Name: RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile İn Vitro RNA pull-down (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Keşfedin RNA bağlama proteinlerinin tespiti için optimize edilmiş in vitro RNA pull-down yöntemini. Kahverengi adiposit lizatlarından HuR proteinini izole ederek RNA-protein etkileşimlerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Singapur NRF bursu (NRF-2011NRF-NRFF001-025) yanı sıra CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) tarafından finanse edildi.

NOT: Bu çalışma kapsamında ilgi RNA AR 3&#39;UTR&#39;sinden bir parçasıdır. Biotin-etiketli RNA hazırlanması 1. <ol><li> RNA elde edilmesi için, bir ticari kit kullanılarak ve imalatçının talimatları 11, aşağıdaki in vitro transkripsiyon ve ardından, PCR ile, T7-ar-oligo, yükseltmek. Not: PCR primerleri, Tablo 4&#39;te listelenmiştir: T7-AR-F ve T7-AR-R. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma kontrol için, in vitro transkripsiyon ve ardından psiCHECK-2 plasmidinden PCR ile ateşböceği lusiferaz (FL) DNA, bir kısmi sekansını yükseltmek. Not: PCR primerleri, Tablo 4&#39;te listelenmiştir: hluc (+) - T7-prob F hluc (+) - sonda-R, Tablo 4 PCR amplifikasyonu için şablon ve primer dizileri... </li><li> 50 | il PCR reaksiyonu için 50 ng DNA (oligo veya plazmit), 4 ul dNTP (her bir dNTP 2.5 mM), 5 ul 10x reaksiyon tamponu, 1 ul 2.5 U / ve karışım #181 L DNA polimeraz, 2 ul 10 uM ileri primer, 2 ul 10 uM ters primeri ve nükleaz içermeyen su. <ol><li> Aşağıdaki programı kullanılarak, bir termal döngü PCR amplifikasyonu çalıştırın. Adım 1: 2 dakika süreyle 95 ° C&#39;lik bir döngü; Adım 2: 30 saniye 95 ° C 35 döngü, 30 saniye için 55 ° C ve 30 sn (AR) ya da 60 saniye (FL) 72 ° C; Adım 3: 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;lik bir döngü. </li></ol></li><li> Imalatçının talimatlarına 11 uygulanarak, bir in vitro kopyalama kiti kullanılarak biyotinile edilmiş RNA&#39;ları sentez. Bu deneyde, RNA sentezi için şablon olarak PCR ürünleri kullanır. 20 ul in vitro transkripsiyon reaksiyonu için, 200 ng PCR ile çoğaltılan DNA, her bir NTP 2 ul, 1 ul 10 mM biyotin-CTP 2 ul 10x reaksiyon tamponu ve 2 ul T7 RNA polimeraz karışımı. 4 saat 37 ° C&#39;de inkübe karışımı. </li><li> 37 &amp; # de in vitro olarak transkripsiyonu, 1 ul 2 U / ml DNaz ile muamele reaksiyon karışımının aşağıdakı176 C 15 dk şablon DNA aşağılamak için. Son olarak, daha fazla saflaştınlmadan 60 ul bir toplam hacme biyo-küçültülmüş RNA seyreltin. </li><li> Imalatçının talimatlarına 12 Aşağıdaki saflaştırma sütunu kullanarak tuzlarını ve nükleotidleri gidermek için biyotinile edilmiş RNA&#39;ları saflaştınlır. daha sonra açılır deneyleri için -80 ° C&#39;de RNA konsantrasyonu ve mağaza ölçün. </li><li> 2 dakika, 2 dakika boyunca buzda 90 ° C&#39;de RNA-protein etkileşimi, ısı 50 ul biyotinile edilmiş RNA (50 pM) daki RNA için uygun sekonder yapısını sağlamak için, daha sonra 50 ul 2x RNA yapısı tamponu (Tablo sahip kaynağı 3), ve 30 dakika 13,14 oda sıcaklığında katlama RNA için izin verir. </li></ol> RNA eşlenik boncuklar 2. hazırlanması Not: manyetik boncuklar ve süpernatan ayrılması için manyetik bir stand kullanın. <ol><li> Kısaca vorte orijinal şişede streptavidin kaplı manyetik boncuklar süspanseXING üreticisinin yönergeleri izleyerek. 1.5 ml tüp boncuk yeniden süspansiyon haline getirildi, 150 ul aktarın. 1 dakika boyunca mıknatıs tüp yerleştirin. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun. Not: RNA açılan deneylerinde orijinal şişeden yeniden süspansiyon haline boncuk aliquoting olduğunda, MS, ardından bir deneyde Western blotting ile ve ardından bir deneyde 50 ul boncuk ve 200 ul boncuk kullanır. </li><li> Yeniden süspansiyon üreticinin tavsiye 1x W ve B için 1 ml boncuk pelet (bağlanma ve yıkama) tampon maddesi (Tablo 3) bir kez boncuk yıkayın, bir rotatör içine oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tüpün döndürülmesi takip etmektedir. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun. </li><li> 400 ul tampon A Tampon A ile topuk kısmı pelet yeniden süspansiyon haline getirilerek, her boncuk ilgili RNAaz ari inaktive iki boncuk yıkamak için 0.1 M NaOH ve 0.05 M NaCl (Tablo 3) ihtiva eden bir alkali bir çözümdür. rotator oda sıcaklığında 2 dakika boyunca bir tüp döndürün. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun. </li> &lt;li&gt; rotator oda sıcaklığında 2 dakika için tüpün döndürülmesi ve ardından yeniden süspansiyon 400 ul tampon B ile boncuk pelet (Tablo 3) ile iki kez, boncuk yıkama boncuklardan her NaOH kaldırın. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun. </li><li> 300 ul 2x W &amp; B tamponu ile süspanse boncuk pelet, split boncuk eşit ve üç 1.5 ml tüpler (tüp başına 100 ul boncuklar) içine aktarın. 100 ul RNaz ücretsiz su ile boncuk içeren tüpler kaynağı 100 ul FL RNA ve sırasıyla AR 3&#39;UTR RNA biyotinile 100 ul biyotinile. </li><li> dönüşü ile, oda sıcaklığında 1 saat boyunca, her boncuk karışımı inkübe edin. 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. tüm süpernatant atın. boncuk pelet tutun. </li><li> 400 ul 1 x W &amp; B tamponu ile her kordon pelet yeniden süspansiyon haline getirilerek, iki kez her seferinde boncuk yıkayın, bir rotatör içine oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tüpler döner eklenmiştir. </li><li> 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. tüm süpernatant atın. her kordon Pelle yeniden süspanse50 ul çekirdek yalıtım tamponu (Tablo 3) T. </li></ol> 3. Preadibosit İzolasyon ve adipogenesis İndüksiyon <ol><li> Önceki yayınlarda 5&#39;te tarif edildiği gibi, interskapular kahverengi yağ pedi Preadipositler (C57BL6 vahşi tip fare, 3 haftalık) keser. </li><li> Büyümek ve in vitro preadipositlerden 5 ayırt. Hücreler 4-5 gün farklılaşma başlandıktan sonra aşağı uygulama için hazır. </li></ol> Birincil adipositlerden Hücresel lizat 4. hazırlanması NOT: Hücre lizatı hazırlık tüm işlemleri emin olun buz üzerinde yapılır ve tüm tamponlar buz üzerinde soğutulmuş edilir. buz üzerinde önceden soğuk Dounce cam homojenizatörler. <ol><li> Büyümek ve 15 cm yemekleri 5 (bakınız bölüm 3.2) &#39;de preadipositlerden ayırt. Her yemeğin bir RNA açılan tahlil için yeterli hücreleri sağlar. günde 4 veya farklılaşması, ıskarta hücre kültür ortamının 5 gün ve yıkama CEbir zamanlar 1x PBS ile LLS. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj ile 50 ml&#39;lik bir tüp içinde hücreleri ve pelet hücreleri toplamak için kazıma, hücreler hasat hücrelere 10-15 mi 1x PBS ekleyin. 1 ml pipet kullanarak süpernatant atın. </li><li> Tekrar süspansiyon hücre 2 ml pelet hipotonik tampon maddesi (Tablo 3), ve 15 dakika süreyle buz üzerinde hücrelerin inkübe. Transferi 15 ml Dounce cam homojenizatör hücreleri ve mekanik buz üzerinde 20 vuruş ile kesme hücreleri. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 3300 x g&#39;de santrifüjleme ile pellet hücre çekirdekleri. ileride kullanılmak üzere buz üzerinde çekirdekleri pelet tutmak (bölüm 4.6). 1.5 ml tüpler süpernatantı aktarın, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de bir son 150 mM konsantrasyonuna ve spin elde etmek üzere süpernatana 3M KCI ekleyin. </li><li> santrifüj sonrasında, dikkatli 1 ml pipet kullanarak üst lipidlayeron kaldırmak ve sitoplazmik hücresel lizat olarak supernatant toplamak. </li><li> çekirdek pelletini 1 ml nükleer izolasyon tamponunda (bakınız bölüm 4.4). Transfer 1 ml pipet kullanarak 15 ml Dounce cam homojenizatör çekirdekler ve mekanik 100 vuruş ile buz üzerinde kayma çekirdekler. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj ile nükleer yıkıntıları pelet haline ve nükleer hücre lizatı olarak supernatant toplamak. </li><li> Ya nükleer ve sitoplazmik hücresel lizatları birleştirmek, ya da aşağı açılan uygulama için, ayrı ayrı fraksiyonu kullanın. Bu tanıtım deneyde, hücre lizatı, bu iki fraksiyon 1 bir hacim oranında birleştirildi: 1 arasındadır. </li><li> 0.5 U / ul son konsantrasyon elde etmek için, bu bölünmemiş hücre lizatı RNaz önleyici. Batı lekeleme için 15 giriş kontrol olarak hücre lizatının bir kenara 100 ul ayarlayın. </li></ol> 5. Bağlayıcı ve RBP elüsyonu <ol><li> Bölünmüş hücre, üç eşit kısma lisatı (1.5 ml bir tüp içinde 1 ml hücre lisatı) ve boş bir kuluçkalanması, FL RNA konjüge ve AR 3&#39;UTR RNA eşlenik boncuklar 4 ° &#39;de 3 saat boyunca, sırası ile, (bakınız bölüm 2.8) Cdönüşü ile. </li><li> 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. RNA bütünselliği onaylamak için süpernatanından RNA izolasyonu, ardından 1 ml pipet kullanılarak süpernatan toplamak. Üreticinin talimatlarına (Tablo 2), aşağıdaki bir asit guanidinyum tiosianat-fenol solüsyonu kullanılarak RNA izole edin. ribozomal RNA 28S ve 18S alt birimleri analiz ederek RNA Bozulmamışlık değerlendirin. buz üzerinde boncuk pelet tutun. </li><li> rotator oda sıcaklığında 2 dakika için tüpler döner ve ardından 40 U RNaz inhibitör ve% 0.25 IGEPAL içeren 1 mi, nükleer yalıtım tamponu her kordon topağın tekrar askıda bırakılmasıyla manyetik boncuk altı kez, her seferinde yıkayın. manyetik boncuklar ve süpernatan ayrılması için manyetik bir stand kullanın. tüm süpernatant atın. buz üzerinde boncuk pelet tutun. </li><li> Western blotting için boncuklardan RNA-protein kompleksleri elüte etmek için aşağıdaki adımları kullanın. İlk olarak, 75 ul nükleer izolasyon tamponunda her boncuk pelet; Daha sonra, 25 ul 4x western blot yükleme buf eklemekfer (SDS içeren) 100 ul toplam hacim elde edilmiştir. Son olarak, 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de, bu 100 ul çözelti içinde boncuk kaynatın. NOT: adımları MS için boncuk RNA-protein kompleksleri Zehir için aşağıdaki. Adım 1: 100 ul elüsyon tamponu (Tablo 3), her topuk kısmı pelet; Adım 2: rotasyon ile oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle boncuk örnekleri inkübe; Adım 3: santrifüjden sonra protein ihtiva eden süpernatan toplamak; Adım 4: MS için sunulmadan önce 20-30 ul protein çözümleri konsantre. </li><li> Santrifüj, her 100, 4 ° C&#39;de 30 saniye boyunca 12,000 x g&#39;de boncuk örnek ul ve supernatant toplanır. western blot analizi (Bölüm 6.1 ve 6.2) için Kısım 15 ul süpernatant. gece boyunca, (1000 sulandırma 1) ile seyreltildi Hur fare monoklonal antikoru ile elde edilen membran kontrol edin. </li></ol> RBP doğrulanması için 6. Western Blot <ol><li> standart teknikler kullanılarak, SDS-PAGE ile ayrı RBPS. </li><li> biz Davranışkıç ilgi RNA ile ilişkili RBPS için sondalama tarafından standart teknikler kullanılarak kurutma. NOT: Bu demo deneyde, Hür fare monoklonal antikoru Hur proteininin İmmuno için kullanılmıştır. </li><li> seyreltilmiş Hür antikor ile sonuçlanan membran inkübe: a / h yağsız süt, 1x TBS% 5 (1 1,000 seyreltme), % 0.1 Tween - 20 4 at Gecede, nazik sallayarak ° C. 1x TBST ile membran üç kez yıkayın. 1 saat süre ile oda sıcaklığında (anti-fare IgG-HRP işaretli keçi) ikincil antikor ile membran inkübe edin. Yıkama membran. Geliştirmek ve kayıt sinyali. </li></ol>

<ol><li>Huot, M. É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973(2013).</li>
<li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li>
<li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HADHB%2C+HuR%2C+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li>
<li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+binding+of+HuR+and+poly%28C%29-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3%C2%B4+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li>
<li>König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-RNA+interactions%3A+new+genomic+technologies+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li>
<li>Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein-lncRNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203(2014).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li>
<li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

lncRNAs ve RBPS ancak bu moleküllerin moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır, hastalık ve sağlıkta önemli roller üstlenir. lncRNA molekülleri ile etkileşime proteinlerin tanımlanması düzenleyici mekanizmaların tanıtılması yolunda önemli bir adımdır. RNA açılan deney sistemi ile RBPS zenginleştirilmesi, bir hücre lizatından proteinler seçici streptavidin manyetik taneleri bağlanmış biyo-küçültülmüş RNA yemler kullanılarak elde edilebilir, böylece kompleks etkileşim içinde çözeltisi yakalama dayanır. Böyle cıvı...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPS hücrelerde, tek veya çift sarmallı RNA bağlanan ve RNA-protein komplekslerinin oluşturulması katılmak proteinlerdir. RBPS mRNA ve uzun kodlamayan RNA&#39;lar (lncRNAs) de dahil olmak üzere RNA türlerinin, çeşitli bağlamak, ve post-transkripsiyonel seviyede nüfuzlarını olabilir. Hem RBPS ve lncRNAs adipoz geliştirme gibi yeni regülatörleri ortaya çıkan ve 1,2,3 işlev görmektedir. özel bir RNA molekülü ve bir ya da daha RBPS arasındaki etkileşimi saptamak için çoğu zaman gerekli olan, RBP- mekanizmasını ve hücresel yolların lncRNA-aracılı düzenlenmesinin anlamak için, ve bazen de bir RNA protein ortakları tam spektrum tespit etmek transkript. Ancak, deneme nedeniyle adipositlerdeki lipidlerin içeriği yüksek zor olabilir. Burada tarif edilen RNA açılan protokolü primer kültürlerinde 4,5 arasında adiposit lisatlanndan özel bir RNA protein ortakları almak için de kullanılabilir. Bu proto Gerekçesişöyle col özetlenmiştir. Bir RNA yem, bir DNA şablonu in vivo transkribe olan, biyotin-etiketli streptavidin kaplı manyetik boncuklar 4 ve konjuge. RNA, yem, daha sonra, bir manyetik stand aşağı çekilir RNA-protein kompleksleri oluşumuna olanak sağlamak için hücresel lizatları ile inkübe edilir. Daha spesifik olarak, RNA açılan protokolü aşağıda açıklanan HÜR proteini, birincil kültür theadipocytelysate gelen mRNA 6,7 3&#39;UTR&#39;sinden bağlı bir evrensel ifade RBP almak için yem olarak AR 3&#39;UTR&#39;sinden bir RNA parçası kullanın. Bu deneyde bağlanma spesifitesini test etmek için, uygun olmayan bir RNAas da boş streptavidin boncuk kontrol olarak dahil edilir. Bu protokol belirli RBP yakalama teyit etmek veya çekilen RBPS sırasıyla 8 tam repertuarını tespit etmek western blotting ya da kütle spektrofotometresi (MS) ile uyumludur. Çeşitli teknikler RNA-protein etkileşimi incelemek için kullanılabilirs. Belirli bir RBP, RIP (RNA immünopresipitasyon) ve CLIP (UV çapraz ve immünopresipitasyon) bağlı RNA&#39;lar ortaya çıkarmak için uygulanabilir. Buna karşılık, belirli bir RNA protein ortakları belirlemek için, RNA açılır, cıvıltı (RNA saflaştırma ile kromatin izolasyon), ABC (RNA hedeflerinin yakalanması hibridizasyon analizi) ve RAP (RNA antisens arıtma) uygulanabilir. Daha sonra olanlar ile karşılaştırıldığında, RNA açılan teknik kurmak için daha az çaba gerektirir. In vitro ve in vivo proteinler yakalamak için kullanılabilir. Onun in vitro meslektaşı daha teknik olarak daha zor RNA pull, in vivo yaklaşım hücrelerinde çapraz bağlama RNA-protein etkileşimleri korur, hücrelerin ilgi aptamer-etiketli RNA&#39;lar yakalar ve daha sonra bağlı RBPS algılar. RNA açılan düşük bol RBPS ettirecek ve izole edilmesi ve hücresel düzenleme 9,10 kontrol farklı fonksiyonel rolleri var RNA-protein kompleksleri tespit etmek için kullanılabilir </s&gt; Yukarı.

<table><tbody><tr><td>Bu çalışmada kullanılan başlıca malzemeler.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&nbsp; Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway döndürme sütunları&nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) fare monoklonal antikoru (sc-5261)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG-HRP (sc-2005) &nbsp;</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Moleküler Biyoloji Sınıfı Su (nükleaz içermez);</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin (1 kez; PBS)</td><td>&nbsp; HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz inhibitörü ve nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polimeraz&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&nbsp; Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Bu çalışmada kullanılan başlıca ekipmanlar.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R santrifüj&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R santrifüj ve nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 termal döngüleyici ve nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO döndürücü Multi Bio RS-24&nbsp;</td><td>BOECO, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein jel elektroforezi ve lekeleme aparatı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 mıknatıs ve nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn vitro</emadiposit kültür&gt; rna pull-down

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) adipoz gelişiminde ve fonksiyonunda bir düzenleyici bir tabaka olarak ortaya çıkmaktadır. RBPS, hedef mRNA stabilitesi ve dönüşüm etkinliğini etkileyerek transkripsiyon sonrası seviyelerde gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. RNA açılan tekniği yaygın mekanizmasının RBPS &#39;hem de uzun kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar&#39; (lncRNAs) işlevini yatan aydınlatmak için gerekli olan RNA-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır. Ancak, adipositlerde yüksek lipid bolluk bu deneyi yapan bir teknik sorun teşkil etmektedir. İşte detaylı RNA açılan protokol birincil adiposit kültürü için optimize edilmiştir. androjen reseptörün (AR) 3 &#39;çevrilmemiş bölge adiposit lystate gelen, onun RBP ortağı Hür proteini almak nasıl göstermek için bir örnek olarak kullanılan bir adenilat-üridilat zengin elementwas içeren (3&#39;UTR) bir RNA fragmanı. Burada tarif edilen yöntem ile etkileşimini tespit etmek için uygulanabilirRBPS ve kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, hem de arasındaki RBPS ve kodlama RNA.

Bu tanıtım deneyde, AR RNA fragmanı kendi bağlanma proteini Hur yakalamak için yem olarak kullanılmıştır. Hem Hur proteinine ilgili olmayan bir FL RNA yem ve konjüge edilmemiş boş streptavidin boncuk bir alikosu negatif kontrol olarak görev yapmıştır. RNA-protein etkileşimleri çekirdek veya sitoplazmada ya da oluşabilir ve bu açılan protokolü total veya parçalanmış (nükleer ve sitoplazmik) hücre lizatlarında, ya da uygulanabilir. Western blotting ile proteinlerin analizi 15 ul bölünmemiş...

Bir RNA açılan protokolü RNA bağlayıcı proteinlere (RBPS) ve kodlama yapmayan ve kodlama RNA arasındaki etkileşimin saptanması için optimize edilmiştir. androjen reseptörü (AR) için bir RNA fragmanı primer kahverengi adipositlerin lystate onun RBP almak için nasıl kullanılacağını göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır.

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Bu deneyin genel amacı, kahverengi yağ dokusundaki bir RNA transkriptinin RNA-bağlayıcı proteinlerini geri kazanmaktır. Bu yöntem, uzun ömürlü kodlayan RNA'ların düzenleyici mekanizmaları ve ilişkili RNA proteinleri nelerdir gibi bu alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu taktiğin temel avantajı, uygulanmasının kolay olmasıdır.Bu prosedürü göstermek için kullanılan RNA, bundan sonra AR 3-Prime UTR olarak anılacak olan Antijen Reseptörü 3-Prime Çevirilemeyen Bölge'nin bir fragmanıdır. İşleme, T7 AR oligonun ve psiCHECK-2 plazmidinden elde edilen ateş böceği lusiferaz DNA'sının kısmi dizisinin amplifikasyonu ile başlayın. Kullanılan primerler ve parametreler ekli belgede detaylandırılmıştır.Amplifikasyonun ardından, üretici talimatlarını izleyerek bir in vitro transkripsiyon kiti kullanarak biotinillenmiş RNA'lar sentezlemek için PCR ürünlerini kalıp olarak kullanın. Ardından, karışımı 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. In vitro transkripsiyon işleminden sonra, kalıp DNA'yı degrade etmek için reaksiyona 1 µL Dnase ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.Ardından, toplam hacmi su ile 60 µL'ye tamamlayın. Tuzu ve birleşmemiş nükleotidleri uzaklaştırmak için

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Desthiobiotin bir adenin-zengini eleman (vardır) motifi içeren bir sentetik 25-nükleotit RNA oligo, etiketleme sitozolik vardır-bağlayıcı proteinin belirli bağlantı verir.

Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Bu yöntemle, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBPs) bağlayıcı benzeşimini, bakteriyel hücrelerde basit, canlı ve muhabir bir tahlil kullanarak bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelere göre ölçeceğiz. Tahlil bir muhabir geni baskının dayanmaktadır.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.

Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Keşfedin RNA bağlama proteinlerinin tespiti için optimize edilmiş in vitro RNA pull-down yöntemini. Kahverengi adiposit lizatlarından HuR proteinini izole ederek RNA-protein etkileşimlerini inceleyin.

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile

Daha fazla video keşfet