Name: Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Öğrenin, kronik lenfositik koryomenenjit virüsü ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T hücrelerinin fenotipini ve baskılayıcı işlevini in vitro olarak değerlendirmeyi. Bu yöntem, kronik enfeksiyon sırasında immün yanıt düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Milli Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir (2015R1A6A3A01020610'dan HJP'ye) ve Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi, Sağlık, Refah ve Aile İşleri Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti'nden (SJH'ye HI15C0493) bir hibe.

Bu çalışmada, fareler Yonsei Üniversitesi Yonsei Laboratuar Hayvan Araştırma Merkezi belirli bir patojen içermeyen tesiste muhafaza edildi. Tüm hayvan deneyleri Yonsei Üniversitesi Yonsei Laboratuar Hayvan Araştırma Merkezi Uluslararası Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri kullanarak Kore Gıda ve İlaç İdaresi kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> RPMI içinde% 1% 2 ve penisilin-streptomisin fetal sığır serumu (FBS) seyrelterek% 2 RPMI ortamı hazırlamak </li><li> tam RPMI ortamı hazırlayın. RPMI ortam FBS% 10, penisilin-streptomisin,% 1 L-glutamin,% 1 ve 50 uM 2-merkaptoetanol ekleyin. </li><li> flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) tamponu hazırlayın. FBS% 2 ile çok, ek fosfat tamponlu tuz (PBS) yapmak için. </li><li> T hücre izolasyonu tampon hazırlayın. Bunu yapmak için, FBS% 2 ve 2 mM ethylenediaminetetraa PBS ile ekasetik asit elde edildi. </li></ol> Splenik Lenfositler 2. izolasyonu <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 19 saf ya da LCMV CL13 enfekte farelerden dalak çıkarın ve% 2 RPMI ortam, 10 ml ihtiva eden x 15 mm&#39;lik Petri kaplara 60 mm koyun. NOT: Bu çalışma deneylerde, 5, 6 haftalık için C57B1L / 6J dişi fareler kuyruk veninden intravenöz enjeksiyon yoluyla LCMV CL13 2 x 10 6 plak oluşturucu birim (pfu) aldı. Gün 16 sonrası enfeksiyon (16 d pi) 25 fareler Kurban. Analiz ge-uyumlu naif fareler aynı gün idi. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine, bir hücre süzgeci yerleştirin ve% 2 RPMI ortam, 2 ml ile durulayın. 70 mikron hücre süzgecinden üzerinde dalak yerleştirin ve bir şırınga pistonu kullanarak eziyet. % 2 RPMI ortam 2 ml hücre süzgecinden yıkayın ve 50 ml&#39;lik bir tüp çıkarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de% 2 RPMI ortam ve santrifüj tüpü doldurmak. Süpernatantı atın ve tekrar süspansiyonACK yokedici tamponda 1 ml hücre topağı. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. NOT: Yukarıda belirtilen ACK parçalama tampon hacmi bir dalak içindir. toplanmış dalak örnekleri için buna göre hacmi büyütmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de% 2 RPMI ortam ve santrifüj tüpü doldurmak. Süpernatant atılır ve tam RPMI ortamında 1 x 10 7 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta hücreler tekrar süspansiyon. NOT: tripan mavi ve sadece hemasitometre kullanarak lekeli olmayan hücreleri canlı sayısı ile canlı hücre sayımı, leke hücreleri için. </li></ol> Dalak Konvansiyonel T (T dönüşüm) Hücreler ve T reg Hücreler 3. Fenotiplendirme Not: regülatör T hücre izolasyonu önce, çeşitli antikorlarla hücrelerin boyanması ve akış sitometrisi ile analiz ederek saf ya da enfekte olmuş farelerde izole edilmiş dalak lenfositleri fenotipinin inceleyin. <ol><li> hücreler 50 ul transferYeni bir U tabanlı, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, toplam dalak lenfositler arasındaki (5 x 10 5 hücre) ve oyuk başına FACS tampon 150 ul ekle. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> süpernatant atın. Hücre topağı karıştırın ve oyuk başına FACS tampon 200 ul ekle. 4 ° C&#39;de (2 kez), 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aşağıdaki antikorlar ve reaktifler ile göz başına FACS tamponu 50 ul lekeleme hücre yüzey markörleri için antikor kokteyli hazırlanır. Anti-CD4, mor bir boya, anti-CD25 yeşil boya, anti-PD-1, mor bir boya, anti-CD8 PerCP Cy5.5 boyası ve hücre canlılığı saptama reaktif maddesi yakın kızılötesi (IR), floresan reaktif boya. Not: Aktifleştirilmiş regülatör T hücrelerinin fenotipi analiz etmek için, anti-CD103 23,25 hücre yüzey markör boyanması için ilave edilebilir. </li><li> oyuk başına antikor kokteylinin 50 ul hücre pelletini. 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. ile iki kez hücreleri yıkayın4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FACS tamponu. </li><li> Son yıkama aşamasından sonra, süpernatant süzün ve üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlanan sabitleme tampon 100 ul ile 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca hücrelerin tespit. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile (üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlandı) permeabilizasyon yıkama tamponu ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> hücre içi Foxp3 boyama için antikor çözeltisi hazırlayın ve anti-Foxp3 antikor çözeltisi 50 ul hücre pelletini. Not: daha CTLA bu aşamada eklenebilir T Dönüşümün ve regülatör T hücreleri, fenotipleri analiz etmek. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edilir ve adım 3.6 tekrarlayın. Son yıkama aşamasından sonra, FACS tampon 200 ul hücre pelletini ve 25 akış sitometresi ile hücrelerin fenotipini inceleyin. </li><li> Kapısı canlı hücre nüfuslarıyon. CD4 + veya CD8 + T-hücreleri arasında PD-1 + hücrelerinin - LCMV CL13 enfeksiyonu sırasında T dönüşüm hücrelerin fenotipleri analiz etmek için, Foxp3 sıklığını inceleyin. NOT: Deneysel sonuçlara dayanarak, Foxp3 yüzdesi - PD-1 + LCMV CL13 ile 16 d pi CD4 + ve CD8 + T hem hücre popülasyonlarının% 50&#39;den fazla olduğunu. <ol><li> Regülatör T hücrelerinin frekansı ve fenotipleri analiz etmek için, CD4 + T-hücreleri arasında FoxP3 + ya Foxp3 + PD-1 + hücrelerinin frekansları inceleyin. Not: Deney sonuçlarına göre, Foxp3 + veya Foxp3 + PD-1 + hücrelerinin yüzdesi, sırasıyla, CD4 + T hücresi popülasyonunda fazla% 20&#39;dir. </li></ol></li></ol> CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin 4. Yalıtım Not: Tüm reaktifler hacimleri aşağıdaki belirtilen bir içindir1 x 10 7 toplam splenositlerin hücre sayısını başlangıç. <ol><li> saf ve LCMV kronik olarak enfekte olan fareler kullanılarak bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi hücreler hazırlayın. T hücresi izolasyon tamponunda 10 ml ilave edilerek hücreler yıkanır. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Tamamen Süpernatantı atın ve tampon 40 ul hücre pelletini. </li><li> Manyetik Hücre Ayırma Sistemi kullanılarak, CD4 + T hücresi zenginleştirme için, biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Tampon 30 ul olmayan CD4 + T hücrelerinin etiketlenmesi için, anti-biyotin mikro boncuklar 20 ul ve CD25 + hücrelerinin floresan etiketlemesi için CD25-PE antikorun 10 ul ekle. İyice karıştırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> tampon maddesinin 2 ml ilave edilir ve hücre debrisini uzaklaştırmak için yeni bir 50 ml&#39;lik bir tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçer. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yıkanır.Tamamen Süpernatant atılır ve en fazla 1.25 x 10 8 hücre yoğunluğunda 500 ul tampon içinde hücre pelletini. </li><li> kolona hücreleri uygulayın ve sütunun geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de tampon ve santrifüj 2 ml ekleyerek sütun yıkayın. Tamamen Süpernatantı atın ve tampon 90 ul izole CD4 + T hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> CD25 + hücreleri manyetik işaretleme için, anti-PE mikro 10 ul ilave edilir, iyice karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> tampon maddesinin 2 ml ilave edilir ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yıkayın. Tamamen Süpernatant atılır ve en fazla 1 x 10 8 hücre yoğunluğunda tampon 500 ul hücre pelletini. </li><li> CD4 + CD25 + regülatör T hücreleri zenginleştirmek pozitif seçim için kolona hücreleri uygulamak ve colum yıkamatampon maddesinin 2 ml ekleyerek n. yıkandıkları üç kez tekrarlayın. </li><li> Kolon son yıkama aşamasından sonra boşaldığında, kolona tampon 1 ml ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş CD4 + CD25 + piston kullanarak hücrelerin dışarı yıkayın. </li><li> Tekrar izole CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin saflığı artırmak için 4.8-4.9 adımları tekrarlayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Süpernatant atılır ve tam RPMI ortamında 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda izole CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin yeniden süspanse edin. </li><li> Izole edilmiş-CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin saflığı kontrol etmek için, toplam izole-CD4 + CD25 + regülatör T hücreleri 2 x 10 5 hücre kullanımı. FACS tamponu 50 ul anti-CD4 FITC içeren ve hücre canlılığı, IR-yakını flüoresan reaktif boya saptama reaktif maddesi ile hücreleri Leke. NOT: CD25 zaten izolasyonu sırasında PE ile işaretlenmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Yıkama işleminden sonra, FACS tampon 100 ul hücre pelletini ve akış sitometrisi ile saflığını kontrol. </li><li> Kapısı canlı hücre popülasyonu. Regülatör T hücrelerinin saflığı analiz etmek için, CD4 + CD25 + hücrelerinin yüzdesi teyit etmektedir. Not: Deney sonuçlarına göre, saflaştırılmış hücreler arasında CD4 + CD25 + hücrelerinin yüzdesi yaklaşık% 80 üzerindedir. </li></ol> CD8 + T hücreleri ve CD8 + T hücrelerinin etiketlenmesi 5. Yalıtım NOT: Tüm reaktif hacimleri aşağıda belirtilen 1 x 10 7 toplam splenositlerin bir başlangıç ​​hücre sayısı içindir. <ol><li> saf fareler kullanılarak bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi hücreler hazırlayın. T hücresi izolasyon devetüyü 10 ml ekleyerek hücreleri yıkanırer. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Tamamen supernatant atmak ve tampon 40 ul hücre pelletini. </li><li> Manyetik Hücre Ayırma Sistemi kullanılarak CD8 + T hücre izolasyonu için, sigara CD8 + T hücresi etiketlemesi için, biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> tampon 30 ul anti-biyotin mikro-20 ul ekle. İyice karıştırın ve 4 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> kolona hücreleri uygulayın ve sütunun geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak. Bunu tamponun üç kez 2 ml ekleyerek sütun yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Tamamen Süpernatant atılır ve tamponun 2 ml izole edilmiş CD8 + T hücrelerini yeniden süspanse edin. </li><li> İzole hücreler saflığını kontrol etmek için FACS tamponu içerisinde antikor çözeltisi 50 ul hazırlar. İzole CD8 + T cel arasında 2 x 10 5 hücreleri tekrar süspansiyonAntikor çözeltisinin 50 ul mi. Not: Anti-CD8 FITC ekleyin antikor çözeltisinin hazırlanması ve hücre canlılığı saptama reaktif maddesi (IR-yakını flüoresan reaktif boya) FACS tampon içine için. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Yıkama işleminden sonra, FACS tampon 100 ul hücre pelletini, ve akış sitometrisi ile hücre saflığını kontrol. </li><li> Kapısı canlı hücre popülasyonu. CD8 + T hücrelerinin saflığını kontrol etmek için, CD8 + T hücrelerinin yüzdesini teyit etmektedir. Not: Deney sonuçlarına göre, arıtılmış, hücreleri arasında CD8 + hücrelerinin yüzdesi yaklaşık% 90 üzerindedir. </li><li> Izole edilmiş CD8 + T hücrelerine PBS ekleyin. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant atın. PBS içinde 1 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda izole CD8 + T hücreleri yeniden süspanse edin. </li><li> CD8 + T ce etiketlemek içinin vitro bastırma deneyi için LLS, oda sıcaklığında 5 uM&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için PBS içinde hücre çoğalması izleme mor boya seyreltin. NOT: Çalışmada kullanılan hücre çoğalması izleme mor boya yaklaşık uyarma ve emisyon zirveleri sırasıyla 405 ve 450 nm. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde hücre çoğalması, izleme, mor bir boya (5 uM) ve hücre süspansiyonu (CD8 + T hücreleri 1 x 10 7 hücre / ml) de eşit hacimde karıştırılır ve 37 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. tüpü her 10 dakikada Vortex. </li><li> Soğuk tam RPMI ortamı ile tüp doldurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tüpü terk. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Tamamen supernatant atmak ve önceden ısıtılmış tam RPMI ortamı ile 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li></ol> 6. CD4 + CD25 + T &lt;kullanma İn Vitro Bastırma Testi Kurmasub&gt; reg ve CD8 + T hücreleri <ol><li> Anti-CD3 / CD28 kaplı taneler hazırlamak için, borunun, 15 ml (2.5 ul / 1 x 10 5 hücre) manyetik boncuk uygun hacim transferi. PBS eşit hacimde ilave et ve karıştır. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile yıkayın ve supernatant atın. tam ortam içinde manyetik boncuk (50 ul / oyuk) ile seyreltilir. </li><li> CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin kısım 50 ul, U tabanlı, 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu (1 x 10 5 hücre / oyuk). Cevaplayıcı T (T resp) CD8 + T hücrelerinin hücre oyuk başına (1 x 10 5 hücre / çukur) 50 ul ekle. oyuk başına seyreltilmiş, anti-CD3 / CD28 kaplı manyetik boncuklar 50 ul ekle. NOT: aşağıdaki gibi kontrol kuyuları kurmak bu adımı, etiketli ve: hiçbir anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile &quot;sadece uyarılmamış CD8 + T hücresi&quot;; &quot;CD8 + T hücresi yalnızca&quot; anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile; &quot;CD8 + T hücresi yalnızca&quot;Anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar,&quot;. Regülatör T hücresi sadece &quot;anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile regülatör T hücreleri, T, farklı bir oranda tam ortam ve CO-kültürlenmiş T solunum hücreleri ile seyreltilmiş olabilir Solunum hücreleri: regülatör T hücreleri (1: 0.25-1: 1). </li><li> 200 ul toplam hacmine her kuyulara 50 ul ya da ortamın uygun bir hacim. Folyo ile plaka Kapak ve 72 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir CO2 kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. </li></ol> CD8 + T hücrelerinde 7. analizi CD8 + T hücre proliferasyonu ve sitokin üretim <ol><li> sitokin üretimi analizi için, kültür, 3 gün sonra, iyi bir plaka her yüzey maddesi ayrılır ve enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile yerine getirir. Not: üstteki sıvı kısımlar halinde -70 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Bu deneyde, anti-fare IFN-γ, antikor kaplı plaka IFN-γ üretimi anlaşması tespit etmek için kullanıldıÜreticinin protokolüne ing. Bir tek hücre düzeyinde, CD8 + T hücrelerinin proliferasyon IFN-γ üretimini belirlemek için, hücre içi sitokin boyama yapılabilir. </li><li> her gözden üst fazın ayrılmasından sonra, 4 ° C&#39;de (3 kez), 2 dakika boyunca 300 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj ile hücreler içeren plakayı yıkayın. </li><li> Yıkama işleminden sonra, süpernatant atılır. Prolifere CD8 + T hücrelerinin boyanması için antikor kokteyli 50 ul hücre pelletini. 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. Not: FACS tampon, anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP Cy5.5 ve hücre canlılığı saptama reajanı (IR-yakını flüoresan reaktif boya) ekleyin, antikor kokteyli hazırlanması. NOT: Bu, CD44 veya CD69 gibi çeşitli belirteçler karşı olan antikorlar, CD8 + T hücrelerinin aktivasyonunu teyit etmek için, diğer antikorlar ile birleştirilebilir. CD8 + T hücreleri zaten hücre çoğalması izleme v ile etiketlenmiş edilmiştir unutmayınAdım 5.10 de iolet boya. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile iki kez yıkanır. Son yıkama aşamasından sonra, supernatant atmak ve sabitleme tampon 100 ul ile 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika boyunca hücrelerin tespit. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile iki kez yıkanır. FACS tampon 200 ul hücreleri yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi ile hücre çoğalması izleme mor boya etiketli CD8 + T hücrelerinin proliferasyonunu ölçer. <ol><li> Kapı canlı hücreleri arasında CD8 + T hücresi popülasyonu. Hücre çoğalması, izleme, mor bir boya ve şu denkleme göre, CD8 + T hücresi seyreltme seyreltme göre ayrılır ve kesintisiz hücrelerin yüzdelerini ölçün. % Önleme = [(T Reg hücrelerin yokluğunda çoğaldı CD8 + T hücrelerinin% - regülatör T hücrelerin varlığında çoğalan CD8 + T hücrelerinin%) / (% olarak çoğalmıştır CD8 + T hücrelerininT reg hücrelerinin yokluğu)] x 100 Ayrıntılı yazılımın 25 flow sitometri kullanarak verileri analiz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+LAG-3+in+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of LAG-3 in regulatory T cells.</a> Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).</li>
<li>McHugh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+immunoregulatory+T+cells%3A+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+T+cells+constitutively+expressing+cytotoxic+T+lymphocyte-associated+antigen+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4.</a> J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).</li>
<li>Manigold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3%2BCD4%2BCD25%2B+T+cells+control+virus-specific+memory+T+cells+in+chimpanzees+that+recovered+from+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Blood%22%5BJournal%5D)">Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis.</a> C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+regulatory+T+cells+in+lymphoid+tissue+is+correlated+with+viral+load+in+HIV-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients.</a> J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+Mycobacterium+tuberculosis+immunity+in+patients+with+active+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease.</a> Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).</li>
<li>Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-specific+regulatory+T+cells+delay+the+arrival+of+effector+T+cells+in+the+lung+during+early+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis.</a> J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).</li>
<li>Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+control+Leishmania+major+persistence+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity.</a> Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).</li>
<li>Grainger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helminth+secretions+induce+de+novo+T+cell+Foxp3+expression+and+regulatory+function+through+the+TGF-beta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway.</a> J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).</li>
<li>cells in helminth infection: the regulators and the regulated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Trends+Immunol%22">Trends Immunol</a>. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).</li>
<li>You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regulatory+T+cells+potently+abrogate+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity.</a> J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).</li>
<li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li>
<li>Dittmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impairment+of+CD8%28%2B%29+T+cells+by+regulatory+T+cells+during+persistent+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection.</a> Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).</li>
<li>Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+suppression+of+CD8%2B+T+cell+function+by+Friend+virus-induced+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells.</a> J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).</li>
<li>Iwashiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+by+CD4%2B+regulatory+T+cells+induced+by+chronic+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).</li>
<li>Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+T+cells+regulate+virus-specific+primary+and+memory+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses.</a> J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).</li>
<li>Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+control+the+severity+of+viral+immunoinflammatory+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions.</a> J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).</li>
<li>Veiga-Parga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+regulatory+T+cells+during+viral-induced+inflammatory+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions.</a> J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signature+of+CD8%2B+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).</li>
<li>Jin, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+Tim-3+and+PD-1+in+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).</li>
<li>Punkosdy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T-cell+expansion+during+chronic+viral+infection+is+dependent+on+endogenous+retroviral+superantigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).</li>
<li>Blackburn, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coregulation+of+CD8%2B+T+cell+exhaustion+by+multiple+inhibitory+receptors+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection.</a> Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).</li>
<li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+upregulated+on+regulatory+T+cells+during+chronic+virus+infection+enhances+the+suppression+of+CD8%2B+T+cell+immune+response+via+the+interaction+with+PD-L1+expressed+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells.</a> J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).</li>
<li>Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining chronic viral infection.</a> Cell. 138 (1), 30-50 (2009).</li>
<li>Penaloza-MacMaster, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+regulatory+T+cells+and+PD-1+in+modulating+T+cell+exhaustion+and+viral+control+during+chronic+LCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection.</a> J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).</li>
<li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Peli1+negatively+regulates+T+cell+activation+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity.</a> Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).</li>
<li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+infection+with+respiratory+syncytial+virus+impairs+regulatory+T+cell+function+and+increases+susceptibility+to+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma.</a> Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).</li>
<li>Tai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+of+CTLA-4+function+in+regulatory+and+conventional+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells.</a> Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).</li>
<li>Rushbrook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+suppress+in+vitro+proliferation+of+virus-specific+CD8%2B+T+cells+during+persistent+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).</li>
<li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+orphan+receptor+Nr4a2+induces+Foxp3+and+regulates+differentiation+of+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4.</a> T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).</li>
<li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li>
<li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li>
<li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4%28%2B%29CD25%28high%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li>
<li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5%2B+natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li>
</ol>

S.-J.H.'nin bir patenti vardır ve PD-1 yolu ile ilgili patent telif ücreti alır. Diğer yazarların herhangi bir mali çıkar çatışması yoktur.

Regülatör T hücrelerinin sadece küçük bir bölümü, farelerde ve insanlarda mevcut olmakla beraber, bunların bir bağışıklık tepkisi düzenlenmesi ve immün tolerans korumada önemli bir rol oynar olarak işlev anlamak önemlidir. T numarası ve baskılayıcı işlevleri kronik virüs enfeksiyonuna 15-20 yanı sıra kanser ilerlemesi 13,14 sırasında hücreler artar reg. Bu muhtemelen devam antijen uyarılmasına bağlıdır. Reg hücreleri antijen sebat ve hastalık gelişimi altında faaliy...

Düzenleyici T (T reg) hücreleri kendi gelişimi ve işlevi 1 için bir transkripsiyon faktörü olarak forkhead kutusu P3 (Foxp3) ifade eder. Buna ek olarak, regülatör T hücreleri, CD25 2, lenfosit aktivasyonu geni 3 (ara-3) 3, glukokortikoitin yol açtığı tümör nekroz faktörü reseptör 4, ve sitotoksik gibi çeşitli başka molekülleri ifade T-lenfosit-ilişkili protein 4 (CTLA-4) &#39;5 yüzeylerinde ya da hücre içi bölgeye. Bu tür virüsler 6,7, bakteriler 8,9, ve parazitler 10-12 veya kanser gelişimi 13,14 sırasında olduğu gibi patojenlerin çeşitli kronik enfeksiyon sırasında, T reg hücreleri gelişmiş baskılayıcı fonksiyon gösteren, aktif hücrelerin içine ayırt hale hedefleme efektör CD4 + ve CD8 + T hücreleri. Kağıtların bir dizi genişletilmiş ve aktive regülatör T hücreleri, bozulmuş CD8 + T hücresi yanıt vermeyen katkıda sürmüşlerdirarkadaş retrovirüs (FV) enfeksiyonu 15-17 sırasında e. FV kaynaklı regülatör T hücrelerinin IFN-y ya da Granzim B ekspresyonu ve CD8 + T hücrelerinin 15-17 sitotoksik reaktivite inhibe eder. Ayrıca, bir herpes simpleks virüsü enfeksiyon modelinde, bu virüse spesifik CD8 + T hücreleri ve immünopatojenik CD4 + T hücrelerinin 18-20 infiltrasyonu ile ciddi doku hasarının genişleme sonuçlandı CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin tükenmesinin bildirilmiştir. Lenfositik koryomenenjit virüsünün klon 13 suşu ile kronik olarak enfekte olan fareler (LCMV CL13) 21-24 yaygın kronik virüs enfeksiyonu esnasında efektör T hücrelerinin (EFF) ve regülatör T hücrelerinin fenotip ve işlevini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Kalıcı LCMV enfeksiyonunun sırasında virüs spesifik T EFF hücreleri kademeli olarak efektör fonksiyonunu kaybeder ve tükenmiş T (T exh) hücreler haline gelirler. Diğer yandan, TREG hücreleri virüs-belirgin T hücre tepkisine 25 önleme yeteneklerinden güçlendirir. T eff hücrelerinin çalışması kapasitesinde azalma, T eff hücreleri üzerinde inhibe edici reseptör artışı, antijen-sunan hücrelerin değişmiş fonksiyonu, bağışıklık sitokinlerin üretimi ve artan frekans veya regülatör T gelişmiş fonksiyonu olarak çeşitli faktörler tarafından açıklanabilir hücreler 26. T hücresi bastırılmasıyla ilgili faktörler arasında, programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) -expressing T exh hücreleri ve regülatör T hücreleri yaygın antijene kalıcılık ve baskılayıcı çevre işaretlerinden olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu T reg hücrelerinin PD-1 yolunun ve ablasyon abluka gelişmiş T hücre fonksiyonuna neden olduğunu bildirdi ve LCMV kronik enfeksiyon 27 sırasında viral yük azaltıldı. Ayrıca, regülatör T hücreleri LCMV 23,25 ile farelerin kronik enfeksiyon sırasında aktive edilir </syukarı&gt; ve baskılayıcı fonksiyonu 25 güçlendirilmiştir. PD-1 yüksek regülatör T hücreleri hem de T exh hücre ifade edilir, ve PD-1 regülatör T hücreleri tarafından ifade seviyesi, T hücre proliferasyonunu 25 inhibe etme baskılayıcı fonksiyonu gücü ile ilişkilidir. Burada, LCMV CL13 ve naif farelerden izole dinlenme T reg hücreleri ile enfekte edilen farelerin izole aktive T reg hücrelerinin özelliklerini karşılaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, aktive edilmiş T-hücrelerinin ayrılmasında reg ve ex vivo fenotipi incelenmesi, hem de in vitro olarak da bastırma etkinliğini ölçmek için bir dizi işlemden açıklar.

<table><tbody><tr><td>FITC Sıçan Anti-Fare CD4</td><td>RM4-5</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td></tr><tr><td>U-Alt Doku Kültürü Plakaları</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>353077</td></tr><tr><td>Fiksasyon tamponu</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD25</td><td>7D4</td><td>BD Biosciences</td><td>553072</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci, 70 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci, 40 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-fare CD279 (PD-1)</td><td>29F.1A12</td><td>BioLegend</td><td>135217</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>Biolegend</td><td>100547</td></tr><tr><td>APC Anti-Fare/Sıçan Foxp3&nbsp;</td><td>FJK-16s</td><td>eBioscience</td><td>17-5773</td></tr><tr><td>Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-5223</td></tr><tr><td>PerCP-Cyanine5.5 Anti-Fare CD8a</td><td>53-6.7</td><td>eBiosicence</td><td>45-0081</td></tr><tr><td>Fare IFN-gama Platin ELISA</td><td></td><td>eBiosicence</td><td>BMS606</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30027</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30256</td></tr><tr><td>ACK Parçalama Tamponu</td><td></td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td></tr><tr><td>L-Glutamin, 200 mM çözelti</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25030</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin, 10.000 U/ml</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10378-016</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke Kiti</td><td></td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>L-34975</td></tr><tr><td>CD8a+ T Hücre İzolasyon Kiti, fare</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-104-075</td></tr><tr><td>CD4+ CD25+ Düzenleyici T Hücre İzolasyon Kiti, fare</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-091-041</td></tr><tr><td>MACS Ayırma Kolonları, LD kolonları</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-901</td></tr><tr><td>MACS Ayırma Kolonları, LS kolonları</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M (pH 8.0)</td><td></td><td>Promega</td><td>V4231</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td></td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>M7522</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30919.03</td></tr><tr><td>CellTrace Menekşe Hücre Proliferasyon Kiti</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34557</td></tr><tr><td>BD Canto II akış sitometresi</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td></td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Hematositomer</td><td></td><td>Marienfeld üstün</td><td></td></tr></tbody></table>

fenotipik ve kronik lenfositik koryomenenjit virüs ile enfekte fare İzole aktif düzenleyici t hücrelerinin fonksiyonel analiz

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Bir transkripsiyon faktörü olarak Foxp3 ifade eden düzenleyici T (T reg) hücreleri, CD4 + T hücrelerinin alt kümeleridir. T reg hücreleri bağışıklık yanıtını düzenleyerek immün tolerans ve homeostasis bakım çok önemli rol oynarlar. Regülatör T hücrelerinin temel görevi efektör T (T EFF) hücrelerinin çoğalması ve IFN-y, TNF-a ve IL-2 gibi sitokinlerin üretimini baskılamaktır. T eff hücrelerin fonksiyonunu inhibe regülatör T hücrelerinin yeteneği inatçı bir patojen enfeksiyon ve kanser gelişimi sırasında gelişmiş olduğu gösterilmiştir. Dinlenme veya iltihaplı koşullar altında regülatör T hücrelerin fonksiyonunu fare ya da insan regülatör T hücreleri kullanılarak in vitro bastırma edilen çeşitli testler öne sürülmüştür değerlendirmektir. Bu çalışmanın temel amacı, fenotip ve dinlenme arasındaki baskılayıcı fonksiyon farklılıkları ve aktive olmuş T reg karşılaştırmak için bir yöntem geliştirmektirHücreler. Aktive T reg hücreleri izole etmek için, fareler, lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) klon 13 (CL13) ile LCMV kronik zorlanma enfekte edildi. LCMV CL13-enfekte edilen farelerin dalak izole regülatör T hücreleri naif farelerden izole edilen regülatör T hücreleri dinlenme ile karşılaştırıldığında aktive fenotip ve geliştirilmiş baskılayıcı aktivitesini sergiledi. Burada, T reg hücrelerini dinlenme aktive T reg hücreleri ayırt etmek ex vivo fenotip analizi için temel protokol açıklar. Ayrıca, tam olarak aktif regülatör T hücrelerin baskılayıcı aktivitesi ölçümü için bir protokol açıklar.

Biz intravenöz LCMV CL13 2 x 10 6 pfu ile enjekte edilerek kalıcı virüs enfeksiyonu ile fareler üretti. Regülatör T hücreleri ve kronik virüs enfeksiyonu sırasında T dönüşüm hücrelerde fenotipik değişiklikler araştırıldı, saf ve enfekte farelerden elde edilen dalak lenfositleri çeşitli antikorlarla boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. CD4 + T sohbetler (Şekil 1A, üst panel) ve Foxp3 - -...

Burada, naif ve kronik lenfositik koryomenenjit virüsü ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T (Treg) hücrelerinin fenotipini analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, Treg hücrelerinin baskılayıcı aktivitesini değerlendirmek için bir süreç sunuyoruz.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Bu prosedürün genel amacı, kronik virüs enfeksiyonu olan farelerden izole edilen düzenleyici T hücrelerinin in vitro baskılama fonksiyonunu değerlendirmektir. Bu yöntem, kronik bir virüs enfeksiyonu sırasında aktive olmuş düzenleyici T hücrelerinin fenotipi ve in vitro baskılama fonksiyonu hakkındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, düzenleyici T hücrelerinin, in vitro ortamda T hücrelerine pozitif yanıt veren bireyler üzerindeki doğrudan etkisini değerlendirebilir.Bu, bu tekniğin çok büyük bir avantajıdır. Yeni bir U tabanlı 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa, 50 µL FACS tamponu içindeki 5x10⁵ toplam splenik lenfositin aktarılmasıyla başlayın ve ardından 150 µL FACS tamponu ekleyin. Plakayı santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.Ardından hücre peletlerini çalkalayın ve hücreleri kuyuk başına 200 µL facs buffer ile iki kez daha yıkayın. İkinci yıkamadan sonra peletleri, kuyuk başına 50 µL antikor kokteyli içinde, dört °C'de karanlıkta 20 dakika boyunca yeniden süspande edin. Ardından hücreleri facs buffer ile iki kez yıkayın ve süpernatanı dökün.Ardından, hücreleri 100 µL fiksasyon tamponu ile dört derece santigrat sıcaklıkta, karanlıkta 20 dakika boyunca fikse edin ve ardından permeabilizasyon yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri 50 µL anti-FOXP3 antikoru içinde yeniden süspande edin. Anti CD3 CD28 kaplı boncukları hazırlamak için, uygun hacimdeki manyetik boncukları 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve eşit hacimde PPS ekleyin.Çözeltiyi pipetleme yoluyla nazikçe karıştırın ve manyetik boncukları santrifüjleyin. Yıkama işleminin sonunda süpernatantı uzaklaştırın ve boncukları kuyuk başına 50 µL tam besiyerinde seyreltin. Ardından, 96 kuyucuklu U tabanlı bir plakaya kuyuk başına 1×10⁵ CD4 pozitif CD25 pozitif regülatör T hücresi içeren 50 µL ekleyin ve bunu kuyuk başına 1×10⁵ CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücresi içeren 50 µL ile takip edin.Tüm hücreler ekildikten sonra, her bir kuyucuğa 50 µL seyreltilmiş anti CD3 CD28 kaplı boncuk ekleyin ve her kuyucuğun toplam hacmini 200 µL'ye tamamlamak için 50 µL'ye kadar besiyeri ekleyin. Ardından plakayı folyo ile kapatın ve 72 saat boyunca 37 °C'de, bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. CD8 pozitif T hücresi sitokin üretimini analiz etmek için, üç günlük kültürden sonra süpernatantları başka bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve üretici talimatlarına göre ELISA ile analiz edin.CD8 pozitif T hücrelerinin proliferasyonunu analiz etmek için, hücre plağını üç kez facs tamponu ile yıkayın. Ardından pelletleri, prolifere olmuş CD8 pozitif T hücrelerine karşı uygun bir antikor kokteyli içeren 50 µL çözelti içinde, 4 °C'de karanlıkta 20 dakika boyunca yeniden süspande edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri facs tamponu ile iki kez yıkayın ve 100 µL fiksasyon tamponu ile 4 °C'de karanlıkta 20 dakika boyunca fikse edin.Son olarak, hücreleri facs tamponu ile iki kez daha yıkayın ve peletleri 200 µL facs tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından, phylate dilabellemiş CD8 pozitif T hücresi proliferasyonunun yüzdesini akış sitometrisi ile ölçün. Naif ve enfekte farelerden elde edilen splenik lenfositlerde, PD-1 özellikle LCMV klon 13 enfekte farelerin hem konvansiyonel FOXP3 negatif CD4 pozitif hem de FOXP3 negatif CD8 pozitif hücrelerinde yukarı regüle olmaktadır.FOXP3 pozitif CD4 pozitif regülatör T hücrelerinin frekansı, LCMV klon 13 enfekte farelerde naif farelere göre iki kat daha yüksektir ve FOXP3 pozitif CD4 pozitif hücrelerin çoğu aynı zamanda aktive olmuş PD-1 yüksek bir fenotip sergilemektedir. CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücreleri, diğer immün hücreler tarafından önemli bir kontaminasyon olmaksızın başarıyla ayrıştırılabilir. Regülatör T hücresi izolasyonundan sonra, yüzde 80'in üzerinde saflığa sahip baskın bir CD25 pozitif CD4 pozitif T hücresi popülasyonu elde edilebilir.İzole edilmiş regülatör ve yanıtlayıcı T hücrelerinin anti CD3 CD28 kaplı boncuklarla stimülasyonu, CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücrelerinin doz bağımlı bir şekilde inhibisyonu ile sonuçlanır. Nitekim, CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücreleri kronik regülatör T hücreleri ile bire bir oranda birlikte kültüre edildiğinde, CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücresi proliferasyonu önemli ölçüde inhibe olur. CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücreleri kronik olarak enfekte farelerden elde edilen aktive regülatör T hücreleri ile birlikte kültüre edildiğinde, naif farelerden elde edilen dinlenme halindeki regülatör T hücreleri ile yapılan birlikte kültüre kıyasla, CD8 pozitif yanıtlayıcı hücreler tarafından üretilen interferon gama miktarı da önemli ölçüde inhibe olur.Bu tekniğin, doğru şekilde uygulandığında 80 saat içinde tamamlanabildiğini saptadık. Bu prosedürü uygularken, yeni izole edilmiş regülatör T hücrelerini izolasyonun hemen ardından kullanmayı hatırlamanız önemlidir. Bu gelişimin ardından söz konusu teknik, tıp alanındaki araştırmacıların kronik inflamatuar bir hastalıkta regülatör T hücrelerinin işlevini incelemelerinin önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, düzenleyici ve yanıtlayıcı T hücresi ko-kültür sistemi kullanarak, in vitro bir düzenleyici T hücresi baskılama prosedürünün nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz...

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Biz HIV-spesifik CD4 T hücreleri tarafından sitokin salgılanmasının düzenlenmesinde immünregulatuar yolların rolünü araştırmak için bir in vitro testi geliştirdi.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Bir çok deney sistemleri, bir immün yanıt olarak T hücresi gelişimini ve fonksiyonunu düzenlemek mekanizmaları anlamak için kullanılmıştır. İşte retroviral transdüksiyon kullanarak genetik yaklaşım düzenleyici yolları belirlenmesinde, ekonomik zaman verimli ve en önemlisi, son derece bilgilendirici olan tarif edilmektedir.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Bu makalede, influenza virüs enfeksiyonunun fare modelinde Tfh ve GC B yanıtını değerlendirme protokolleri açıklanmaktadır.

Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Mevcut çalışma, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Çalışma, epikütan (EC) bağışıklama yoluyla farelerde bağışıklık tepkilerini modüle etmede cildin rolünü göstermektedir. Bir protein antijeni ile EC bağışıklaması, patojenle ilişkili moleküler paternlerle birleştirildiğinde temas aşırı duyarlılığında veya ters cilt kaynaklı baskılamada bağışıklık tepkilerini baskılayabilir. EC bağışıklaması, immünoterapiye etkili, iğnesiz bir yaklaşım olarak umut vaat etmektedir.

Epikütan İndüklenen İmmünomodülasyonun Murin Modeli

Bu protokol, düzenleyici T hücrelerinin efektör T hücre çoğalması ve farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için in vitro bir ortak kültür stratejisi sunar.

In Vitro Düzenleyici T Hücrelerinin Fonksiyonel Analizi: Proliferasyon ve Farklılaşmaya Odaklanma

Öğrenin, kronik lenfositik koryomenenjit virüsü ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T hücrelerinin fenotipini ve baskılayıcı işlevini in vitro olarak değerlendirmeyi. Bu yöntem, kronik enfeksiyon sırasında immün yanıt düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Daha fazla video keşfet