Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı
16 Nisan 2016
Bu protokol, 30 dakika içinde 10 μL tam kandaki proteinlerin femto molar algılama duyarlılığının nasıl elde edileceğini göstermektedir. Bu, yüksek yüzey alanının yanı sıra gelişmiş sinyal-gürültü oranı için etkili karıştırma ve yıkama sunan bir disk üzerinde laboratuvara entegre edilmiş elektroeğrilmiş nanolifli matlar kullanılarak elde edilebilir.
Bu prosedürün genel amacı, doğal eğrilmiş nanofiberler kullanarak ELISA'nın algılama hassasiyetini iyileştirmektir. Bu video, 30 dakika içinde 10 mikrolitre tam kan örneğinde proteinlerin femtomolar tespit duyarlılığının nasıl elde edileceğini göstermektedir. Disk üzerinde laboratuvar platformunda, sıvıyı odacıklardan aktarmak için merkezkaç kuvveti kullanılır ve toplam süreç tamamen otomatiktir.
Algılama hassasiyeti, nanofiberlerin entegrasyonu ile oldukça arttırılabilir. Ancak sorun, nanofiberin çok kırılgan ve kullanımı zor olmasıydı. Bu videoda, kırılgan titanyum dioksit nanofiber paspasları plastik bir diske takmak için basit bir işlem sunuyoruz.
Elektrospinning ile silikon substrat üzerinde titanyum dioksit nanofiber paspaslar üretmek için, silikon substrat önce silanize edilir, PDMS ile kaplanır ve önceden kürlenir. Daha sonra bu önceden hazırlanmış PDMS'ye bir nanofiber mat aktarılır ve bu ürün, tutturma için dairesel bir parça üretmek üzere delinir. Reaksiyon odasını yapıştırıcı olarak bir damla PDMS ile kaplayın ve dairesel parçayı odanın dibine yapıştırın.
Ardından, PDMS'yi fırında kürleyin. Son olarak, disk katmanlarını ELISA için eksiksiz bir cihazda birleştirin. Bu nanolif transfer tekniği, biyoanaliz için nanoliflerin yüksek yüzey alanını kullanmamızı sağlar.
Santrifüj mikrofilitik cihaz, ELISA'da gerekli olan tüm süreçlerin tam entegrasyonunu ve otomasyonunu sunar. Bu tekniğin diğer mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, sadece 10 mikrolitre tam kandan femtomolar protein konsantrasyonlarını tespit edebilmesidir. Öncü çözeltileri, ekteki test protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.
Daha sonra çözeltiyi elektro döndürücüye yükleyin ve en uygun koşulları kullanarak nanolifleri elektro eğirme ile üretin. Polimer nanofiber paspaslar hazırlandığında, bunları vakum altında bir fırında kalsine edin. Kalsinasyondan sonra, titanyum dioksit nanofiber paspaslar nihayet hazırlanır.
SOLIDWORKS gibi 3D tasarım yazılımlarını kullanarak mikrofilik düzeni hazırlayın ve tasarımı CNC freze makinesine aktarın. Diski kanallar ve haznelerle imal etmek için CNC freze makinesini çalıştırın. Disk ve nanofiber mat artık entegre edilmeye hazırdır.
Bir vakum odası, silikon substrat ve florosilan hazırlayın. Silikon substratı 30 dakika boyunca vakum altında florosilan ile silanize edin. 10'a bir oranında bir kürleme maddesi ile prepolimer hazırlayarak konuk PDMS'yi hazırlayın ve kaplamayı 650 saniye boyunca 60 RPM'de silanize silikon substrat üzerine sıkın.
Silanize gofret üzerine kaplanmış PDMS'yi yapışkan hale getirmek için 65 santigrat derecede 10 dakika kürleyin. Şimdi bu nanofiber paspasları, cam slayt gibi düz bir nesne kullanarak uygun basınç uygulayarak PDMS kaplı silikonun üzerine aktarın. Yapışkan PDMS'yi tamamen kürlemek için numuneyi 80 santigrat derecede bir saat pişirin.
PDMS katmanına tutturulmuş nanofiber paspasların üzerine birkaç damla etanol dağıtın ve bir PunchIt kullanarak altı milimetre çapında bir delik açın. Daha sonra, silikon alt tabakadan PDMS üzerine tutturulmuş delikli nanofiber paspasların soyun. Daha sonra, diskteki bağlanma reaksiyon odasını yaklaşık 20 mikrolitre PDMS karışımı ile kaplayın ve PDMS üzerine tutturulmuş nanofiberleri odalara yerleştirin.
Ardından, nanofiber mat entegre diski bir saat boyunca 80 santigrat derecede inkübe edin. Etanol içinde GPDES'in hacim başına% 1 hacim hazırlayın. Daha sonra, diskteki nanofiberleri oksijen plazması ile tedavi edin.
Her nanofiber mat üzerine 100 mikrolitre GPDES çözeltisi dağıtın ve kapalı bir kapta iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, diski bir sileceğe hafifçe vurarak GPDES solüsyonunu çıkarın. Etanol ile yıkayın, çıkarın ve 80 derecede bir saat pişirin.
Pişirdikten sonra etanol ile yıkayın ve çıkarmak için hafifçe vurun. Bu işlemi tekrarlayın ve bir nitrojen akışı ile kurutun. Antikor immobilizasyonu için, seyreltilmiş yakalanan antikor çözeltisini dağıtın.
Diskleri nemlendirilmiş bir odada tutun ve dört saat boyunca 37 derecede inkübe edin. Kalan çözeltiyi yıkama tamponu ile yıkayın. Şimdi, diski çift taraflı bir yapışkan bant kullanarak birleştirin.
Katmanları tam bir diskte birleştirmek için makul bir basınç uygulayın. Bağlayıcı reaksiyon odalarını bloke edici tampon ile doldurun ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve diski kullanana kadar 40 santigrat derecede saklayın.
Reaktifleri, yıkama tamponlarını ve 10 mikrolitre tam kanı reaktif ve numune odalarına yükleyin. Otomatik immünolojik test için diski özel olarak oluşturulmuş bir görselleştirme makinesine yerleştirin. Görselleştirme sistemi, otomatik disk çalışması için bir bilgisayara bağlı bir rotorun yanı sıra bir flaş ışığı ve görüntü almak için bir CCD kamera içerir.
Kırmızı kan hücrelerini ayırmak için diski 60 saniye boyunca 3.600 RPM'de döndürün. Plazmayı tespit antikorları ile karıştırın. Karışımı titanyum dioksit nanofiber mat ile entegre reaksiyon odasına aktarın.
İmmünoreaksiyondan sonra, yıkama tamponunu reaksiyon odasına aktararak nanolifleri yıkayın. Daha sonra, kemilüminesan substrat çözeltisini bağlayıcı reaksiyon odasına aktarın ve bir dakika boyunca bir karıştırma modunda inkübe edin. Son olarak, reaksiyona sokulmuş substrat çözeltisini algılama odasına aktarın.
Tüm reaksiyon bittiğinde, diski bir algılama sistemine aktarın ve özel olarak oluşturulmuş yazılımı kullanarak kemilüminesan sinyali okuyun. Disk çalışması ve algılama sistemi tek bir platforma entegre edilebilir. Voltajı ve floratı optimize ederek, bu SEM görüntüsünde gösterildiği gibi tek tip nanofiber matlar elde edildi.
PDMS kürleme süresini optimize etmek için yapışma kuvveti ölçüldü. Çok kısaysa, nanofiber mat PDMS'ye gömüldü veya çok uzunsa soyuldu. Optimizasyondan sonra, nanofiber mat daha sonra PDMS'ye sabit bir şekilde tutturuldu.
İki platformdan C-reaktif protein tespiti için doğrusal aralık bu grafikte gösterilmiştir. Diskteki nanofiber bütünlük laboratuvarını kullanarak, 30 dakika içinde sadece 10 mikrolitre serumdan C-reaktif proteinin yüksek derecede gelişmiş algılama hassasiyetini elde edebildik. 96 kuyulu plaka bazlı ELISA gibi şu anda mevcut olan teknolojiler, daha büyük bir numune hacmi ve daha uzun bir algılama süresi gerektirir.
Genel olarak, nanofiber entegre disk tabanlı ELISA, altı femtomol C-reaktif protein tespit limiti ile altı büyüklük mertebesinde geniş, dinamik bir aralık gösterdi. Diske entegre nanofiber tarafından sağlanan yüksek yüzey alanı ile desteklenen bu algılama hassasiyeti, 2.000 femtomol ile sınırlı olan geleneksel ELISA'nınkini aştı. Bu videoyu izledikten sonra, santrifüjlü mikrofilitik cihazın nasıl hazırlanacağını, fazal nanofiberlerin nasıl entegre edileceğini ve ELISA kullanılarak protein tespitine nasıl uygulanacağını iyi anladığınızı umuyoruz.
Bu teknik, çok az miktarda biyolojik numunede düşük bağlı proteinleri tespit etmek için yararlı olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, 10 µL tam kanda proteinlerin femtomolar saptama hassasiyetine 30 dakika içinde nasıl ulaşılacağını göstermektedir. Yöntem, etkili karıştırma ve yıkama yoluyla sinyal-gürültü oranını artıran, bir lab-on-a-disc platformuna entegre edilmiş elektroeğirme nanofiber matlar kullanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Protein Tespiti
- Nanoteknoloji
Arka Plan
- ELISA, protein tespiti için yaygın kullanılan bir yöntemdir.
- Tespit hassasiyetinin artırılması, doğru teşhis için kritik öneme sahiptir.
- Doğal eğirme nanofiberler hassasiyeti artırabilir ancak kırılgandırlar.
- Otomatik disk üzerindeki laboratuvar (lab-on-a-disc) sistemleri süreci optimize edebilir.
Çalışmanın Amacı
- ELISA'nın tespit hassasiyetini artırmak.
- Disk üzerindeki laboratuvar (lab-on-a-disc) düzeneğinde nanoliflerin kullanımını göstermek.
- Hassas nanolif matlarının işlenmesi için bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Titanyum dioksit nanolif matların plastik bir disk üzerine entegrasyonu.
- Sıvıların odacıklar arasında transferi için santrifüj kuvvetinin kullanımı.
- Tüm tespit sürecinin otomasyonu.
- Tam kan örneklerinde tespit hassasiyetinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Protein tespiti için femtomolar hassasiyet elde edildi.
- Etkili karıştırma ve yıkama kapasiteleri kanıtlandı.
- Kırılgan nanoliflerin pratik bir uygulamada kullanılabilirliği gösterildi.
- Hızlı analiz için otomatik işlem doğrulandı.
Sonuçlar
- Nanoliflerin entegrasyonu, tespit hassasiyetini önemli ölçüde artırır.
- Disk-üzerinde-laboratuvar teknolojisi, protein analizleri için gelecek vadeden bir yaklaşım sunmaktadır.
- Bu yöntem, çeşitli tanısal uygulamalara uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu teknoloji, düşük hacimli klinik örneklerde ultrasensitif protein tespitine yönelik kritik ihtiyaca cevap vererek, minimum tam kan girdilerinden erken biyobelirteç keşfini mümkün kılmaktadır. Elektrospun nanoliflerin santrifüj mikroakışkan bir platforma entegre edilmesi sayesinde, 30 dakika içerisinde femtomolar hassasiyet elde edilmekte ve saptama sınırı geleneksel ELISA'ya göre önemli ölçüde iyileştirilmektedir. Bu ilerleme, düşük bolluktaki protein taramalarında yanlış negatifleri azaltarak hedef doğrulamayı ve öncü bileşik tanımlamasını desteklemekte; böylece klinik öncesi risk azaltma ve portföy önceliklendirme kararlarını doğrudan etkilemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tam kanda düşük bolluktaki protein hedeflerinin sorgulanmasına olanak tanıyarak hedef-hastalık ilişkilerine yönelik güveni artırır.
- Operasyonel Değer: Örnek tüketimini 10 µL'ye indirerek, değerli klinik numunelerin birden fazla analizde çoklu olarak kullanılmasına imkan tanır.
- Tahminleyici Değer: Femtomolar tespit sınırı, sinyal-gürültü oranını iyileştirerek keşif iş akışlarında daha güvenilir biyobelirteç nicelleştirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekrarlanabilir sıvı taşıma ve karıştırma ile immünassay geliştirme için standartlaştırılmış, otomatik bir platform sağlar.
- Operasyonel Değer: Manuel pipetleme adımlarını ortadan kaldırarak değişkenliği azaltır ve antikor tarama kampanyaları için işlem kapasitesini artırır.
- Analiz Hazırlığı: Minimum reaktif tüketimi ile multipleks analizi destekleyerek panel tabanlı hedef doğrulamayı kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Farklı örnek türleri ve hacimlerinde tutarlı protein kantifikasyonuna olanak tanıyarak, keşif süreci ile preklinik validasyon arasında köprü kurar.
- Risk Azaltma: Yüksek hassasiyet, hastalık modellerindeki erken farmakokinetik veya farmakodinamik sinyallerin gözden kaçma olasılığını azaltır.
- Preklinik Kullanılabilirlik: Küçük hayvan kan hacimleri ile uyumlu olup, terminal örnekleme gerektirmeksizin boylamsal çalışmaları destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, klinik olarak ilgili matrislerde kantitatif protein tespiti yoluyla hipotez odaklı hedef doğrulamayı destekleyerek, erken keşif sürekliliğiyle uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Tam kanda yolakla ilişkili biyobelirteçlerin tespitini sağlayarak mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır ve hedef güvenini artırır.
- Tarama: Hassas sıvı ölçümü ve yıkama ile tekrarlanabilir hit doğrulaması için temel teşkil eden, otomasyona hazır immünassay performansı sunar.
- Analitik: Altı büyüklük mertebesinde kantitatif kemilüminesans okumalar üreterek, farklı koşullar arasındaki protein ekspresyonunun doğru şekilde karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Minimum düzeyde işlenmiş kanda klinik olarak ilgili proteinleri (örneğin CRP, cTnI) tespit ederek biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Disk üzerindeki laboratuvar (lab-on-a-disc) tasarımı, farklı immünassaylar genelinde platform adaptasyonuna izin vererek reaktif ve iş akışı standartlaştırmasını teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Geliştirilmiş saptama sınırları ve dinamik aralık sayesinde hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tam otomasyon, manuel işlem süresini ve kullanıcı değişkenliğini azaltarak farklı merkezler arasındaki analiz tekrarlanabilirliğini iyileştirir.
- Stratejik Değer: Sınırlı örneklerden elde edilen sağlam biyobelirteç verilerine dayalı "devam/durdur" kararlarına olanak tanıyarak geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Geliştirme sürecinin erken aşamalarında, düşük bolluktaki hedeflerin güvenilir şekilde kantifikasyonunu sağlayarak riske göre ayarlanmış ilerlemeyi destekler.
Uygulama Dikkat Noktaları
- Başarılı bir üretim için elektro ağla dönme, nanolif işlemleri ve mikroakışkan tasarım konularında uzmanlık gereklidir.
- Disk ve nanolif matrası hazırlığı için CNC frezeleme, plazma işlemi ve vakum ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Partiler arasında tutarlı nanolif yapışması sağlamak için PDMS kaplama ve kürleme protokollerinin standardizasyonu gereklidir.
- Alternatif protein hedeflerine adaptasyon, yüzey kimyasının ve inkübasyon koşullarının yeniden optimizasyonunu gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında nanolif transferi sırasında kontrollü çevresel koşullara duyulan ihtiyaç ve lif matrası tekdüzeliğindeki potansiyel değişkenlik yer alır.
