RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile İn Vitro RNA pull-down

Bu deneyin genel amacı, kahverengi yağ dokusundan bir RNA transkriptinin RNA bağlayıcı proteinlerini elde etmektir. Bu yöntem, uzun ömürlü kodlama RNA'sının ve ilişkili RNA proteinlerinin düzenleyici mekanizmaları nelerdir gibi bu alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu taktiğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin kolay olmasıdır.

Bu prosedürü göstermek için kullanılan RNA, Antijen Reseptörü 3-Prime Translasyonsuz Bölgenin bir parçasıdır ve bundan sonra AR 3-Prime UTR olarak anılacaktır. PsiCHECK-2 plazmidinden T7 AR oligosunu ve ateşböceği lusiferaz DNA'sının kısmi dizisini amplifiye ederek başlayın. Kullanılan astarlar ve parametreler ekteki belgede detaylandırılmıştır.

Amplifikasyonun ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek bir in vitro transkripsiyon kiti kullanarak biyotinile RNA'ları sentezlemek için PCR ürünlerini şablon olarak kullanın. Ardından, karışımı 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. İn vitro transkripsiyondan sonra, reaksiyona bir mikrolitre Dnase ekleyin ve şablon DNA'yı parçalamak için 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Ardından, toplam hacmi su ile 60 mikrolitreye getirin. Tuzu ve dahil edilmemiş nükleotidleri çıkarmak için biyotinile edilmiş RNA'ları saflaştırma kolonlarına uygulayın. Ardından, RNA konsantrasyonunu ölçtükten sonra, sonraki aşağı çekme testleri için RNaz'ı eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Tahlil gününde, donmuş biyotinile RNA'yı buz üzerinde çözdürün. Daha sonra, ilgilenilen RNA'nın uygun ikincil yapıya sahip olduğundan emin olmak için, 50 mikrolitresini iki dakika boyunca 90 santigrat derecede ısıtın. İki dakika buz üzerinde soğutun.

Ardından, 50 mikrolitre 2X RNA yapı tamponu ekleyin ve RNA'nın oda sıcaklığında 30 dakika katlanmasına izin verin. Daha sonra, streptavidin kaplı manyetik boncukları kısa bir süre girdaplayarak orijinal şişelerinde yeniden süspanse edin. Ardından, yeniden asılı boncukların 150 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Manyetik boncukları ve süpernatanı ayırmak için tüpü bir dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Süpernatanı çıkarmak ve atmak için bir pipet kullanın. Boncuk peletini saklayın.

Boncuk peletini üreticinin önerdiği 1X bağlama ve yıkama tamponunun bir mililitresinde yeniden süspanse ederek boncukları bir kez yıkayın ve ardından tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir döndürücüye yerleştirin. Tampon A ile yıkayın ve tampon B'yi iki kez yıkayın. Kuluçkadan sonra, süpernatanı atın ve boncuk peletini saklayın.

Ardından, boncuk peletini 300 mikrolitre 2X yıkama ve bağlama tamponunda yeniden süspanse edin. Boncukları, tüp başına 100 mikrolitre boncuk olacak şekilde üç adet 1,5 mililitrelik tüpe eşit olarak bölün. 100 mikrolitre RNaz içermeyen su, 100 mikrolitre biyotinile ateşböceği lusiferaz RNA ve 100 mikrolitre biyotinile AR 3-Prime UTR RNA ekleyin.

Her boncuk karışımını oda sıcaklığında bir saat boyunca rotasyonla inkübe edin. Ardından, tüpleri bir dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve atın.

Boncuk peletlerini saklayın. Daha sonra, boncukları iki kez yıkayın, her seferinde boncuk peletlerini 400 mikrolitre 1X yıkama ve bağlama tamponu ile yeniden süspanse edin ve ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürücüye yerleştirin. Tüpleri bir dakika boyunca bir mıknatısın üzerine yerleştirin.

Ardından, tüm süpernatanı çıkarın ve atın. Her boncuk peletini 50 mikrolitre nükleer izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Protokolün bir sonraki bölümüne hazırlanırken, tüm tamponların ve dounce cam homojenizatörlerin buz üzerinde soğutulduğundan emin olun.

Hücre lizat hazırlığı buz üzerinde devam etmelidir. Gerçekleştirilecek her RNA pull-down testi için, üç haftalık C57 Black Six vahşi tip farelerden 15 santimetrelik bir farklılaşmış preadiposit tabağı hazırlayın. Dört ila beş gün sonra, hücreleri hasat etmek için 10 ila 15 mililitre PBF ekleyin ve ardından hücreleri tabaktan çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Bunları 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin. Döndürmeden sonra, süpernatanı aspire etmek ve atmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Daha sonra, hücre peletini iki mililitre hipotonik tampon içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri on beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Hücreleri 15 mililitrelik bir cam homojenizatöre aktarın ve hücreleri 20 vuruşla buz üzerinde mekanik olarak kesin. Hücre çekirdeğini dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 3300 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin. Döndürme işleminden sonra, süpernatanı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve peleti daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutun.

Süpernatana, 150 milimolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 3 molar potasyum klorür ekleyin. Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20.000 kez G'de döndürün. Santrifüjlemeyi takiben, üstte bir lipit tabakası olacaktır.

Dikkatlice çıkarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından, sitoplazmik hücresel lizat süpernatantını toplayın. Daha sonra, bir mililitrelik bir pipet kullanarak, çekirdek peletini bir mililitre nükleer izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve 15 mililitrelik bir cam homojenizatöre aktarın.

Çekirdekleri buz üzerinde 100 vuruşla mekanik olarak kesin. Nükleer döküntüleri, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı nükleer hücresel lizat olarak toplayın.

Bunlar, daha önce toplanan sitoplazmik lizat ile birleştirilebilir veya daha sonraki uygulamalar için ayrı tutulabilir. Burada numuneler bire bir oranında birleştirilir. Mikrolitre başına 0.5 birimlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için fraksiyone edilmemiş hücre lizatına RNaz inhibitörü ekleyin.

Daha sonra, batı lekeleme için bir giriş kontrolü olarak buz üzerinde 100 mikrolitre hücre lizatını bir kenara koyun. Hücre lizatını, her 1.5 mililitrelik tüpte bir mililitre hücre lizatı ile üç eşit alikota bölün ve sırasıyla boş ateşböceği lusiferaz RNA konjuge ve AR 3-Prime UTR konjuge boncuklarla, rotasyonla dört santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri bir dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin.

Süpernatanı toplamak için bir mililitrelik bir pipet kullanın, ardından RNA'yı izole edin ve ekteki belgede açıklandığı gibi RNA'nın sağlamlığını değerlendirin. Boncuk peletlerini buz üzerinde tutun. Manyetik boncukları altı kez yıkayın.

Her seferinde, boncuk peletlerini 40 birim RNase inhibitörü ve yüzde 0.25 igepal içeren bir mililitre nükleer izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpleri oda sıcaklığında iki dakika döndürün. Manyetik boncukları ve süpernatanı ayırmak için tüpleri manyetik bir standa yerleştirin.

Bir dakika sonra, süpernatanı aspire edin ve atın, ardından boncuk peletlerini buzun üzerine yerleştirin. Batı buçlama için boncuklardan RNA protein komplekslerini çıkarmak için, önce her bir boncuk peletini 75 mikrolitre nükleer izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, 25 mikrolitre 4X western blot yükleme tamponu ekleyin.

toplam 100 mikrolitre hacim elde etmek için SDS içeren. Son olarak, boncukları bu 100 mikrolitrelik çözeltide 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Ekteki belgede açıklandığı gibi RBP'nin doğrulanması için batı blotlama yapın.

Bu deneyde, bir antijen reseptörü RNA fragmanı, bağlayıcı proteini HuR'u yakalamak için yem olarak kullanıldı. Hem HuR proteini ile ilgisi olmayan bir ateşböceği lusiferaz RNA yemi hem de konjuge olmayan boş streptavidin boncuklarından oluşan bir alikot negatif kontroller olarak görev yaptı. RNA protein etkileşimleri, çekirdekte veya sitoplazmada meydana gelebilir ve bu aşağı çekme protokolü, toplam veya fraksiyone nükleer veya sitoplazmik hücre lizatlarına uygulanabilir.

Western blotting ile yapılan analiz, monoklonal antikor kullanılarak fraksiyone edilmemiş hücre lizatında veya girdisinde HuR proteinini gösterdi. Antijen reseptörü RNA elüsiyon fraksiyonu da pozitif bir sonuç verdi, bu da RNA aşağı çekme testi için antijen reseptörü RNA konjuge boncukları kullanılarak adiposit lizatında HuR proteininin varlığını gösterdi. Hem ateşböceği lusiferaz RNA elüsyon fraksiyonu hem de boş boncuk örneği negatif sonuçlar verdi, bu da spesifik olmayan etkileşimlerin bu yaklaşım kullanılarak tespit edilemeyeceğini gösterdi.

Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar antijen-reseptör RNA fragmanı ile HuR proteini arasındaki etkileşimin spesifik olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, kahverengi yağ dokusundan bir RNA transkriptinden RNA bağlayıcı proteinleri nasıl alacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu düzgün bir şekilde yapılırsa 24 saat içinde yapılabilir.