Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Bu prosedürün genel amacı, kronik virüs ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T hücrelerinin in vitro baskılayıcı fonksiyonunu değerlendirmektir. Bu yöntem, kronik bir virüs enfeksiyonu sırasında aktive edilmiş düzenleyici T hücrelerinin fenotipi ve in vitro baskılayıcı işlevi hakkındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik, düzenleyici T hücrelerinin, in vitro olarak T hücrelerine pozitif yanıt veren birey üzerindeki doğrudan etkisini değerlendirebilir.

Bu, bu tekniğin büyük bir avantajıdır. Yeni bir U alt 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre facs tamponunda beş kere on ila beşinci toplam splenik lenfositleri aktararak başlayın, ardından 150 mikrolitre facs tamponu izleyin. Plakayı santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Daha sonra hücre peletlerini çalkalayın ve hücreleri kuyucuk başına 200 mikrolitre facs tamponunda iki kez daha yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, peletleri oyuk başına 50 mikrolitre antikor kokteyli içinde, karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri facs tamponunda iki kez yıkayın ve süpernatanı boşaltın.

Daha sonra, hücreleri karanlıkta 20 dakika boyunca 100 mikrolitre fiksasyon tamponu ile dört santigrat derecede sabitleyin, ardından geçirgenleştirme yıkama tamponu ile iki yıkama yapın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri 50 mikrolitre anti-FOXP3 antikoru içinde yeniden süspanse edin. Anti CD3 CD28 kaplı boncukları hazırlamak için, uygun hacimde manyetik boncukları 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve eşit hacimde PPS ekleyin.

Çözeltiyi pipetleyerek nazikçe karıştırın ve manyetik boncukları santrifüjleyin. Yıkamanın sonunda, süpernatanı atın ve boncukları kuyu başına 50 mikrolitre tam ortamda seyreltin. Daha sonra, 96 oyuklu bir U alt plakasında oyuk başına beşinci CD4 pozitif CD25 pozitif düzenleyici T hücresine 50 mikrolitre tohum atın, ardından kuyucuk başına beşinci CD8 pozitif yanıt veren T hücresine 50 mikrolitre bir çarpı on ekleyin.

Tüm hücreler kaplandığında, her bir oyuğa 50 mikrolitre seyreltilmiş anti CD3 CD28 kaplı boncuk ekleyin ve her bir oyuğun toplam hacmini 200 mikrolitreye çıkarmak için 50 mikrolitreye kadar ortam ekleyin. Daha sonra plakayı folyo ile örtün ve 72 saat boyunca bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat dereceye yerleştirin. CD8 pozitif T hücresi sitokin üretimini analiz etmek için, üç günlük kültürden sonra, süpernatanları başka bir 96 oyuklu plakaya aktarın ve süpernatanları üreticinin talimatlarına göre ELISA ile analiz edin.

CD8 pozitif T hücrelerinin proliferasyonunu analiz etmek için, hücre plakasını facs tamponu ile üç kez yıkayın. Daha sonra peletleri, çoğaltılmış CD8 pozitif T hücrelerine karşı 50 mikrolitre uygun bir antikor kokteyli içinde karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri facs tamponunda iki kez yıkayın ve 100 mikrolitre fiksasyon tamponu ile karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika sabitleyin.

Son olarak, hücreleri facs tamponunda iki kez daha yıkayın ve peletleri 200 mikrolitre facs tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra akış sitometrisi ile filat dilabelled CD8 pozitif T hücresi proliferasyonunun yüzdesini ölçün. Naif ve enfekte farelerden elde edilen splenik lenfositlerde, PD-1, LCMV klonu 13 enfekte farelerin hem geleneksel FOXP3 negatif CD4 pozitif hem de FOXP3 negatif CD8 pozitif hücrelerinde spesifik olarak yukarı regüle edilir.

FOXP3 pozitif CD4 pozitif düzenleyici T hücrelerinin sıklığı, LCMV klon 13 ile enfekte olmuş farelerde, saf farelere göre iki kat daha yüksektir ve FOXP3 pozitif CD4 pozitif hücrelerin çoğu ayrıca aktive edilmiş bir PD-1 yüksek fenotipi gösterir. CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücreleri, diğer bağışıklık hücreleri tarafından önemli bir kontaminasyon olmadan başarılı bir şekilde ayrılabilir. Regülatör T hücresi izolasyonundan sonra, yüzde 80'den fazla saflığa sahip baskın bir CD25 pozitif CD4 pozitif T hücresi popülasyonu elde edilebilir.

İzole regülatör ve yanıtlayıcı T hücrelerinin anti CD3 CD28 kaplı boncuklar tarafından uyarılması, CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücrelerinin doza bağımlı bir şekilde inhibisyonu ile sonuçlanır. Gerçekten de, CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücreleri, kronik düzenleyici T hücreleri ile bire bir oranında birlikte kültürlendiğinde, CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücresi proliferasyonu önemli ölçüde inhibe edilir. CD8 pozitif yanıtlayıcı hücreler tarafından interferon gama üretimi, CD8 pozitif yanıtlayıcı T hücreleri, kronik olarak enfekte olmuş farelerden aktive edilmiş düzenleyici T hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde, saf farelerden dinlenen düzenleyici T hücreleri ile ko-kültüre kıyasla önemli ölçüde inhibe edilir.

Düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde bu tekniğin 80 saat içinde tamamlanabileceğini gördük. Bu prosedürü denerken, izolasyonlarından hemen sonra yeni izole edilmiş düzenleyici T hücrelerini kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, tıp alanındaki araştırmacıların kronik inflamatuar bir hastalıkta düzenleyici T hücrelerinin işlevini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, düzenleyici ve yanıtlayıcı bir T hücresi ko-kültür sistemi kullanarak in vitro düzenleyici T hücresi baskılama prosedürünün nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız.