Name: Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Öğrenin, HSV ile enfekte HeLa hücrelerinde Staphylococcus aureus ve Candida albicans gibi oportünist patojenlerin yapışmasını değerlendirmek için biyofilm başlatma belirleme yöntemini. Bu teknik, mikrobiyal etkileşimleri niceliksel olarak incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje Midwestern Üniversitesi, IL Araştırma ve Sponsorlu Programlar Ofisi (ORSP) ve Midwestern Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi-Illinois (CDMI) tarafından desteklenmiştir.

1. HSV Suşlar ve Taşıma Not: Rekombinan olmayan yayılan HSV-1 (KOS) gL86 ve HSV-2 (KOS) 333gJ - V. Twiari 36,37 tarafından sağlanan kullanılan beta-galaktosidaz raportör etkinliği ile. <ol><li> 1 -80 ° C de, tek bir parça ve deposundan virüs kullanabilir: Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş Eagle ortamı,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile (DMEM) 1 oranında ve kullanılana kadar yağsız süt. Viral çok depolama önce, O-nitrofenil-β-D-galactopyranoside (ONPG) ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galactopyranoside (X-Gal) deneyi virüs konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> Daha önce (Şekil 1) 14 tarif edildiği gibi, raportör virüs giriş deneyi kullanılarak her bir deney tahlili çalıştırmak için X-Gal boyaması ile virüs canlılığı ve enfeksiyon (MOI) bir çokluğunu belirlemek. </li><li> İstenen İçişleri Bakanlığı virüs (Opt-MEM) seyreltin. tek tabakalar (paraformaldehit; 0.5 ml / oyuk) saptamak lekelenme. Ayrı bir microti virüs canlılığı kontrolleri yerleştirinpolimikrobiyal tahlil plakaları paralel olarak ter plakası. </li></ol> 2. HeLa 299 Hücre İşleme <ol><li> 4.5 g / L glikoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), gentamisin (50 ug / ml) ve L-glutamin ile DMEM içinde 37 ° C,% 5 CO2 de büyür. Tripsin çözeltisi ile% 80 izdiham Geçiş hücreleri (% 0.05 tripsin, etilendiamintetraasetik asit, 0.53 M EDTA, 5 ml / şişe). </li></ol> 3. C. albicans Taşıma Not: C Klinik laboratuar bir kaynaktan elde edilen albicans orta 2x yağsız süt REMMEL -80 ° C&#39;de saklanır. <ol><li> Kültür Sabouraud Dekstroz Orta (37 ° C) üzerine stok donmuş. 24 saat altkültür C sonra Fungisel ortamı üzerine albicans (37 ° C, 48 saat) kullanım için. </li><li> Mikrop tüpünü (GT) formları oluşturun (3 ml FBS, temsili koloniler almak 3 saat, 37 ° C, Abs 600, 0.3). inkübasyondan sonra, GT yıkama (HBSS; 2x, 4000 xg). (37 ısıtıldı HBSS ile yıkandı, GT ekleme# 176; C; 0.32 Abs 600). GT formları hemositometre sayımı ile tespit edildiği üzere gözlenen hücre% 99 olmalıdır. </li><li> Temsili Fungisel koloniler seçerek maya formu (YF) stok süspansiyonları olun (HBSS, 3 ml 0.32 Abs 600). YF formlarının sayısını / mikroskopik hemasitometre kullanarak ml. YF formları hemositometre sayımı ile tespit edildiği üzere gözlenen hücre% 99 olmalıdır. </li><li> Mantar stok çalışma yapmak (25 ml HBSS GT veya YF stokunun 250 ul; 37 ° C; 10 5 CFU / ml) </li></ol> 4. S. aureus Taşıma <ol><li> Mağaza S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel süt 2x yağsız). koyun kanlı agara Kültürü (% 5; 37 ° C; 24 saat). temsili koloniler seçin ve hisse senedi için 2 gün içinde orta tuzları mannitol transfer (37 ° C, 18 saat). </li><li> S. olun aureus stok süspansiyonu (3 mi HBSS; 1.32 Abs 600, 10 8 CFU / mL) <ol><li> S. çalışma yapmak aureus stok (100 ul25 ml HBSS stoklar; 10 5 CFU / ml). </li></ol></li></ol> 5. Candida ve S. aureus Süspansiyonlar <ol><li> Karışık C olun albicans ve S. aureus süspansiyon (250 ul YF veya GT stok ve 25 ml HBSS 100 ul S. aureus stok). </li></ol> 6. polimikrobik Biyofilm Deneyi <ol><li> 2 x 10 5 HeLa hücre / ml 200 ul (% 85 birleşen seviyesi) Tohum 96 oyuklu plakalar. Kaya plakaları (30-45 dakika; 37 ° C), inkübasyondan önce (37 ° C,% 5 CO2 kuluçka, 18 saat). Yıkama mono tabakaları (1x; Opt-MEM) daha sonra HSV ile tohum (HSV-1 (KOS) gL86 veya HSV-2 (KOS) 33 GJ - 100 ul Opt-MEM; MOI 50 ve 10). Inkübe edin (37 ° C, 3 saat,% 5 CO2). günde sadece bir virüs suşu kullanın. </li><li> Enfekte tek tabakaları yıkayın (1 x fosfat tamponlu tuzlu su, Mg + 2 ve Ca + 2 ile (PBS); 100 ul). 25 &amp; # bırakarak sıcak HBSS ile PBS değiştirin181; her bir L. <ol><li> YF, GT ve / veya S. ekle (hücre oranı = 5 hedef 100 ul: 1, n = 16), S. aureus çalışma süspansiyonlar. Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi inkübe edin (statik; 30 dakika; 37 ° C,% 5 CO2). </li></ol></li><li> İnkübasyondan sonra, her seferinde aspire bir sütun hemen Mg + 2 ve Ca + 2 ile 300 ul PBS ile yeniden doldurmak. (1:50 seyreltme 200 ul;, filtre sterilize RIPA) radyo-immünopresipitasyon tahlil lizis tamponu eklemek sonra da iki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Hızla HeLa hücre lisatı daha sonra manitol tuzları (MS) ve / veya Fungisel (F) ortam (Şekil 2) üzerine 50 ul koyun Karışım. 90 ° açıyla cam çubuk bükülmüş kullanarak lizat yayıldı. (37 ° C&#39;de 18 saat) inkübe edin. El ile plaka başına koloni sayısını saymak. Kontroller S. oluşur aureus ve / veya C HSV-bulaşmamış HeLa hücrelerinde albicans bağlılık. </li></ol> 7. Görüntüleme Çalışmaları &lt;/ P&gt; <ol><li> Her yuvarlak cam lamel yıkayın (12 mm; 50 ml aseton ml beher 100). Kuru ve sterilize lamelleri (Kimwipes, cam petri). Alkol alev sterilize forseps ile steril bir 24 yuvalı plakalara ait kuyucuklar içerisine, kuru steril lamelleri yerleştirin. </li><li> yıkandı, steril yuvarlak cam lamelleri içeren 24 gözlü plakalara, HeLa hücreleri (96 gözlü levhalar için kullanılan 5x hacmi 1 mi) eklenir. Adımda yukarıda belirtilen 6.4 6.2.1&#39;de tarif edildiği gibi inkübe ve işlem, 5X 96 gözlü levhalar için kullanılan ses şablonun (Tablo 2) &#39;e uygun bir virüs, bakteri ya da mantarları ekleyin. </li><li> Son yıkamadan sonra, metanol ile slayt sel ve buharlaşmasına izin vererek mikroskopi için hücreleri düzeltin. boyanma kadar oda sıcaklığında plakaları saklayın. </li><li> Aydınlık alan mikroskobu (1,000x nihai orijinal büyütme) için deiyonize su ile metanol-sabit lamelleri içeren kuyu doldurun. Hemen su aspire. Grams kristal viyole ile her lamel örtün. Yıkama olmayan bağlı leke (deiyonize su) ücretsiz lamelleri. In situ Kuru lamelleri sonra etiketli slayt montaj orta sert seti (Şekil 3) ile yapışır. </li><li> floresan mikroskobu (100x objektif; 1,000x son orijinal büyütme), adım 7.4 açıklandığı gibi yıkama esas metanol ücretsiz lamelleri. kuyularda lamelleri kurulayın. <ol><li> Kuruduktan sonra, kapak fişleri kaldırmak ve etiketli slaytlar üzerine koyun. (- 5 ul 1) Daha sonra floresan izotiyosiyanat (FITC) ile birleştirilmiş bayır Herpes Simplex virüs tip 1:20 seyreltme lamel kapsayacak şekilde 1 + 2 gD antikoru yeterli miktarda ilave edin. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir nem odasında slaytlar inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS 4 değişiklikler lamelleri yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, etiketli slayt lamel dönün. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (, nem odası; 30 dakika için 37 ° C DAPI) ile leke. İnkübasyondan sonra 4 Chan lamelleri yıkamaPBS ges, daha sonra sabit set montaj orta ile etiketlenmiş slayt yapıştırın. </li><li> montaj orta karanlıkta oda sıcaklığında 24 saat boyunca tedavi etmek için izin verin. parlak bir alan mikroskobu veya FITC ve DAPI kesme filtreleri ile floresan mikroskop ya petrol hedefi altında lamelleri inceleyin. Eş-lokalizasyonu (Şekil 4) için en az 50 alanlar (organizma başına en az 100 hücre) fotoğraflarını inceleyin. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Şu anda hiçbir bilgi, prokaryot ökaryot ve viral yani çoklu taksonomik etki, çapraz konak mikrobiyomları yarı daimi üyelerinin kalıcı arasındaki karmaşık etkileşimlerin mevcuttur. Bu nedenle S. biyofilm başlamasını incelemek için in vitro model sisteminde bir roman geliştirdi aureus ve C. HSV-1 veya HSV-2 albicans HeLa 229 (HeLa) hücreler 38 etkilemiştir. HeLa hücre model sistem benzersiz bir avantaj sunuyor. Bu, her iki S için bir reseptör görevi...

<html> İnsan mikrobiyomları vücudunda coğrafi bölgeleri paylaşan birden taksonomik krallıklardan farklı organizmaların içerir. hücre yüzeylerine yapışma mikrobiyomları kolonizasyon sürecinin bir parçasıdır biyofilm, önemli bir ilk adımdır. mikrobiyomları dahil kronik ve inatçı enfeksiyonlara neden virüsler olabilir. Bu virüslerin kronik hücre enfeksiyon, farazi reseptörü durumunu bir değişikliğe neden olabilir. Ek olarak 1,2, hücre içi patojenler ile hücre girişi da sırayla bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere, diğer mikrobiyomları üyelerinin eki değiştirebilir ana membran akışkanlığını / hidrofobiklik etkileyebilecek . İnsan konağın aynı coğrafi bölgelerde lokalize co bu çoklu patojen arasında oluşabilir etkileşimleri anlamak için, biz mukozal yüzeyinde mevcut taksonomik krallıkların spektrumunu temsil patojenlerin etkileşimini incelemek gerekir. t &quot;&gt; Herpesviridae mikrobiyomu daimi üyeleri olarak insanlarda% 100 mevcut mikropların ailesidir 3,4. Buna ek olarak aynı zamanda sürekli semptomlarının varlığı ve yokluğunda hem döken edilebilir. Spesifik olarak, herpes simplex virüs-1 ve herpes simplex virüs-2 (HSV-1 ve HSV-2 sırasıyla) oronasopharynx ve genital bölgesindeki mikrobiyomu daimi üyeleridir. bağışıklık yetkin kişiler, her iki HSV-1 ve HSV-2 neden gingivostomatit yanısıra genital herpes 5-8. bu bölgelerde, HSV kronik kalıcı nectins, heparan sülfat, lipid sallar ve herpes virüs giriş arabulucu yüzey ifadesinde değişiklikler hücreler sonuçlara HSV 9. entry dökülme viral asemptomatik / tümör nekrozu ile karakterize bir gizli enfeksiyona neden faktör reseptörü (HVEM / TNFR) 10-25. bazı bakteriler ve mantarlar, örneğin, S. aureus ve C. albicans Bu potansiyel olarak ortak temsil alıcıları, fırsatçı patojenler ise,Ayrıca oronasopharynx 26,27 mukozal mikrobiyomları üyeleri olarak bulunabilir. Oronasopharynx S. içinde aureus ve C. albicans kolonizasyon iki ayrı siteler işgal. Doğal diş ana olarak, oral mukoza, HSV-1 ve C tarafından paylaşılır albicans, anterior nazal nares S. tarafından işgal edilirken aureus 28. Ancak, rağmen, in vitro bulgular S. aureus ağız epitel hücrelerine yapışır, 29,30 S. Normal doku 29,30 mevcut olduğunda aureus seyrek Oral örneklerden izole edilir. Küçük klinik bulguların ötesinde genital yol ko-kolonizasyon niş ile ilgili bilinen S. aureus C iken, genital iltihap, akıntı ve disparoni ile karakterize, aerobik vajinit ile ilişkilidir albicans ağız boşluğu 31-35 gözlenene benzer bir mukozal lezyonlar. Böylece, ağız ve genital microbi bu üyelerin her ne kadaronların etkileşimine ilişkin bilinen küçük ome çapraz taksonomik krallıklar konak hücre yüzeyinde 5 bağlılık yoluyla biyofilm oluşumunu başlatmak için bu etkileri kendi yeteneği gibi. Bu protokol etkin bir ko-kolonizasyon / enfeksiyon fonksiyonel sonuçlarını belirlemek amacıyla uygulanmıştır.

<table><tbody><tr><td>C.albicans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dekstroz</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>S.aureus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Tuz Agar</td><td>Truva Biyolojileri</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Koyun kanı agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Hela hücreleri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco'nun Modifiye Eagle Medium, 4.5 g / L glikoz ve L-glutamin ile, sodyum piruvat içermez</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin 50 mg / ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 ve mikro; tam DMEM Tripsin EDTA'da g / ml nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>(% 0.05 Tripsin, 0.53 M EDTA) Çözelti 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Tam DMEM'de% 10 nihai konsantrasyon</td></tr> < <tr><td>güçlü > Diğer ortam ve reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Saf X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi)</td> <td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>89901</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Boyama< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1 ve 2, gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Kristal Menekşe</td><td>Troy Biyolojikleri</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Petri kabı 100 x 15</td><td>Nokta Bilimsel</td><td>229693 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu plakalar</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Kültür tüpleri 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Kapak kayma daireleri, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde biyofilm başlatma belirlenmesi

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

mantarlar, bakteriler ve virüs içeren taksonomik krallıklar arasında polimikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi önceden mikrobiyomları viral üyeleri bu virüs bulaşmış konak hücreleri ile sonraki mikrop etkileşimleri nasıl etkilediği ile ilgili incelenmiş değildir. bakteri ve mantarlar ile virüs birlikte yaşama ağız boşluğu ve genital mukoza yüzeyleri üzerinde esas olarak mevcuttur. Mukozal hücrelerin, kalıcı kronik veya kalıcı geç viral enfeksiyonları, özellikle de ifade edilen reseptör, önemli sayıda virüs değiştirilerek mikrobiyomu üyeleri üzerindeki etkisini ve türü olabilir. Ev sahibi hücre membranı mimarisinde Modifikasyon biyofilm, yani yapışma ilk adımı başlatmak için normal flora ve fırsatçı patojenlerin daha sonraki üye değiştirilmiş yeteneğine neden olur. Bu çalışma, biofil başlatılmasından HSV etkisinin ölçülmesi ve görsel inceleme için bir yöntem tarif ederS. m formasyonu (yapışma) aureus ve C. albicans.

Bu raporda tarif edilen sistem elde edilebilen veri sağlamlık düzeyi Şekil 2, af 38 &#39;de gösterilmiştir. Bu sistemin kullanılmasıyla viral yönden enfekte hücreleri ve birbirlerinin yapışma üzerindeki etkisi ile stafilokok ve mantar etkileşimin modülasyonuna tarif edilebilir. Polimikrobiyal etkileşimi, aynı hücreler üzerinde oluşup oluşmadığını tespit etmek için, Şekil 3 ve 4 38 &#39;de gösterildiği gibi bu tür ça...

Burada, virüs bulaşmış HeLa hücre tek katmanlarına yapışma için Krallıklar arası ilişki ve rekabetin (bakteri ve mantar) belirlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, prokaryotlar, ökaryotlar ve virüslerin çoklu kombinasyonlarına genişletilebilir.

Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Bu deneyin genel amacı, HSV ile önceden enfekte edilmiş hücrelerin, Staphylococcus aureus ve Candida albicans gibi bakteriyel ve fungal fırsatçı patojenlerin sonraki tutunma süreçleri üzerindeki etkilerini ölçmektir. Bu yöntem, kronik viral enfeksiyonun konakçı mikrobiyomunun ilgili üyelerinin düzenlenmesinde oynadığı role ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birden fazla organizmanın etkileşiminin, biyofilm oluşumunun başlangıç basamağı olan adhezyon aşamasında incelenebilmesi ve nicelendirilebilmesidir.Asemptomatik dökülme ile seyreden HSV enfeksiyonu ön koşulunun insan popülasyonunun çoğunluğunda mevcut olması nedeniyle, bu tekniğin etkileri kolonize olan fırsatçı patojenlerin kontrolüne kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, HSV'nin sonraki mikrobiyal tutunma üzerindeki kontrolüne dair içgörü sağlayabildiği gibi, CMV enfeksiyonu ve adenovirüs enfeksiyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Başlangıç olarak, bir raporlayıcı virüs giriş deneyi kullanarak her bir deneysel analiz çalışması için x-gal boyaması ile HSV1 veya HSV2 virüs canlılığını ve enfeksiyon çokluğunu (MOI) belirleyin.Virüsü istenen MOI değerine seyreltin ve virüs canlılık kontrollerini, polimikrobiyal analiz plakalarıyla paralel olacak şekilde ayrı bir mikrotitrasyon plağına yerleştirin. Ardından, boyama öncesinde monokatmanları fikse etmek için 100 µL paraformaldehit glutaraldehit tamponu kullanın. HeLa hücrelerini sürdürmek için, hücreleri 4,5 g/L glukoz, %10 ısı ile inaktive edilmiş FBS, 50 µg/L gentamisin ve l-glutamin içeren DMEM içerisinde kültüre edin.Hücreleri %80 konfluense ulaştıklarında pasajlamak için Trypsin çözeltisi kullanın. C.albicans ile çalışmak için, dondurulmuş stokları 37 °C'de dexterous medyumda kültüre edin. 24 saat sonra, C.albicans'ı fungicell medyuma alt kültüre aktarın ve kullanmadan önce 48 saat boyunca inkübe edin.Temsili fungicell kolonilerini seçerek ve bunları üç mililitre FPS içerisinde 37 °C'de üç saat boyunca kültüre ederek C.albicans'ın germ tüpü veya GT formlarını oluşturun. İnkübasyon sonrası, kültürü 4,000 ×g'de on dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, hücreleri iki kez yıkamak için HBSS kullanın.Hücreleri saymak için bir hemositometre kullandıktan sonra, yıkanmış GT'yi OD 600 değeri 0,32 olana kadar 37 °C HBSS'ye ekleyin. Maya formu veya YF stok süspansiyonları hazırlamak için, temsili fungisell kolonileri seçin ve bunları 3 mL HBSS'yi inoküle etmek için kullanın. Kültürleri hemositometre kullanarak OD 600 değeri 0,32 olana kadar büyütün; mililitre başına YF formu sayısını sayın, bu oran mikroskop altında gözlemlenen hücrelerin %99'u olmalıdır.250 µL GT veya YF stokunu 37 °C HBSS'nin 25 mL'sine aktararak çalışır fungal stok hazırlayın. Bu işlem, mililitre başına 10⁵ CFU ile sonuçlanır. SRES ATCC 25923 hazırlamak için, dondurulmuş bir stoğu yüzde 5 koyun kanlı agara ekin ve 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.İki gün içinde temsilci kolonileri seçin, mannitol tuzlu besiyerine aktarın ve 37 °C'de 18 saat boyunca kültüre edin. Bir SRES stok hazırlamak için temsilci kolonileri, 0,132 OD 600 veya 10⁸ CFU/mL değerine ulaşana kadar 3 mL 37 °C HBSS içinde süspande edin. Çalışma stoğu hazırlamak için stok süspansiyondan 100 µL'yi 25 mL HBSS'ye aktarın.Bu durum, mililitre başına 10⁵ CFU ile sonuçlanır. Bu yöntemi diğer organizmalara veya mikrop suşlarına uygularken atılması gereken ilk kritik adım, sayım için yeterli sayıda koloni oluşmasını sağlayacak doğru bakteri ve mantar sayısının belirlenmesidir. Polimikrobiyal bir biyofilm analizi gerçekleştirmek için, 96 kuyucuklu plaklara mililitre başına 2×10¹⁵ HeLa hücreleri içeren 200 µL ekleme yapın.Plakları, 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda 18 saat inkübe etmeden önce, 37 °C'de 30 ila 45 dakika boyunca sallayınız. Monokatmanları yıkamak için 1X optimum kullanınız, ardından tek bir HSV suşu ile ekim yapınız. Her seferinde yalnızca bir suşu test ediniz.Plakaları 37 °C'de, yüzde beş karbondioksit içeren ortamda üç saat boyunca inkübe edin. Enfekte olmuş monokatmanları, magnezyum ve kalsiyum içeren 37 °C'deki 100 µL PBS ile yıkayın. Ardından, PBS'yi 37 °C'deki HBSS ile değiştirin.Her kuyucukta 25 µL HBSS bırakın. Ardından, YF, GT ve/veya SRES çalışma süspansiyonunu ekleyin ve plakları %5 CO₂ içeren 37 °C ortamda 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, plakanın her seferinde bir sütununu aspire edin.Kuyuya hemen 300 µL magnezyum ve kalsiyum içeren PBS ekleyiniz. Bu yıkama adımını iki kez tekrarladıktan sonra, her kuyucuğa 1:50 oranında seyreltilmiş, filtre sterilize edilmiş RIPA liziz tamponuyla 200 µL ekleyiniz. Diğer bakteri veya mantar suşlarıyla çalışırken, kullanılan RIPA konsantrasyonunun hücre lizizi için yeterli olduğundan, ancak mikrobiyal canlılık testi için hala uygun olduğundan emin olunuz.HeLa hücre lizatını hızla tritorat edin ve mannitol tuzları ve/veya fungicell ortamına 50 µL pipetleyin. Ardından, 90 derecelik açıyla bükülmüş bir cam çubuk kullanarak lizatı plaka yüzeyine yayın. Plakaları 18 saat inkübe ettikten sonra, plaka başına koloni sayısını manuel olarak sayın.Kontroller, HSV ile enfekte edilmemiş HeLa hücrelerine yapışan SRES ve/veya C.albicans'tan oluşur. Görüntüleme çalışmalarını gerçekleştirmek için, her bir yuvarlak cam lamelle sterilizasyon öncesinde aseton ile yıkama yapın. Ardından, alkol ve alevle sterilize edilmiş pensler kullanarak, kuru steril lamelleri steril 24 kuyucuklu plakaların kuyucuklarına yerleştirin.Lamellerin bulunduğu plakaların kuyucuklarına HeLa hücrelerini ekleyin. Ardından, hücreleri virüs ile enfekte edin. Enfeksiyondan sonra, şablona uygun olarak bakteri ve mantarları ekleyin; ardından hücreleri, daha önce 96 kuyucuklu plaka için gösterildiği şekilde inkübe edin ve işleyin.Son yıkamadan sonra, lamel üzerine metanol doldurup ardından buharlaşmasını sağlayarak hücreleri mikroskopi için sabitleyin. Aydınlık alan mikroskobisi için, sabitlenmiş lamellerin bulunduğu kuyucukları deiyonize su ile doldurun. Suyu hemen aspire edin ve her bir lameli kaplayacak kadar kristal viyole ekleyin.Kristal viyole ile boyanmış lamelleri deiyonize su ile yıkadıktan sonra, etiketli bir lam üzerine sertleştirici montaj medyumu ile yapıştırmadan önce C2'de kurutun. Floresan mikroskopi için, lamelleri metanolden arındıracak şekilde yıkadıktan sonra, etiketli lamlar üzerine sertleştirici montaj medyumu ile monte etmeden önce kuyucuklarda kurutun. Lameli kaplayacak miktarda, 1/20 oranında seyreltilmiş FITC konjuge HSV1 plus 2GD antikoru ekleyin.Lamları 37 °C'de, nemlendirme kabında 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, lamel şeklinde olan örtü camlarını dört kez PBS ile yıkayın. Son yıkamanın ardından, lamları tekrar nemlendirme kabına yerleştirin.dab B ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası lamları PBS ile dört kez yıkayın. Montaj ortamının oda sıcaklığında, karanlıkta 24 saat boyunca kurumasına izin verin.Ardından, bir parlak alan veya floresan mikroskobunda, yağ daldırma objektif altında kolokalizasyon için en az 50 alan incelenir. HSV'nin Staphylococcus ve/veya Candida albicans yapışması üzerindeki etkisine dair temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. HSV1 varlığı, Staphylococcal hücrelerin HeLa hücrelerine yapışmasını inhibe etmiştir.Candida'nın maya formlarının değil, ancak germ tüpü formlarının varlığının Stafilokok yapışma seviyelerini geri kazandırdığı görülmüştür. HSV2 ile enfekte edilmiş HeLa hücreleri için de benzer sonuçlar ölçülmüştür. Bu şekildete görüldüğü üzere, Candida germ tüpü formlarının yapışma seviyesi, HSV2 enfekte hücreler için HSV1 enfekte hücrelere göre anlamlı derecede daha yüksektir.Candida maya formları üzerinde HSV1'e karşı HSV2'nin ters etkisi ölçülmüştür. Bakteri ve fungus arasındaki etkileşimi görselleştirmek için tek tabakaların kristal viyole boyaması kullanılarak yapışma paternleri belirlenmiştir. Ardından, diğer mikroplarla ilişkili olarak HSV varlığını belirlemek için floresan mikroskopi kullanılmıştır.HSV yokluğunda, Stafilokoklar ile Candida'nın hem maya hem de germ tüpü formları HeLa hücrelerinde kolokalize oldu. Ancak, HSV ile enfekte edilmiş hücrelerde yalnızca Candida gözlemlendi. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde yürütüldüğünde sekiz ila dokuz saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, virüsün hücreye girişinden sonra mevcut olan yüzey reseptörlerinin farklılaşmış ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, diferansiyel floresan antikor boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, insan mikrobiyomu alanındaki araştırmacıların, doku kültürü ve organ kültürü sistemlerinde mikrop sonrası etkileşimleri keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, taksonomik krallıkları kapsayan polimikrobiyal bir etkileşim modelinin nasıl geliştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve yayılmayan virüs suşlarının kullanımı ile bariyer teknikleri gibi önlemlerin gerekli olduğunu unutmayın.

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Kaynak: Tay, S. B. ve diğerleri. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması.  J. Vis. Exp. (2016)Video, patojenik bir bakteride biyofilm biyokütlesini nicelendirme yöntemini gösteriyor; tedavi edilmemiş kontroller ve yeterli güç söndürme enzimiyle işlenmiş örnekler karşılaştırılıyor. Bu enzim, erken kuluçka sırasında bakteriyel sinyalleri bozarak hücre yapışmasını azaltır. Yıkama ve daha fazla kuluçkadan sonra, kontrol kuyuları...

Patojenik Bakterilerde Enzim Kaynaklı Biyofilm Bastırmanın Nicelendirilmesi

Kaynak: Schlafer, S ve Frost Kristensen, M. Konfokal Mikroskopi kullanarak Çapraz Krallık Biyofilmlerinde Hücre Dışı PH'ın İzlenmesi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, Streptococcus mutans ve Candida albicans'ın ağız benzeri koşullarda biyofilmler çapraz yetiştirilişini göstererek bakteriyel-mantar etkileşimlerini modellemekte; böylece mikrobiyal sinerji, glukan aracılı yapışma ve ağızdan patogenezde asidijenik virülans incelenmesini mümkün kılar.

Ağızdan Patogenezi İnceleme İçin Bakteriyel-Mantar Çapraz Biyofilmlerin Oluşturulması

Kaynak: Miquel Guennoc, C. ve diğerleri. Filamentli mantar kolonilerinde bakteriyel biyofilmlerin konfokal ve elektron mikroskopisi kullanılarak niteliksel çok ölçekli analizi için yeni yöntem. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, koloni oluşumunu ve radyal büyümeyi desteklemek için işlenmiş selofan zarlarında mantar kültürünün hazırlanmasını göstermektedir. Daha sonra toprak bakteri hücrelerinin etkileşim testleri için yetiştirilip hazırlanması gösterilir. Son olarak, bakteriyel hücrelerin mantar...

Biyofilm oluşumu için mantar-bakteriyel ortak kültür oluşturmak

Bu video, bakteri ve mantarlar tarafından virüs bulaşmış hücrelerde polimikrobiyal biyofilm oluşumunun başlatılmasını göstermektedir. Herpes simpleks virüsü enfeksiyonu, bakterilerin hücrelere bağlanmasını engelleyerek bakteriyel-fungal ko-lokalizasyonunu önler. Buna karşılık, enfekte olmamış hücreler bakteri-mantar kolokalizasyonu ve biyofilm oluşumunun başlamasını gösterir.

Virüsle Enfekte Hücrelerde Polimikrobiyal Biyofilm Başlangıcını Belirlemek İçin Bir Test

Bu videoda, mikroskopi kullanarak mantar hifleri üzerinde bakteriyel biyofilmleri büyütmek ve kalitatif olarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriyel biyofilmler sıklıkla mantar yüzeylerinde oluşur ve metabolik işbirliği, rekabet veya avlanma gibi çok sayıda bakteri-mantar etkileşim sürecini içerir.

Mantar Hifleri Üzerinde Biyofilm Oluşturan Bakterileri Görselleştirmek için Numune Hazırlama Yöntemi

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Bu iletişim kuralı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu enterik patojenler bağlılık, hücre dışı polimer madde matris oluşumu değerlendirmek tarafından bakteriyel biyofilmler dinamik doğası yakalamak için çok yönlü bir yaklaşım kullanarak analiz okuyucu sağlar, ve dağılım.

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Öğrenin, HSV ile enfekte HeLa hücrelerinde Staphylococcus aureus ve Candida albicans gibi oportünist patojenlerin yapışmasını değerlendirmek için biyofilm başlatma belirleme yöntemini. Bu teknik, mikrobiyal etkileşimleri niceliksel olarak incelemenizi sağlar.

Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet