Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Bu prosedürlerin genel amacı, somatik hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere veya iPSC'ye yeniden programlanmasının ilerlemesini görselleştirmek ve izlemektir. Bu yöntem, yeniden programlama kinetiğinin ve yeniden programlama verimliliklerinin kullanılan somatik dokular, uygulanan yeniden programlama teknolojileri ve bununla birlikte kullanılan matris ve ortam kombinasyonları tarafından nasıl değiştirildiği gibi iPSC alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yöntemin temel avantajı, somatik hücrelerin iPSC'lere geçişlerine bakmak için hücre yüzeyi işaretleyicilerini kullanmasıdır, böylece bu teknolojiyi yeniden programlama olaylarını gerçek zamanlı olarak izleyebilmek için kullanabilirsiniz.

Transdüksiyondan sonraki yedinci günde, fibroblastları kuyucuk başına iki mililitre DPBS ile yıkayın ve 37 santigrat derecede üç ila beş dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa 0.5 mililitre 37 santigrat derece% 05 EDTA ekleyin. Hücreler yuvarlaklaştığında, oyuk başına iki mililitre 37 santigrat derece fibroblast ortamı ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri yerinden çıkarmak için ortamı her bir oyuğun dibine hafifçe pipetleyin. Fibroblastları her bir kuyucuktan ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve santrifüjleme ile toplayın.

Peletleri iki mililitre taze 37 santigrat derece fibroblast ortamında yeniden süspanse edin ve her kültür koşulundan hücreleri sayın. Daha sonra, altı oyuklu bir doku kültürü plakasında önceden hazırlanmış besleyiciden bağımsız şartlandırılmış kuyucuklara bir kez 10 ila beşinci hücreler tohumlayın ve dönüştürülen hücreleri gece boyunca hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ertesi gün, her bir oyuktaki ortamı hücre uygulaması için uygun ortamla değiştirin.

Ardından plakayı görüntüleyiciye yerleştirin ve yazılımı, sonraki 14 gün boyunca her altı ila sekiz saatte bir, her kuyu için sürekli tam kuyu faz kontrastı ve flüoresan görüntüleri yakalayacak şekilde ayarlayın. Yeniden programlama deneyinin sonunda, kuyuları iki mililitre 37 santigrat derece DMEM / F12 ortamı ile bir kez yıkayın. Yıkamayı atın ve hücreleri, inkübatörde 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca taze DMEM / F12 ortamında uygun birincil antikorların oyuğu başına bir mililitre ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri 37 santigrat derece DMEM / F12 ortamı ile iki kez yıkayın. Daha sonra yıkamayı atın ve hücreleri 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca 37 santigrat derece DMEM / F12 ortamında bir mililitre uygun ikincil antikorlarla etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri DMEM / F12 ortamı ile iki kez daha yıkayın.

Daha sonra her bir kuyucuktaki yıkamayı iki mililitre taze 37 santigrat derece DMEM / F12 ortamı ile değiştirin. Çanağı görüntüleyiciye yerleştirin ve görüntüleme yazılımını açın. Görüntüleme sistemi yazılımında taramaları ayarlamak için, önce kullanılacak tepsinin konumunu seçin ve taranacak çanak türünü seçin.

Ardından, Tüm Kuyu Görüntüleme'yi, istenen kuyuları taramak için deseni ve ilgilenilen yüzey işaretleyicilerinin gerçek zamanlı olarak tanımlanması için uygun floresan kanallarını seçin. Ardından, taranacak deneyi etiketleyin ve her gün taranacak örnekler için zaman noktalarını ve aralıkları ayarlayın. Taranan bir deneme kümesini analiz etmek için, ilgilendiğiniz denemeyi seçin ve Yeni Analiz İşi Başlat'ı seçin.

Ardından, görüntüleme için kullanılan kanallara göre analiz türü için uygun işleme tanımını seçin, örneğin, PSC Faz Koloni Sayısı. Analiz işini adlandırın. Ve analiz için zaman aralığını ve analiz edilecek kuyuları seçin.

Ardından analiz işini başlatın. İstenen yeniden programlama zaman noktalarını tek tek kuyulardan ölçmek için, ilgilenilen kuyuyu bir kez iki mililitre DPBS ile yıkayın. Ardından yıkamayı bir mililitre önceden ısıtılmış 37 santigrat derece %05 tripsin-EDTA çözeltisi ile değiştirin.

Beş dakikalık 37 santigrat dereceden sonra, hücreleri tek hücreli bir süspansiyona ayırmak ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için tripsini kuyucuğun dibine doğru yıkayın. Üç mililitre DPBS kullanarak, kalan hücrelerden herhangi birini kuyudan yıkayın ve 15 mililitrelik tüpe çekin. Hücrelere 10 mililitre daha DPBS ekleyin ve santrifüjleme ile döndürün.

Saymak için peleti bir mililitre DMEM / F12 ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu mililitre konsantrasyonu başına altı hücrenin onda birine kadar seyreltin ve uygun sayıda numune için tüp başına bir mililitre hücre alikotlayın. Daha sonra, hücreleri ilgilenilen birincil antikorlarla bir mililitre DMEM / F12 ortamında oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika karıştırarak etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri 37 santigrat derece DMEM / F12 ortamında iki kez yıkayın. Peletleri bir mililitre DPBS'de yeniden süspanse edin ve numuneleri ayrı FACS tüplerine aktarın. Yeniden programlanmış plakaların akış sitometri profillerini edinin.

Ardından FCS dosyalarını bir bilgisayara aktarın ve dosyaları uygun analiz yazılımına aktarın. İlk kontrol dosyasını ileri doğru dağılım grafiğinde açın ve y eksenini logaritmik bir ölçeğe ayarlayın. Ardından canlı popülasyonun etrafında çokgen bir kapı oluşturun.

Ardından, canlı hücrelerle dağılım yüksekliği grafiğine göre bir yan dağılım alanı oluşturun ve çiftleri dışlamak için dikdörtgen bir kapı ayarlayın. Daha sonra, ilgili kadranlarındaki ilgilenilen popülasyonları belirlemek için uygun floresan kanalları altında deneysel örnek dosyalarını analiz etmek için bu kapıları kullanın. BJ fibroblastlarının Sendai yeniden programlama virüsleri ile yeniden programlanması, DF1 fibroblastlarının yeniden programlanmasından farklı bir oranda SSEA4 + CD44 hücreleri üretir, bu da pluripotent kök hücre benzeri SSEA4 + CD44 hücrelerinin yüzdesinin erken bir karşılaştırmasının yeniden programlama ilerlemesini izlemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bir akış sitometrisi zaman seyrinde, CD24-CD44 + ve EpCAM negatif CD44 + fibroblastlar, daha sonra sırasıyla CD24 + CD44 ve EpCAM pozitif CD44 pluripotent kök hücre benzeri hücrelere geçiş yapan çift negatif popülasyonlar oluşturur ve yeniden programlama ilerlemesini daha da özetler. Yeniden tohumlamadan sonra yeniden programlama kültürlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi, birleşimlerinde logaritmik bir artışa karşılık gelen ve yeniden programlamanın tamamlanmasında nihai pluripotent pozitif ve fibroblast negatif belirteç ekspresyonunu gösteren kademeli bir koloni oluşumunu gösterir. Ayrıca, bir raportör genin kullanılması, birleşmenin, toplam birleşmeye kıyasla gözlemlenen GFP birleşmesinin daha kademeli bir artışı ile faz kontrastı altında ölçülmesine izin verir.

Gerçekten de, bu temsili deneyde, 19. gündeki GFP birleşmesi, tam yeniden programlamaya karşılık gelen toplam birleşmenin yarısından daha azdı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, yeniden programlama olayları hakkındaki bilgileri aydınlatmak ve insan fibroblast yeniden programlamasının kinetiğini izlemek için kullanılabilir. Bu teknik aynı zamanda farklı başlangıç somatik hücre dokularına, kullanılan yeniden programlama teknolojilerine ve yeniden programlama olaylarını aydınlatmak için orta matris kombinasyonlarına bakmak için de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan fibroblastlarının iPSC'lere yeniden programlanmasını izleyebilmek için gerçek zamanlı izleme ve hücre yüzeyi işaretleyici ifadesinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.