Kolloidal Parçacıkların Öz-Montaj Süreci yoluyla PDMS mikroakışkan Chip Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions oluşturma

Bu protokol, polidimetilsiloksan içinde iki mikrokanal arasında nanoakışkan bir bağlantı oluşturmak için kolloidal silika nanopartiküllerin yeni ve basit bir kendi kendine montaj tekniğini göstermektedir. Katyon seçici bir zar görevi gören yaklaşık 45 nanometre gözenek boyutuna sahip boncuk zarı, DNA ve protein örneklerinin elektrokinetik konsantrasyonu için kullanılabilir. Genel bakış: İlk adımda, nanotraplara sahip PDMS cihazı, çift kalıplama işleminden geçirilir.

Cihazı bir cam alt tabakaya plazma bağladıktan sonra, kendi kendine birleşen kolloidal membranı oluşturmak için yüzey işlevselleştirilmiş silika boncuklar mikro kanallara enjekte edilir. Son olarak, bir kaynak ölçer ve voltaj bölücü kullanılarak membran boyunca bir voltaj uygulanır. İyon tükenmesi ve konsantrasyon artışı, bir CCD kamera ile ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenir.

Silika Kolloidal Parçacık Süspansiyonlarının Hazırlanması: 300 nanometre silika boncuklardan başlayarak; 30 saniye boyunca girdap boncuk stoğu; 600 mikrolitrelik süspansiyonu bir Eppendorf tüpüne çekin ve 2.600g'de bir dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın. % 15'lik bir çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için boncukları 400 mikrolitre bir milimolar sodyum fosfat tamponu ile yeniden askıya alın.

Homojen bir süspansiyona ulaşmak için girdap. 500 nanometre silika boncuklar hazırlamak için aynı adımları tekrarlayın. 500 nanometre karboksilik silika boncuklar için, 15 mililitrelik bir Falcon tüpünde 100 miligram ağırlığındadır.

Daha sonra boncukları yeniden süspanse etmek için 9.8 mililitre bir molar sodyum klorür aktarın. Tüpü kuvvetlice girdaplayın. Alttan etkilenen boncukları yerinden çıkarmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.

Boncuklar üzerindeki yüzey yükünü değiştirmek için iki polielektrolit hazırlıyoruz: PAH ve PSS. % 0.9 PSS, 180 miligram PSS'nin 200 mililitre, bir molar sodyum klorür ile çözülmesiyle hazırlanır. % 0.4 PAH, 300 mikrolitre stok çözeltisinin 15 mililitre bir molar sodyum klorüre deltilmesiyle hazırlanır.

Tamamen çözündüklerinden emin olmak için her iki çözümü de girdaplayın. Pozitif yüklü bir PAH tabakası biriktirmek için, boncuk süspansiyonuna 200 mikrolitre PAH çözeltisi ekleyin. Bir dakika boyunca girdap yapın ve süspansiyonu oda sıcaklığında bir saat boyunca bir döndürücüde inkübe edin.

Bağlanmamış PAH'ı yıkamak için, boncukları çökeltmek için süspansiyonu 1.801g'de bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Boncukları bozmak için tüpe bir ila iki mililitre su pipetleyin.

Kalan sekiz mililitre suyu ekleyin ve ardından girdap yapın. Yıkama işlemini dört kez daha tekrarlayın. Beşinci yıkama ve santrifüjden sonra, süpernatanı atın ve boncukları 9.8 mililitre bir molar sodyum klorür ile geri yükleyin.

Negatif yüklü PSS katmanını boşaltmak için, boncuk süspansiyonuna 200 mikrolitre PSS çözeltisi ekleyin. Bir dakika boyunca vorteksleyin ve süspansiyonu döndürücüde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Boncukları, PAH kaplaması için yapıldığı gibi DI su ile beş kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, süpernatanı atın ve boncukları 650 mikrolitre bir milimolar sodyum fosfat tamponu ile %0.05 Tween 20 ile yeniden süspanse edin. Damak süspansiyonunu bir eppendorf tüpüne aktarın. 500 nanometre amin silika boncuklarının hazırlanması için, negatif yüklü tek bir PSS katmanını biriktirmek için aynı prosedürü tekrarlayın.

PDMS Mikroakışkan Çipin İmalatı: Silikon master'ı imal etmek için, önce bir silikon gofret üzerinde 4.000 RPM'de bir mikrometre inceliğinde bir fotorezist sıkın. Ardından, boncuklar için nanotuzaklar olarak 700 nanometre derinliğinde ve iki mikrometre genişliğinde düzlemsel nanokanallar oluşturmak için projeksiyon litografisi ve reaktif iyon aşındırma kullanın. Daha sonra 2. fotorezist katmanını 2.000 RPM'de döndürün ve önceden desenlenmiş nanotuzaklara bir hizalama yapın.

Temas litografisi ve silikonun derin reaktif iyon aşındırması yoluyla mikrokanalları ekleyin. Serbest bırakma katmanını oluşturmak için, silikon master'ı gece boyunca 50 mikrolitre triklorosilan içeren bir vakum kavanozunda silanate edin. PDMS kalıbını dökmek için, PDMS tabanını 10:1 oranında sertleştirici ile karıştırın.

Karışımı silikon master'ın üzerine dökün. Hava kabarcıklarını gidermek için master'ı PDMS'li bir vakum kavanozuna yerleştirin ve PDMS'yi çapraz bağlamak için 70 ° C'de fırında pişirin. İki saat pişirdikten sonra, PDMS levhasını silikon ustasından dikkatlice çıkarın.

Boş bir silikon gofrete kalıcı bir bağ oluşturmak için yüzeye plazma uygulayın. Aşağıdaki PDMS döküm adımı için bir bölme çizgisini işaretlemek üzere kenar boyunca bant takın. Bir kalıp ayırıcı tabaka oluşturmak için, PDMS kalıbını gece boyunca bir vakumlu kavanozda silanatın.

PDMS'yi PDMS kalıbının üzerine dökün ve gazdan arındırmak için bir vakum kavanozuna aktarın. Sonra fırında pişirin. Kürlenmiş PDMS levhasını, bantla işaretlenmiş bölme çizgisi boyunca PDMS kalıbından soyun.

Cihazları dikkatlice kesin ve rezervuarlarda 1,5 milimetre biyopsi zımbası ile delikler açın. Bant ve IPA ile yüzey temizliğinden sonra, PDMS cihazını 25 milimetreye 75 milimetrelik bir mikroskop cam lam üzerine plazma yapıştırır. Plazma bağlamadan hemen sonra, 10 mikrolitre süspansiyonu boncuk dağıtım kanallarının dördüncü ve altıncı girişlerine enjekte edin.

Boncuk dağıtım kanallarını doldurduktan sonra, boncuk dağıtım kanallarının birinci ve dokuzuncu çıkışları dışındaki tüm rezervuarları kapatın. Cihazı oda sıcaklığında üç saat havayla kurutun ve kullanmadan önce dört ° C'de saklayın. Cihazın mikrografları, kolloidal parçacıkların üst ve alt boncuk dağıtım kanallarının içinde toplandığını göstermektedir.

SEM görüntüsü, numune ile tampon kanalı arasında nanotrap dizileri ile hapsolmuş, kendi kendine monte edilmiş 300 nanometre silika kolloidal parçacıkları gösterir. Tampon kanallarının üçüncü ve yedinci girişlerini 10 mikrolitre bir milimolar sodyum fosfat tamponu ile doldurun. Numune kanalı giriş beşini 10 mikrolitre 10 nanomolar DNA numunesi ile doldurun.

Kanalları hava kabarcığı olmayan solüsyonlarla doldurmak için tüm çıkışlara ters çevrilmiş bir pipet ucuyla hafif bir negatif basınç uygulayın. Basıncı beş dakika stabilize etmek için ikinci ve sekizinci rezervuarlara 10 mikrolitre sodyum fosfat tamponu ve rezervuar 10'a 10 mikrolitre DNA örneği ekleyin. DNA'nın Elektrokinetik Konsantrasyonu Deneyi: Mikroakışkan çipi bir kaynak ölçere bağlı bir voltaj bölücü ile bağlayın.

PT kablolarını üç, yedi, beş ve 10 numaralı rezervuarlara yerleştirin. Nanoakışkan bir bağlantı boyunca voltaj uygulayın. Önce beşinci ve 10 numaralı rezervuarlara 30 volt uygulayın ve üçüncü ve yedinci rezervuarlara topraklayın.

Yaklaşık 25 saniye sonra rezervuar 10'daki voltajı 30 volta düşürün. Elektrokinetik Ön Konsantrasyon Sonuçları: Mikroakışkan kanal, başlangıç konsantrasyonu 10 nanomolar'da olan DNA ile doldurulur. Hızlandırılmış mikrograflar, nanoakışkan kolloidal bağlantılar olmak üzere bir iyon tükenme bölgesinin oluşumunu gösterir.

İyon tükenme bölgesi 10 saniye içinde başlatıldı. Tampon kanalları topraklanırken, numune kanalına voltaj uygulandığında konsantre bir DNA tıkacı üretildi. Kanal duvarlarını vurgulamak için noktalı çizgiler kullanılmıştır.

300 nanometre kolloidal membran kullanılarak 15 dakika içinde yaklaşık 1.700 katlık bir konsantrasyon faktörü elde edilir. DNA'nın ortalama floresan yoğunluğu, nano gözenekli bir membrailde zamanın bir fonksiyonu olarak artmaktadır. Noktalı çizgiler, 10 nanomolar, 17-mikromolar, iki mikromolar ve 10-mikromolar DNA için sinyal seviyesini temsil eder.

Konsantre tapa, 300 nanometre silika boncukların nano gözenekli zarında üretilir; 500 nanometre silika boncuklar; tek bir PSS tabakası ile kaplanmış 500 nanometre silika amin boncukları; ve iki kat PAH ve PSS ile kaplanmış 500 nanometre silika karboksil boncuklar. Sonuçlar: Tahmini gözenek boyutu 45 nanometre olan kendinden montajlı kolloidal silika membranı kullanarak, nanoakışkan bağlantının yakınında iyon konsantrasyonu polarizasyonunu gösterdik ve bir DNA örneğini 15 dakika içinde 1700 kez konsantre ettik. Silikon bazlı nanokanallarla karşılaştırıldığında, kendinden montajlı kolloidal membranın en büyük avantajı, yüzey işlevselleştirmesinin tamamen kapalı mikroakışkan cihazın dışında, ayrı bir şişede gerçekleştirilme olasılığıdır.

Bu yaklaşımın, 10 ila 100 nanometre aralığında iyonik ve moleküler taşımayı incelemek için boncuk boyutunu, iyonik kuvveti veya tampon çözeltisinin pH değerini kontrol ederek, kolayca ayarlanabilir gözenek boyutlarına sahip bir mikro nanoakışkan platformu hızlı bir şekilde üretme olasılığını açtığına inanıyoruz.