az dört mililitre ortamla durulayın ve hücre süspansiyonlarını tek bir 15 mililitrelik konik tüpte toplayın. Bir hücre peleti oluşturmak için hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 200 g'da santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri, 10 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş 400 mikrolitre HESC bakım ortamında yeniden süspanse edin.

Topakları parçalamak için hücreleri üç kez hafifçe ezin. Ardından, süspansiyonların yoğunluğunu düzeltin. İyice karıştırın ve ortamda 200 mikrolitre 1:20 oranında seyreltme yapın.

Bir hemositometre kullanarak seyreltmedeki hücreleri sayın. Ardından, kaya inhibitörlü ortam kullanarak ana süspansiyonu gerektiği gibi seyreltin. Devam etmek için, hazırlanan her şablona gerekli sayıda hücre ekleyin.

Sadece tek katmanlı bir hücre tabakası biriktirilmelidir, bu nedenle onları eşit şekilde yayın. Şablonun beş dakika boyunca rahatsız edilmeden oturmasına izin verin, böylece hücreler yerleşebilir. Ardından, yüklenen şablonları dikkatlice bir inkübatöre aktarın ve bulaşıkları transfer boyunca düz tutun.

Hücrelerin bir saatlik inkübasyon boyunca şablonlara yapışmasına izin verin. Hücrelerin bağlanmasına izin verildikten sonra, düzgün bir şekilde yaptıklarından emin olmak için mikroskop altında inceleyin. Şablonu davlumbaza geri aktarın ve bağlı olmayan hücreleri şablondan aspire edin.

Ardından, şablonu çevreleyen alana DMF12'de iki mililitre %0,5 uyumlu iyonik olmayan yüzey aktif madde ekleyin. Şablonu kaplayacak şekilde çözeltiyi döndürün. Ardından, şablonu tabaktan nazikçe soymak için bir çift otoklavlanmış forseps kullanın.

Şablonu çıkardıktan sonra, mikropatterend hücrelerini mikroskop altında inceleyin. İyonik olmayan yüzey aktif madde bu hücrelerin kurumasını önler. Mikropatterend hücrelerinin, yüzey aktif madde takviyeli ortam çözeltisinde 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe etmesine izin verin.

10 dakika sonra solüsyonu aspire edin ve plakayı iki mililitre normal DMF12 ortamı ile üç kez yıkayın. Yıkamalardan sonra, kaya inhibitörlü iki mililitre HESC bakım maddesi ekleyin. Bir kez daha, mikro desenlerin düzgün bir şekilde oluşup oluşmadığını kontrol etmek için hücreleri inceleyin.

Ardından, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ortamı aspire edin, hücreleri bir kez DMF12 ile yıkayın ve ardından hücrelerin mezoendoderm farklılaşmasına uğramasını sağlamak için iki mililitre ek farklılaşma ortamı ekleyin. Daha sonra sonuçları analiz edin.

Hücre şablonunun bir lazer kesici kullanılarak üretilmesi, 1000 mikron özellikler sağladı. Şablon, mikro desenli açık deliklere sahip ince bir şablon tabakasından ve hücreleri içermek için kullanılan bir PDMS contasından oluşuyordu. Bu araç kullanılarak, mezoendoderm farklılaşması sırasında mikropattere edilmiş HESC'ler araştırıldı.

H9-HESC koloni periferileri, koloni içindeki hücrelere göre daha yüksek integrin adezyonlara sahiptir. Böylece hücreler, aktiv, BMP4 ve FGF2 ile indüklendiğinde brakiyer T-pozitif mezoendoderm hücrelerine farklılaşır. Bu tür hücreler, farklı geometrilere, geometrik ve izotropiat dik açılara ve dışbükey eğriliklere sahip tek tabakalar halinde modellendiğinde, yerel bir integrin aracılı çekiş kuvvetleri konsantrasyonuna yol açtı ve mezoendoderm farklılaşmasının artmasına neden oldu.

Tek bir koloni içindeki farklı bölgelerdeki T ekspresyon yoğunluğu, mezo endoderm indüksiyonunun kapsamının, kare ve dikdörtgen kolonilerin keskin köşelerinde ve yarı dairesel bir yayın dışbükey eğriliklerinde gerçekten daha yüksek olduğunu gösterdi. Bu, hücre yapışması aracılı mekanik kuvvetlerin tarif edilen yöntem kullanılarak modüle edilebileceğini göstermektedir. Prosedürü denemeden önce, üzerinde çalıştığınız spesifik insan pluripotent kök hücre hattı için matris kaplama süresini, hücre sindirimini ve bağlanma süresini optimize etmek önemlidir.