Name: Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Öğrenin, katyonik ve anyonik lipozomlarla siRNA'nın kan-beyin bariyerini aşarak merkezi sinir sistemine hedefli teslimatını. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklar için güvenli ve etkili bir tedavi seçeneği sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Aşağıdaki finansman kaynaklarını takdir etmek isteriz: CSU Bulaşıcı Hastalık Translasyonel Araştırma Eğitim Programı (ID:TRTP) ve NIH araştırma hibe programı (R01 NS075214-01A1). Monoklonal antikoru PRC5'in kullanımı için Telling laboratuvarına teşekkür ederiz. Ayrıca DOTAP lipozomları için ve lipozom üretme konusundaki uzmanlıklarını paylaştıkları için Dow laboratuvarına teşekkür etmek istiyoruz.

Tüm fareler yetiştirilen ve Colorado State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca Değerlendirmesi ve Lab Hayvan Bakım International, Akreditasyon Derneği tarafından akredite Lab Hayvan Kaynakları, muhafaza edilmiştir. LSPCs hazırlanması 1. <ol><li> 1 DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum propan): LSPCs kolesterol oranı 1 kullanın. 1 kloroform: bir şişe içinde metanol çözeltisine 4 nmol lipozom hazırlanması için, DOTAP 2 nmol ve 1 10 ml kolesterol 2 nmol karıştırın. </li><li> Bir çeker ocak içinde N2 gazı ile metanol çözeltisi: kloroform 9 ml buharlaştınn. Gaz olmadan gecede davlumbaz çözücü son 1 ml buharlaşır. Şişenin altındaki ince bir lipid film dikkate alınmalıdır. </li><li> 55 ° C&#39;ye kadar bir% 10 sukroz çözeltisi ısı 10 mi. </li><li> /, Yavaş yavaş dk yani 1 ml ince lipid film üzerine ısıtılmış% 10 sukroz solüsyonu dökün ge ikenntly şişeyi dönen. lipit molekülleri jel sıvı fazda kalması için 55 ° C&#39;de lipidler ile% 10 sukroz ve balon koruyun. çok katmanlı vezikül (MLV) oluşumu ile ve tekrar su ile sonuçlanır. </li><li> lipidler lipozomlar boyutlandırma önce en az bir saat süreyle 55 ° C &#39;de rehidrate izin verin. </li><li> 1.0 um filtre ile, üretici talimatlarına göre bir ekstruder araya veya boyutlandırma 1.0 um şırınga filtreleri kullanmak. </li><li> 11 defa sıkıcıda şırınga birine ısıtıldı lipozom süspansiyonu 1 ml ilave edilir, ve iki şırınga arasında süspansiyon geçmektedir. Süspansiyon 11 geçer sonra başlayan şırınga daha ters şırınga olduğundan emin olun. </li><li> Ebat lipozomlar daha 0.45 um ile, sonra 0.2 um filtreler büyük tek katmanlı veziküller (LUVler) üretir. kolay boyutlandırma için ısıtılmış lipozom süspansiyonu tutun. </li><li> (4 20 uM 200 ul 4 nmol lipozom süspansiyonu (200 uM) 20 ul inkübenmol toplam) oda sıcaklığında 10 dakika için stok siRNA çözeltisi. </li><li> 500 uM, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile siRNA / lipozom çözeltisi (40 nmol toplam) hazır RVG-9R çözeltisi 80 ul inkübe edin. LSPCs mümkün olduğu kadar kısa bir süre kullanılabilir olması gerekir, ancak hazırlandıktan sonra birkaç saat kadar kullanılabilir. hazırlandıktan sonra birkaç saat 4 ° C&#39;de saklayın LSPCs. </li></ol> PALETS 2. hazırlanması <ol><li> 40: DSPE&#39;nin (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin) ya da 5 mol oranı: kolesterol: DSPE-PEG veya DOTAP: kolesterol: DSPE-PEG PALETS için 55 kullanımı. 1 kloroform: bir şişe içinde metanol çözeltisine 4 nmol lipozom preparatı için DSPE ya DOTAP da 2.2 nmol, kolesterol 1.6 nmol, ve 2, 10 ml DSPE-PEG 0.2 nmol karıştırın. </li><li> Aşama 1.1 ve yukarıdaki 1.2 de tarif edildiği gibi tam olarak lipozom süspansiyonu hazırlanır. 1 x PBS, 10 ml DSPE lipozomlar rehidrate 1 ml / dakika ekleme 75 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. lipidler de 75 ° C&#39;de rehydrate izin verboyutlandırma önce en az 1 saat. </li><li> Boyut lipozom süspansiyonu tam olarak adım 1.6-1.8 açıklandığı. </li><li> Pipet DOTAP DSPE lipozomlar sonra tek kullanımlık kısma 4 nmol (200 uM) lipozom süspansiyonları her birinin 20 ul boyutlu yapılmış ve bir tezgah üstü, dondurarak kurutma (Şekil 2) ile, 30 dakika boyunca liyofilize var. </li><li> 20 uM DSPE PALETS lipozomlara kapsüllenecek olan siRNA, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile protamin sülfat 26.6 uM çözeltisi 1.4 ul (4 nmol toplam) hazır siRNA çözeltisi 200 ul inkübe edin. </li><li> siRNA 4 nmol stok çözeltisinden 200 ul DOTAP PALETS lipozomlar rehidrate veya siRNA / protamin çözeltisi 201.4 ul DSPE PALETS lipozomlar rehidrate. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lipozom / siRNA çözeltisi inkübe edin. </li><li> Her iki DOTAP DSPE PALETS için lipozom / siRNA çözeltiye 60 mM 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) çözeltisinin 10 ul ekle. </li><li> Her iki DOTAP DSPE PALETS için lipozom / siRNA çözeltisine 150 mM N-hidroksi-(sülfo-NHS) çözeltisi 10 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca siRNA / lipozom süspansiyonu ile EDC ve sülfo-NHS inkübe edin. </li><li> 500 uM, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile çözelti çapraz bağlama siRNA / lipozom (40 nmol toplam) hazır RVG-9R çözeltisi 80 ul inkübe edin. NOT: EDC / sulfo-NHS PEG lipidler kovalent bağa RVG-9R sağlar. hazırlanması sonra birkaç saat içinde PALETS kullanın. hazırlandıktan sonra birkaç saat 4 ° C&#39;de saklayın PALETS. </li><li> PALETS siRNA kapsülleme etkinliğini belirlemek için: <ol><li> önce ve protamin ve 260 nm&#39;de bir spektrofotometre kullanılarak lipozomlar ilave edildikten sonra siRNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. </li><li> 50 kDa santrifüj filtre kullanarak lipozom / kapsüllü siRNA süspansiyon kapsülsüz siRNA Filtre. 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> konsantrasyonunu ölçmekkapsüllenmemiş filtre siRNA ve 260 nm&#39;de bir spektrofotometre kullanılarak retentat kapsüllenmiş siRNA&#39;nın konsantrasyonu. </li></ol></li></ol> 3. LSPCs ya PALETS olan farelere enjekte <ol><li> damarsal genişletmek için bir ısı lambası 5-10 dakika fareler Açığa. </li><li> 2-3% isofluorane / oksijen ile fare anestezisi enjeksiyondan önce ve enjeksiyon sırasında 5-10 dakika akış. Hayvan artık ayakta ve solunuma bir ayak tutam yaparak yavaşladı zaman anesthetization onaylayın. kuyruk ven erişmek için kendi arkasında veya yanında fare yerleştirin. anestezi altında iken kurumasını önlemek için farenin gözleri veteriner merhem kullanın. </li><li> / Wipe% 70 EtOH ile kuyruk sprey ve 26 G insülin şırınga kullanarak fare kuyruk damarından üzerine LSPCs veya PALETS 300 ul enjekte edilir. kuyruk damar içine enjekte distal başlayın ve damar çökmesi ya da kırılmalar eğer proksimale hareket ettirin. </li><li> sternal yatma tutar kadar temiz bir kafes içinde fare yerleştirin. mo koymayınTamamen iyileşene kadar diğer kafes arkadaşları ile kullanın. Fareler 5 ila 15 dakika içinde geri gerekir. Bunlar, bir ısıtma yastığı veya kurtarma uzun sürerse vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi için bir ısı lambası altına yerleştirilebilir. Fareler aşırı ısınma karşı korumak için yakından izlenmelidir. </li><li> Anestezi kapalı giyer sağlamak için enjeksiyondan sonra hayvan birkaç saat Monitör ve tedavi hiçbir kötü etkileri vardır. LSPCs veya PALETS en az 24 saat dönmesine izin verin. </li></ol> Akım Sitometrisi aracılığıyla Protein Ekspresyonu 4. Analizi <ol><li> 15 dakika boyunca% 20 CO2 akış oranı ile farelerin öldürülür. </li><li> makas kullanarak fare deri ve kafatası uzak keserek beynin yarım yarımkürede parçalara ayır. Peel uzakta yarım uzak maşa ya da makasla ucunu kullanarak kafatasından beyin yarıküre. </li><li> FACS tampon 2.5 mi ile 40 mikron gözenekli bir hücre süzgecinden her fareden beyin basın yarım küre (1x, Bir şırınga pistonu ile bir Petri kabı PBS,% 1 fetal bovin serumu, 10 mM EDTA). </li><li> FACS tampon ek 2,5 ml hücre süzgecinden ve Petri çanağı yıkayın. Buz üzerinde 15 ml konik bir tüp içinde tek bir hücre süspansiyonu koyun. </li><li> Pipet 350 x g&#39;de 5 dakika boyunca 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj içine 5 ml&#39;lik tek bir hücre süspansiyonu 100 ul. FACS tampon 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın. 5 dakika boyunca 350 xg&#39;de Spin. FACS tampon başka bir 1 ml ile tekrarlayın. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> 1 100 ul hücreleri inkübe: FACS tampon maddesi içinde 0.5 mg / ml sıçan anti-fare Fc Bloku 100 seyreltme, buz üzerinde 30-60 dakika karıştırıldı. Pelet ve adım 4.5 olarak hücreleri yıkayın. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> 30-60 dakika boyunca buz üzerinde FACS tamponu içinde% 7 fare serumu fare PrP C&#39;ye karşı bir 20 ug / ml fluoresan antikor, 100 ul hücre inkübe edin. Pelet ve adım 4.5 olarak hücreleri yıkayın. hücre süspansiyonu tutunbuzda. </li><li> Pelet ve 1 dakika boyunca RBC liziz tamponu için 1 ml (1 x PBS, 155 mM NH4CI, 12 mM NaHCO 3, 0.1 mM EDTA) içinde hücrelerin yeniden askıya. Aşama 4.5 Topak ve FACS tamponu 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> Daha önce 10 açıklandığı gibi bir akış sitometresinin kullanarak PrP ​​C ifadesini analiz edin. Kapı toplam hücre popülasyonunun hücreleri yaşıyor. Kapı PrP C + canlı hücre popülasyonundan gelen hücreler MFI (ortalama floresan yoğunluğu) belirlemek gerekmektedir. </li></ol>

<ol><li>Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).</li>
<li>McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease-resistant+protein+is+a+structural+component+of+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion.</a> Cell. 35 (1), 57-62 (1983).</li>
<li>Pruisner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li>
<li>Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+sub-cellular+pathology+of+prion+diseases%3A+relationship+between+morphological+changes%2C+accumulation+of+abnormal+prion+protein+and+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease.</a> Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).</li>
<li>Büeler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).</li>
<li>Pfeifer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivector-mediated+RNAi+efficiently+suppresses+prion+protein+and+prolongs+survival+of+scrapie-infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice.</a> J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).</li>
<li>White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+treatment+with+RNAi+against+prion+protein+rescues+early+neuronal+dysfunction+and+prolongs+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).</li>
<li>Gallozzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prnp+knockdown+in+transgenic+mice+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference.</a> Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).</li>
<li>Mallucci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+prion+protein+reverses+early+cognitive+deficits+and+neurophysiological+dysfunction+in+prion-infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice.</a> Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).</li>
<li>Pulford, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-siRNA-peptide+complexes+cross+the+blood-brain+barrier+and+significantly+decrease+PrPC+on+neuronal+cells+PrPRes+in+infected+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures.</a> PLoS One. 5 (6), (2010).</li>
<li>Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposome-mediated+RNA+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cationic liposome-mediated RNA transfection.</a> Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficiency+of+cationic+liposome-mediated+intravenous+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery.</a> Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).</li>
<li>Freimark, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+enhance+cytokine+and+cell+influx+levels+in+the+lung+following+administration+of+plasmid%3A+cationic+lipid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes.</a> J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).</li>
<li>Balzas, D. A., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+for+use+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomes for use in gene delivery.</a> J Drug Deliv. , (2011).</li>
<li>Srinivasan, C., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+anionic+lipoplexes+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery.</a> J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).</li>
<li>Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+are+protected+from+excitotoxic+death+by+p53+antisense+oligonucleotides+delivered+in+anionic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes.</a> J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).</li>
<li>Tao, Y., Han, J., Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeting+gene+delivery+using+a+rabies+virus+glycoprotein+peptide+modulated+hollow+liposomes%3A+bio-behavioral+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study.</a> J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).</li>
<li>Li, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+via+intravenous+administration+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.</a> Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).</li>
<li>Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes+for+intravenous+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery.</a> Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39-43 (2007).</li>
<li>Voinea, M., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+of+%27intelligent%27+liposomes+for+efficient+delivery+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs.</a> J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+are+protected+from+excitotoxic+death+by+p53+antisense+oligonucleotides+delivered+in+anionic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes.</a> J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).</li>
<li>Li, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+via+intravenous+administration+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.</a> Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).</li>
<li>Büeler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+and+behaviour+of+mice+lacking+the+neuronal+cell-surface+PrP+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein.</a> Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).</li>
<li>Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+the+messenger%3A+short+RNAs+that+silence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).</li>
<li>Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression+in+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus.</a> J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).</li>
<li>Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prion+proteins+are+synthesized+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Scrapie prion proteins are synthesized in neurons.</a> Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).</li>
<li>Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+prion+protein+gene+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the prion protein gene in glial cells.</a> Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).</li>
<li>Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+can+infect+primary+cultured+neurons+and+astrocytes+and+promote+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).</li>
<li>Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie-associated+prion+protein+accumulates+in+astrocytes+during+scrapie+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu rapor verimli MSS için siRNA taşımaları iki hedeflenmiş dağıtım sistemleri oluşturmak için bir protokol açıklar. CNS siRNA teslim önceki yöntemler beyin, hedeflenen siRNA intravenöz enjeksiyon veya hedefli olmayan lipozom siRNA kompleksi intravenöz enjeksiyon doğrudan siRNA / shRNA enjekte vektörler dahildir. CNS&#39;ye siRNA / shRNA vektörlerinin enjeksiyon hedef protein sentezleme seviyelerinde bir düşüşe neden yoktur. Bununla birlikte, siRNA / shRNA CNS serbestçe nüfuz etmez. Bundan başka, bu enjeksiyonlar bitişik...

Prionlar merkezi sinir sistemini etkileyen şiddetli nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Prion hastalıkları PrP Res adlı bir enfeksiyon izomer normal hücresel prion proteininin, PrP C, hatalı katlanması sonucu. Bu hastalıklar, insanlarda 1-3 sığırlarda sünger formlu ineklerde ensefalopati, Scrapie koyun, Cervidlerin kronik halsizlik hastalığı- ve Creutzfeldt-Jakob hastalığı dahil olmak üzere türleri ve çeşitli etkiler. Prionlar sinaptik kaybı ile başlar ve vakuolizasyonu ilerleyen nörodejenerasyon, gliozis, nöron kaybı ve plak mevduat neden olur. En sonunda, 4 ayrı hayvan / ölümü ile sonuçlanır. Onlarca yıldır, araştırmacılar yavaş ya da prion hastalığın ilerlemesini durdurmak amacıyla bileşikler araştırdık. Bununla birlikte, araştırmacılar, başarılı bir tedavi veya etkili bir sistemik dağıtım aracı ya bulamadık. Endojen PrP C ifadesi prion hastalıklarının 5 gelişimi için gereklidir </s&gt; Yukarı. Bu nedenle, azaltan veya ortadan PrP Cı ifade, bir gecikme ya da hastalığın iyileştirilmesi neden olabilir. Çeşitli gruplar prion hastalığı PrP C ifadesi düzeylerinin rolünü araştırmak için fare beyin dokusu içine doğrudan shRNA ifade PrP C seviyelerinde düşme veya enjekte lentivectors ile transgenik fareler yarattı. Nöronal PrP C miktarını azaltarak bulundu Bu araştırmacılar prion hastalıklarının ilerleyici nevropatolojisi durdurulması sonuçlandı ve hayvanların 6-9 ömrü uzatılmış. Biz fare nöroblastom hücrelerinde 10 PrP Res temizlenmesi o PrP C siRNA tedavi sonuçlarını bildirmişlerdir. Bu çalışmalar, bu tür tedaviler, küçük müdahale edici RNA (siRNA) böler mRNA gibi PrP Cı ekspresyon seviyelerini azaltmak için yeterli Prion hastalıklarının ilerlemesini geciktirebilir düşündürmektedir. Bununla birlikte, Prion hastalıklarının incelenmiştir tedavilerin çoğunluğu pratik olmazdı şekilde teslim edildiBir klinik ortamda. Bu nedenle, bir siRNA tedavisi merkezi sinir sistemine, venöz içine verilen ve hedeflenen bir uygulama sistemiyle, ihtiyacı vardır. Araştırmacılar, gen tedavi ürünleri için salıverme araçları olarak lipozomların kullanılmasını inceledik. Katyonik ve anyonik lipitler hem lipozomlar oluşturularak kullanılmaktadır. katyonik lipid ve DNA / RNA arasındaki yük farkı verimi arttırmak üzere sağlar, çünkü katyonik lipidler daha yaygın anyonik lipidler daha kullanılmaktadır. Katyonik lipidlerin diğer bir avantajı, diğer lipidler 11-14 daha kolay hücre zarlarını olmasıdır. Bununla birlikte, katyonik lipidler anyonik lipidler 13,14 daha immünojeniktir. Bu nedenle, araştırmacılar lipozomlarda lipitleri anyonik katyonik kullanarak kaymaya başlamıştır. Gen terapisi ürünler etkin bir şekilde bir DNA / RNA molekülleri 15-19 yoğunlaşır pozitif yüklü peptid protamin sülfat kullanılarak anyonik lipozomlara paketlenebilir. anyonik Lipi yanaDS katyonik lipidler onlar sirkülasyon süreleri artmış olabilir ve daha hayvan modellerinde 13,14 tolere edilebilir daha az bağışıklık vardır. Lipozomlar, lipozomlara bağlı peptidleri hedef kullanarak belirli dokulara hedeflenir. Nikotinik asetilkolin reseptörlerine bağlanan RVG-9R nöropeptid, CNS 17-20 kadar siRNA ve lipozomlar hedeflemek için kullanılmıştır. Bu rapor bir protokol üç siRNA teslimat araçlar üretmek için, ve paketlemek ve nöronal hücrelerin (Şekil 1) siRNA teslim özetliyor. Lipozom siRNA peptit kompleksleri (LSPCs) siRNA ile lipozomlar oluşan ve peptidini hedefleme RVG-9R elektrostatik lipozomun dış yüzeyine bağlı. Peptit RVG-9r kovalent lipit PEG gruplarına bağlı olan, siRNA ve lipozom içinde kapsüllü protamin oluşan terapötik siRNA (PALETS) kapsüllü lipozom hitap etti. Aşağıdaki yöntemleri kullanarak LSPCs ve palet oluşturmak içinS PrP C siRNA tedavi veya büyük ölçüde prion hastalığı patoloji başlamasını geciktirmek için muazzam umut vaat nöronal hücrelerin% 90 e kadar PrP C ifadesini azaltır.

<table><tbody><tr><td>DOTAP lipid</td><td>Avanti Lipidleri</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Avanti Lipidleri</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti Lipidleri</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti Lipidleri</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>EMD Millipore 113351</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 Gaz</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Ekstruder</td><td>Avanti Lipidleri</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1.0, 0.4 ve 0.2 &# 956; m filtreler</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Protamin sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>Tek kullanımlık Aliquoted</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>Tek kullanımlık Aliquoted</td></tr><tr><td>40 &#956; m Hücre Süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD16 / CD32 Fc blok</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PrP antikoru (PRC5)</td> <td>Tescilli - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

katyonik ve anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine terapötik sirna teslimi

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion hastalıkları, normal, hücresel prion proteininin (PrPC) PrPRes adı verilen anormal proteaz dirençli bir izomere yanlış katlanmasından kaynaklanır. Yaban hayatı popülasyonlarında prion hastalıklarının ortaya çıkması ve insan sağlığına yönelik tehdidinin artması, bu hastalıklar için bir tedavi bulma çabalarının artmasına neden olmuştur. Son çalışmalar, enfeksiyöz PrPRes izomerini inhibe edebilen veya normal hücresel prion proteinini aşağı regüle edebilen çok sayıda anti-prion bileşiği bulmuştur. Bununla birlikte, bu bileşiklerin çoğu, beyin dokusunda PrP Res oluşumunu etkili bir şekilde inhibe etmek için kan beyinbariyerini geçmez, spesifik olarak nöronal PrPC'yi hedeflemez ve genellikle hayvan veya insan deneklerde kullanılamayacak kadar toksiktir. 
Intravasküler olarak verilen ve nöronlara yönelik hedeflenen siRNA'nın PrPC'nin daha güvenli ve daha etkili bir anti-prion bileşiği olup olmadığını araştırdık. Bu rapor, iki siRNA lipozomal dağıtım aracı üretmek ve PrP siRNA'yı nöronal hücrelere paketlemek ve iletmek için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. İki lipozomal dağıtım aracı, 1) katyonik lipozomlar (LSPC'ler) kullanılarak kompleksleştirilmiş siRNA lipozom formülasyonu ve 2) katyonik veya anyonik lipozomlar (PALETS) kullanılarak kapsüllenmiş siRNA lipozom formülasyonudur. LSPC'ler için, negatif yüklü siRNA, katyonik lipozoma elektrostatik olarak bağlanır. Komplekse, spesifik olarak lipozom-siRNA-peptit komplekslerini (LSPC'ler) kan beyin bariyeri (BBB) boyunca merkezi sinir sistemindeki asetilkolin eksprese eden nöronlara hedefleyen pozitif yüklü bir peptit (RVG-9r [kuduz virüsü glikoproteini]) eklenir. PALETS (peptit adresli lipozom kapsüllü terapötik siRNA) için, katyonik ve anyonik lipidler PrP siRNA tarafından yeniden sulandırıldı. Bu prosedür, siRNA'nın katyonik veya anyonik lipozomlar içinde kapsüllenmesiyle sonuçlanır. Yine, RVG-9r nöropeptidi, siRNA / lipozom komplekslerini CNS'ye hedeflemek için lipozomlara bağlandı. Bu formülasyonları kullanarak, PrP siRNA'yı AchR eksprese eden nöronlara başarıyla ilettik, ve CNS'deki nöronların PrPC ekspresyonunu azalttık.

anyonik PALETS içinde siRNA encapsulation verimliliğini artırmak için, siRNA protamin ile karıştırıldı. 1 (Şekil 3A): 1 ila 2: siRNA En iyi protamin konsantrasyonunu belirlemek için, siRNA 1, protamin farklı konsantrasyonları ile karıştırılmıştır. protamin kullanılmadan anyonik lipozomlar içinde bir% 60-65 siRNA Kapsülleme verimliliği oluştu. Protaminin Örnekleri: 1&#39;den 1.5: 1 ila siRNA molar oranları 1 (133-266 nM)% 80-90 siRNA kapsülleme vardı. 1.5 Yukarıdaki mol o...

Bu protokolün amacı, siRNA'nın BBB'yi geçmesini sağlamak için bir CNS dağıtım sistemi olarak nöro-hedefleme peptitli katyonik/anyonik lipozomları kullanmaktır. siRNA gibi tedaviler için bir dağıtım sisteminin optimizasyonu, prion ve diğer nörodejeneratif hastalıklar için daha fazla tedavi seçeneğine izin verecektir.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Bu prosedürün genel amacı, siRNA gibi küçük moleküllü ilaçları beyne iletebilen bir taşıyıcı sistem tasarlamaktır. Bu yöntem, nörodejenerasyon alanındaki "siRNA, protein katlanma bozukluğu hastalıkları için uygulanabilir bir terapötik seçenek midir?" ve "Beyne yönelik güvenilir bir ilaç iletim sistemi tasarlayabilir miyiz?" gibi temel sorulara yanıt verebilir.Lipozomal bir ilaç iletim sistemi oluşturmanın temel avantajı, siRNA'yı doğrudan nöronal doku üzerinden iletmek yerine (ki bu durum nöronal hasara yol açar) intravenöz olarak veya kan dolaşımı yoluyla iletebilmemizdir. Bu tekniğin etkileri, kan-beyin bariyerini aşarak özellikle asetilkolin eksprese eden nöronlara spesifik iletim sağlaması nedeniyle nörodejeneratif hastalıkların tedavisi ve teşhisine kadar uzanmaktadır. Fare kuyruk veni enjeksiyonlarının, kuyruk veninin küçük boyutu nedeniyle öğrenilmesinin zor olması sebebiyle, bu tekniğin görsel olarak gösterimi kritik öneme sahiptir.İşe bir bire bir DOTAP ve kolesterol oranı hazırlayarak başlayın. Yabancı hayvan lipozom hazırlığı için, iki nanomol DOTAP ve iki nanomol kolesterolü, on mililitre bir bire bir kloroform ve metanol çözeltisiyle karıştırın. Ardından, kloroform ve

delivery-therapeutic-sirna-to-cns-using-cationic-anionic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

İlaç kapsüllemesi, tümör hücresi özgüllüğünü arttırır ve nörotoksisiteyi azaltır.

Polietilen Glikol Kaplı Yüklü Lipozomların Bir Sıçan Beyin Tümörüne Konveksiyonla Geliştirilmiş Verilmesi

Kaynak: Ullah, I., et.al. Merkezi sinir sistemine intranazal siRNA iletimi sırasında farelerin yerleştirilmesi için bir konumlandırma cihazı. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, özel bir konumlandırma cihazı kullanarak fare beynine nöron hedefleyen peptit-siRNA kompleksleri iletmek için hassas bir intranazal uygulama tekniğini göstermektedir. Anestezi uygulanmış fareler, akciğer drenajını önlerken siRNA inhalasyonunu optimize etmek için baş aşağı ve ileri pozisyonda sabitlenir. Hedefleme peptidi,...

Bir konumlandırma cihazı kullanılarak siRNA'nın fare beynine intranazal iletimi

Kaynak: Bender, H. R., et.al. Terapötik siRNA'nın katyonik ve anyonik lipozomlar kullanılarak CNS'ye verilmesi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, prion proteini (PrP) siRNA'nın lipozomal siRNA-peptit kompleksleri (LSPC'ler) kullanılarak nöronlara hedefli dağıtımını göstermektedir. Katyonik lipozomlar, kan-beyin bariyeri boyunca reseptör aracılı taşıma için RVG-9r peptidi tarafından daha da stabilize edilen PrP hedefleme siRNA'yı elektrostatik olarak bağlar. Beynin içine girdikten sonra, LSPC'ler...

Lipozomal Kompleksler Kullanılarak Prion Protein Susturması için Nöronlara Hedeflenen siRNA Dağıtımı

Farelerde katyonik liposomes/siRNA/ITSN-1s kompleksleri, 24 gün boyunca her 72 saatte tekrarlanan retroorbital enjeksiyonları, verimli% 75 oranında ITSN-1s mRNA ve protein ekspresyonu azaltarak fare akciğer mikrovasküler için siRNA dubleks teslim. Bu teknik, bir hayvan modelinde yüksek tekrarlanabilir, herhangi bir olumsuz etkisi yoktur ve ölümlerin önler.

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Ya bir kateterin yerleştirilmesi ya da farelerde sağ yan ventrikül içine, bir bolus enjeksiyonu gerçekleştirerek merkezi sinir sistemi ilaçları hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz antisens oligonükleotidler teslim odaklanmıştır. Bu teknik, diğer ilaçlara ve sıçanlara, kolaylıkla adapte edilebilir.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Teslimat küçük müdahale RNA (siRNA) terapötik uygulanması için ana sorundur. Bu protokol, arginin ve polietilenimin aşılanmış gözenekli silikon mikro oluşan, çok fonksiyonlu ve biyo-uyumlu bir siRNA taşıyıcı platformun kullanılmasını içerir.

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

Burada, merkezi sinir sisteminde etkili gen susturma sağlayan beyin hedeflemepeptipeptipeptik peptid-siRNA formülasyonunun intranazal uygulaması için farelerin uygun yerleştirilmesine olanak tanıyan bir fare konumlandırma cihazı kullanarak bir protokol salıyoruz.

Merkezi Sinir Sistemine İntranazal siRNA Teslimi Sırasında Farelerin Yerleştirilmesi için Bir Konumlandırma Cihazı

Fizikokimyasal özellikleri hazırlamak ve karakterize etmek için yöntemler ve nöphalı, pH duyarlı siRNA nanopartiküller biyoaktivite sunulmaktadır. Boyut, morfoloji, yüzey yükü, siRNA yüklemesi ve gen susturulması gibi başarılı siRNA nanometinler için kriterler tartışılmaktadır.

Sitosolik siRNA teslim için Nötrsel olarak şarj edilmiş, pH duyarlı polimerik nanopartiküller hazırlanması

Burada, omurganın lomber intratekal uzayına bir kateter yerleştirerek sıçan merkezi sinir sistemine ilaç teslim etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem diğer terapötik yöntemlerin de teslimi için uygun olsa da, antisense oligonükleotidlerin teslimatına odaklanıyoruz.

Sıçan Merkezi Sinir Sisteminde Antisense Oligonükleotidlerin İntinal Teslimi

Öğrenin, katyonik ve anyonik lipozomlarla siRNA'nın kan-beyin bariyerini aşarak merkezi sinir sistemine hedefli teslimatını. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklar için güvenli ve etkili bir tedavi seçeneği sunar.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Daha fazla video keşfet