Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Bu prosedürün genel amacı, siRNA gibi küçük moleküllü ilaçları beyne iletebilen bir dağıtım sistemi tasarlamaktır. Bu yöntem, nörodejenerasyon alanındaki şu gibi temel soruları yanıtlayabilir: siRNA, protein yanlış katlanma hastalıkları için uygun bir terapötik seçenek midir? ve Beyne güvenilir bir ilaç taşıyıcı sistem tasarlayabilir miyiz?

Lipozomal bir ilaç dağıtım sistemi oluşturmanın temel avantajı, siRNA'mızı doğrudan nöronal doku yoluyla değil, intravenöz olarak veya kan dolaşımı yoluyla iletebilmemizdir, bu da nöronal hasara neden olur. Bu tekniğin etkileri, nörodejeneratif hastalıkların terapötiklerine ve teşhisine kadar uzanır, çünkü bu teknik, kan-beyin bariyeri boyunca, özellikle asetilkolin eksprese eden nöronlara spesifik bir şekilde verilmesine izin verir. Fare kuyruğu damarının küçük boyutu nedeniyle fare kuyruğu damar enjeksiyonlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu tekniğin görsel gösterimi kritik

Bire bir DOTAP / kolesterol oranı hazırlayarak başlayın. Yabancı bir hayvan lipozomu preparatı için, iki nanomol DOTAP ve iki nanomol kolesterolü on mililitre bire bir kloroformdan metanol çözeltisine karıştırın. Daha sonra, nitrojen gazı kullanarak dokuz mililitre kloroform ve metanol çözeltisini buharlaştırın.

Son bir mililitre çözücüyü bir davlumbazda gece boyunca gazsız olarak buharlaştırın. Ertesi gün, şişenin dibinde ince bir lipit filmi görünmelidir. Hem bu şişeyi lipit film ile hem de on mililitre yüzde on sükroz çözeltisiyle 55 santigrat dereceye ısıtın.

Ardından, şişeyi hafifçe döndürürken ısıtılmış sükroz çözeltisini ince lipit film üzerine yavaşça pipetleyin. Ardından, üreticinin talimatlarına göre bir mikron filtreli bir ekstrüder monte edin. Ardından, ekstrüder üzerindeki şırıngalardan birine bir mililitre ısıtılmış lipozom süspansiyonu ekleyin.

Ardından süspansiyonu iki şırınga arasında 11 kez geçirin. Daha kolay boyutlandırma için lipozom süspansiyonunu sıcak tutarken, lipozomları 45 mikron ve 2 mikronluk bir filtreden geçirin Büyük, unilamellar veziküller oluşturmak için, daha sonra dört nanomol lipozom süspansiyonundan 20 mikrolitre 20 mikrolitre 20 mikromolar stok siRNA çözeltisine ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika inkübe edin. Daha sonra siRNA lipozom çözeltisine 80 mikrolitre 500 mikromolar RVG-9R hedefleme peptidi ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika inkübe edin.

2.2 nanomol DSPE veya DOTAP'ı on mililitre ikiye bir kloroforma 1.6 nanomol kolesterol ve 2 nanomol DSPE peg ile metanol çözeltisine karıştırarak yabancı bir hayvan lipsomoe süspansiyonu hazırlayın. Daha sonra nitrojen gazı uygulayın ve çözücünün çoğu buharlaştığında, şişeyi gece boyunca çeker ocakta bırakın. Ardından, ince lipit filme yavaşça 75 santigrat dereceye kadar ısıtılmış on mililitre 1X PBS ekleyin.

Boyutlandırmadan önce lipitlerin en az bir saat boyunca 75 santigrat derecede rehidre olmasına izin verin. Lipozom süspansiyonunu daha önce olduğu gibi bir ekstrüder kullanarak boyutlandırdıktan sonra, dört nanomol lipozom süspansiyonunun her birinden 20 mikrolitreyi tek kullanımlık alikotlara pipetleyin ve bir tezgah üstü dondurarak kurutucu kullanarak 30 dakika boyunca liyofilize edin. Daha sonra, 200 mikrolitre 20 mikromolar stok siRNA çözeltisine 1.4 mikrolitre 26.6 mikromolar protamin sülfat çözeltisi ekleyin ve siRNA'yı yoğunlaştırmak için oda sıcaklığında on dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, DSPE paletlerini 201.4 mikrolitre siRNA protamin çözeltisi ile rehidre edin. DOTAP paletlerini 200 mikrolitre yabancı bir hayvan stoğu siRNA çözeltisi ile yeniden sulandırın. Her lipozom siRNA çözeltisini oda sıcaklığında on dakika inkübe edin.

Daha sonra, her bir rehidre lipozom tüpüne 60 milimolar EDC çözeltisinden on mikrolitre ekleyin. Ardından, hem DOTAP hem de DSPE paletleri için lipozom siRNA çözeltisine on mikrolitre 150 milimolar sulfo-NHS çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Son olarak, siRNA lipozom çapraz bağlama çözeltisine 80 mikrolitre 500 mikromolar RVG-9R peptit stoğu ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika inkübe edin. Anestezi uygulandıktan sonra, oksijende yüzde iki ila üç izofluran kullanan bir fare, farenin gözlerini apttalmik merhem ile kaplayın ve bir ayak parmağını kıstırarak anesteziyi onaylayın. Sadece bir reaksiyon yoksa devam edin.

Anesteziyi sürdürürken, kuyruk damarına erişmek için fareyi sırtına veya yanına yerleştirin. Kuyruğu yüzde 70 etanol ile silin ve ardından kuyruk damarına 300 mikrolitre LSPC veya palet enjekte etmek için 26 gauge insülin şırıngası kullanın. Distal olarak enjekte etmeye başlayın ve damar çökerse veya yırtılırsa proksimal olarak hareket edin.

Fareyi sternal yaslanma özelliğini koruyana kadar temiz bir kafese koyun. Anestezinin etkisini yitirdiğinden ve tedavinin herhangi bir kötü etkisi olmadığından emin olmak için enjeksiyondan sonra hayvanı birkaç saat izleyin. LSPC'lerin veya paletlerin en az 24 saat boyunca dolaşmasına izin verdikten ve ardından fareye ötenazi yaptıktan sonra, beynin yarım küresini inceleyin.

Daha sonra yarım yarım küreyi ve 2,5 mililitre faks tamponunu 40 mikronluk bir hücre süzgecine yerleştirin ve dokuyu filtreden bir petri kabına bastırmak için bir şırınganın pistonunu kullanın. Hücre süzgecini ve petri kabını ek 2,5 mililitre faks arabelleği ile durulayın. Daha sonra tek hücreli süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve 350 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından, bir mililitre daha faks arabelleği ekleyin ve hücre süspansiyonunu buzun üzerine yerleştirin. Şimdi, hücreleri 100 mikrolitre sıçan anti-fare Fc bloğunda faks tamponunda buz üzerinde 30 ila 60 dakika inkübe edin.

Daha önce olduğu gibi peletleme ve yıkamadan sonra, 100 mikrolitre floresan birincil anti-kor çözeltisi ekleyin ve 30 ila 60 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Son bir yıkamadan sonra, hücreleri bir mililitre RVC lizis tamponunda bir dakika boyunca yeniden süspanse edin. Sonra, hücreleri peletleyin.

Arabelleği attıktan sonra, bir mililitre faks arabelleğinde yeniden askıya alın ve buzun üzerine yerleştirin. Hücreler artık faks analizi için hazırdır. LSPC'ler yoluyla verilen siRNA ile tedavi edilen fareler, hücresel prion protein seviyelerini gösterirken gösteren bir PBS kontrolüne kıyasla hücresel prion protein seviyelerinde önemli bir azalma gösterdi.

LSPC'lerle tedavi edilen fareler, bir prion proteini nakavt fareninkine yakın hücresel prion protein seviyeleri gösterdi. Üç deneyde, LSPC'lerle tedavi edilen fareler, tip kontrolleri sırasında PBS'ye kıyasla hücresel prion protein seviyelerinde önemli düşüşler gösterdi. Bu prosedürü denerken, lipozomların buzdolabında birkaç ay saklanabileceğini hatırlamak önemlidir, ancak tam LSPC'lerin montajdan sonraki 24 saat içinde kullanılması gerekir.

Geliştirilmesinden sonra, LSPC'lerin veya paletlerin üretilmesi, araştırmacıların nörodejeneratif hastalıklar alanında daha terapötik seçenekleri keşfetmelerinin önünü açacaktır.