Name: Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin somatik hücrelerin iPSC'lere yeniden programlanmasını akış sitometrisi ve gerçek zamanlı görüntüleme ile izleme yöntemini. Bu protokol kök hücre biyolojisindeki kinetik değişimleri anlamak için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar yararlı tartışmalar için Çad MacArthur teşekkür ederiz.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+a+negative+cell+surface+marker+for+pluripotent+stem+cell+identification+during+human+fibroblast+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming.</a> PLoS One. 9, e85419(2014).</li>
<li>Papp, B., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency%3A+stepwise+resetting+of+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape.</a> Cell Res. 21, 486-501 (2011).</li>
<li>Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+marker+mediated+purification+of+iPS+cell+intermediates+from+a+reprogrammable+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model.</a> J Vis Exp. , e51728(2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
</ol>

yazarlar [RHQ, JSTA, KS, ve UL] Tüm bu makalede kullanılan reaktifler ve araçların bazı üreten Thermo Fisher Scientific, çalışanlarıdır.

Bu çalışma, akış sitometrisi ve gerçek zamanlı görüntüleme tabanlı analiz kullanarak yeniden programlama sürecinin izlenmesi ve izlenmesi için stratejiler sunmaktadır. Protokoldeki kritik adımlar, yeniden programlamanın başlatılması, işaretleyici ifadesine dayalı olarak yeniden programlama ilerlemesinin ölçülmesi ve yeniden programlamanın gerçek zamanlı izlenmesidir. Tercih edilen herhangi bir yeniden programlama yöntemi kullanılabilir, ancak burada insan fibroblastlarının Sendai tabanlı yeniden programlanmasına odaklanı...

Hasta türetilmiş uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) hücre terapisi ve ilaç taraması için gelecek vaat eden araçlar. Onlar tedavisi için hücrelerin bir otolog kaynak sağlar. Buna ek olarak, mevcut embriyonik kök hücre (ESC) hatları sağlayacak ötesinde genetik hastalıkların detaylı in vitro analizi sağlayan genetik arka çok geniş bir dizi kapsar. Son gelişmeler, Sendai virüsü, epizomal plasmidleri ya da mRNA&#39;lar 1,2 ile yeniden programlama içeren iPSCs üretilmesi için çeşitli yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Özellikle, farklı yeniden programlama yöntemleri verimlilik ve güvenlik çeşitli düzeylerde ilişkili ve çeşitli uygulamalar için kendi uygunluğunu etkileyen diğer yollarla farklılık muhtemel olan. yeniden programlama teknolojilerinin çeşitli kullanılabilirliği ile, yeniden programlama sürecini değerlendirmek için yöntemler geliştirmek önemli hale gelmiştir. Çoğu mevcut yöntemler morfoloji veya boyama nitel inceleme güveniyorkök hücre spesifik boyalar ve antikorlar ile. Bir son zamanlarda geliştirilen bir yöntem PSC özgü miRNA&#39;lar veya farklı hücreye özel mRNA 3 duyarlı lentiviral floresans muhabir kullanır. Böyle izleme yöntemleri seçimi ve farklı durumlar için yeniden programlama tekniklerinin optimizasyonu kolaylaştırmak. Örneğin, CDy1 yeniden programlama modülatörleri 4 taranması için erken iPSCs bir floresan sonda olarak kullanılmıştır. gözlemlemek ve farklı yeniden programlama deneyler karşılaştırmak için yeteneği de sürecin kendisi daha iyi bir anlayış kazanıyor için kritik öneme sahiptir. Örneğin, şimdi bazı somatik hücre tipleri diğerlerine 5&#39;ten yeniden programlamak kolay olduğu bilinmektedir ve hücreler 6-8 yeniden programlama sırasında ara devletler geçmesi. Ne yazık ki, yeniden programlama sürecini altında yatan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve dolayısıyla yeniden programlama yöntemleri arasında kesin farklar da d beklemektedirefined. Böylece, izleme yöntemleri, değerlendirilmesi ve yeniden programlama olayları karşılaştıran kök hücre alanı için kritik olmaya devam ediyor. Bu protokol açıklanan yöntemler izlenmesi izin ve yeniden programlama sürecinin değerlendirilmesi ve bu tekniklerin yeniden programlama reaktiflerin farklı ayarlar karşılaştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. İlk yaklaşım akım sitometri içeren pozitif ve negatif pluripotent kök hücre (PSC) belirteçleri karşı antikorların kombinasyonları kullanılarak analiz eder. İkinci yaklaşım çiftler gerçek zamanlı görüntüleme ve toplam izdiham (hücreler kapsadığı yüzde yüzey alanı) ve işaretleyici sinyalleri (floresan sinyalleri kapsadığı yüzde yüzey alanı) izdiham ölçümü.

<table><tbody><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAXSupplement, piruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, embriyonik kök hücre nitelikli, ABD menşeili</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.05), fenol kırmızısı&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fare (ICR) İnaktive Edilmiş Embriyonik Fibroblastlar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Bağlanma Faktörü Proteini (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değişimi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-Merkaptoetanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip IV, toz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzim (1x), fenol kırmızısı yok&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-İçermeyen, hESC Nitelikli, Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Matrisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Orta</td><td>Boy Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Temel (AA 1-155) Rekombinant İnsan Proteini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Albümin Fraksiyonu V (% 7.5 çözelti)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Çözelti Y-27632</td><td>EMD Kırlangıç</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai Yeniden Programlama Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Yeniden Programlama</td><td>Kiti Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC İnsan Sünnet Derisi Fibroblastları, Yenidoğan</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Yetişkin İnsan Dermal Fibroblast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG Hücreleri Varyant hESC hOct4-GFP Raportör Hücreleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antikor, Alexa Fluor 647 konjuge (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antikoru, Alexa Fluor 488 konjugatı (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antikoru (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antikoru (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Sıçan Anti-İnsan/Fare mAb (klon IM7), PE-Cy5 eşlenik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor Canlı Hücre Görüntüleme için 488 Eşlenik Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Sıçan Anti-İnsan/Fare mAb (Klon IM7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (artık mevcut değil)</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 594 konjuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin Fosfataz Canlı Leke</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Canlı Hücre Görüntüleme için Eşlenik Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 Fare Anti-İnsan mAb (klon SN3), FITC konjugatı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>beta-2 Mikroglobulin Antikoru, FITC konjugatı (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326 Antikor, FITC konjugatı (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E Antikoru (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Kırmızı Alkalin Fosfataz (AP) Substrat Kiti</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 mikroskobu&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Veri Analiz Yazılımı</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Akustik Odaklama Sitometresi, Mavi/Kırmızı Lazer</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Kullanım Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ Hücre Sıralayıcı (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Hücre Süzgeç Kapaklı Tüp</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, yüksek netlikte, kubbe contalı vidalı kapak</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Şişe</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175 Şişe</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 kuyulu çanak</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 Haddeleme İnkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Yapışmaz, RNaz İçermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1,5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer Numune Mikseri</td><td></td><td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

somatik yeniden programlanması kinetik Ölçümü ve gerçek zamanlı görselleştirme

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatik yeniden programlama, yetişkin hücrelerin çeşitli genetik geçmişlerden ve hastalık fenotiplerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC) dönüşümünü sağlamıştır. Son gelişmeler, yeniden programlama faktörlerinin tanıtılması için daha verimli ve güvenli yöntemler belirlemiştir. Ancak, yeniden programlamanın ilerlemesini izlemek ve izlemek için birkaç araç vardır. İzleme, yeniden programlama için mevcut yöntemler, morfolojinin kalitatif incelemesine veya kök hücreye özgü boyalar ve antikorlarla boyamaya dayanır. iPSC üretiminin ilerlemesini incelemek için araçlar, çeşitli hücre kaynaklarından farklı koşullar altında sürecin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir. 
Bu çalışma, görüntüleme yoluyla gerçek zamanlı izlemenin yanı sıra akış sitometrisi kullanılarak yeniden programlama ilerlemesinin kinetik ölçümü için temel yaklaşımlar sunmaktadır. Yeniden programlamanın kinetiğini ölçmek için, pozitif ve negatif pluripotent kök hücre belirteçlerine karşı antikorlar kullanılarak ayrı zaman noktalarında akış analizi yapıldı. Gerçek zamanlı görselleştirme ve akış analizinin kombinasyonu, farklı aşamalarda yeniden programlamanın nicel olarak incelenmesini sağlar ve farklı sistem ve yöntemlerin daha doğru bir şekilde karşılaştırılmasını sağlar. Fibroblastların besleyici içermeyen bir ortam sisteminde yeniden programlandıkları için sürekli izlenmesi için gerçek zamanlı, görüntü tabanlı analiz kullanıldı. Koloni oluşumunun kinetiği, canlı alkalin fosfataz boyası veya SSEA4 veya TRA-1-60'a karşı antikorlarla boyandıktan sonra faz kontrastı veya floresan kanallarındaki birleşmeye dayalı olarak ölçüldü. Sonuçlar, birleşme ölçümünün yeniden programlamanın ilerlemesini izlemek için yarı nicel ölçümler sağladığını gösterdi.

Akım Sitometri kullanarak yeniden programlanması Kinetiği İzleme SSEA4 PSC işaretleyici 6,10 iken CD44 bir fibroblast belirtecidir. Bu ifade modelinden beklendiği gibi, sitometri BJ fibroblast akış bir SSEA4 gösterir - boyanmamış numune ile birlikte kadran kapıları oluşturulmasını kolaylaştırır CD44 + nüfusu. SSEA4 yavaş yavaş ifade edilirken Sendai virüsler ile DF1 fibroblast yeniden ...

Bu çalışmada sunulan protokol analizi akış sitometrisi kullanılarak, pozitif ve negatif pluripotent kök hücresi belirleyicilerinin kinetik ölçümleri ile yeniden programlama ilerlemesi gerçek zamanlı izleme için yöntemler tarif etmektedir. protokol aynı zamanda iPSC oluşturma sırasında morfolojisi ve işaretleyici veya muhabir ifade görüntüleme bazlı değerlendirmesini içerir.

Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Bu prosedürlerin genel amacı, somatik hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC) yeniden programlanma sürecini görselleştirmek ve takip etmektir. Bu yöntem; kullanılan somatik dokuların, uygulanan yeniden programlama teknolojilerinin ve beraberinde kullanılan matriks ve medya kombinasyonlarının, yeniden programlama kinetiğini ve verimliliğini nasıl değiştirdiği gibi iPSC alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yöntemin temel avantajı, somatik hücrelerin iPSC'lere geçişlerini incelemek için hücre yüzey belirteçlerini kullanmasıdır; böylece bu teknoloji sayesinde yeniden programlama olaylarını gerçek zamanlı olarak izleyebilirsiniz.Transdüksiyondan sonraki yedinci günde, fibroblastları kuyuk başına iki mililitre DPBS ile yıkayın ve 37 °C'de üç ila beş dakikalık inkübasyon için her kuyuğa 0,5 mililitre 37 °C 0,5% EDTA ekleyin. Hücreler yuvarlaklaştığında, reaksiyonu kuyuk başına iki mililitre 37 °C fibroblast besiyeri ile durdurun ve hücreleri yerinden çıkarmak için besiyerini her kuyuğun tabanı boyunca nazikçe pipetleyin. Fibroblastları her kuyuktan ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve santrifüj ile toplayın.Peletleri iki mililitre taze 37 °

kinetic-measurement-real-time-visualization-somatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Transkraniyal manyetik stimülasyon, elektromiyografi ve 3D hareket yakalama, insanlarda nöromüsküler fonksiyonu araştırmak için yaygın olarak kullanılan non-invaziv tekniklerdir. Bu yazıda, sanal gerçeklik uyaran sunumu ve geri bildiriminin benzersiz bir şekilde eklenmesiyle birlikte bu araçların üçü tarafından oluşturulan verileri eşzamanlı olarak örnekleyen bir protokolü açıklıyoruz.

Transkraniyal Manyetik Uyarım, Elektromiyografi, Hareket Yakalama ve Sanal Gerçeklik kullanma İnsan Motor Kontrol incelenmesi için çok fonksiyonlu Kur

Sinirsel nüfus tarafından hızlandırılmış video mikroskobu esaslı bilgisayar yazılımı Post-processing takip izlemek için sağlam bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem canlı görüntüleme deneyler sırasında seçili bir popülasyondaki biyolojik olayları tanımlamak için güçlü bir araç temsil eder.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Biz bir roman mevcut davranışsal kombine ve beyin görüntüleme iletişim kuralı manyetik rezonans görüntüleme tarayıcı ortamında bacak içinde ayna tedavisi ile ilişkili sinirsel ilişkilendirir karakterize amacıyla istihdam gerçek zamanlı video projeksiyon Hayalet bacak ağrısı ile amputee hedefler.

Hayalet bacak ağrısı için ayna tedavisi ile ilişkili sinirsel ilişkilendirir karakterizasyonu için bir MRI gerçek zamanlı Video projeksiyon

Bir prosedür protein kinaz görselleştirmek için sunulmuştur baş-sabit, davranan fareler bir aktivite. Gelişmiş A-kinaz aktivite muhabiri, tAKARα, kortikal nöronlar içinde ifade edilir ve kafatası penceresinden görüntüleme için erişilebilir hale gelmiştir. İki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, uygulanan lokomotif sırasında PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanılır.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

İnsan vücudu ve kalp sinyallerini yakın döngüde yayınlayan, parametreleştiren, analiz eden ve değiştiren birlikte uyarlanabilir arayüzler oluşturmak için protokoller ve analiz yöntemleri sunuyoruz. Bu kurulum, biyofiziksel değişimi izlemeye yardımcı olmak için dış duyusal girişlerle kişinin periferik ve merkezi sinir sistemlerinden elde edilen sinyalleri arayüzler.

Yakın Döngü Arabirimi Kullanarak Yeniden Parametrelendirilmiş ÇevreSel Sinyallerin Gerçek Zamanlı Proxy Kontrolü

Bu makalede, 3D insan iskelet kas mikrotleri dizileri ve kas gücü ve kalsiyum elleçleme analizleri de dahil olmak üzere minimal invaziv aşağı akış in situ fonksiyon tahlilleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan İskelet Kas Mikrotissularında İskelet Kas Sağlığının Fonksiyonel Ölçümlerinin Değerlendirilmesi

Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Burada, erişkin ventriküler-subventriküler nörojenik nişteki nöral kök hücrelerin ve/veya bunların bitişik ependimal hücrelerinin uzun vadeli genetik modifikasyonu için lentiviral partiküllerin kullanımına dayanan ve nöral kök hücreler üzerindeki hücre otonom ve otonom olmayan, nişe bağlı etkilerin ayrı ayrı analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Burada senescent her ikisi de algılamak için detaylı bir protokol ve pluripotent kök hücre iskelet kas üzerine vivo içinde yeniden programlama inducing sırasında yaralanma mevcut. Bu yöntem doku yeniden oluşturma işlemi sırasında hücresel yaşlanma rolünün değerlendirilmesi ve in vivoyeniden programlama için uygundur.

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Öğrenin somatik hücrelerin iPSC'lere yeniden programlanmasını akış sitometrisi ve gerçek zamanlı görüntüleme ile izleme yöntemini. Bu protokol kök hücre biyolojisindeki kinetik değişimleri anlamak için güvenilir bir araç sunar.

Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Daha fazla video keşfet