Name: Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Keşfedin, bazal membran rijitliğinin prostat kanserinde invaziv hücre davranışını nasıl etkilediğini. Bu yöntem, yaşla ilişkili patolojiler ve metabolik hastalıklarda biyofiziksel tetikleyicileri anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BPH-1 hücreleri için Simon Hayward'a (Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi) ve reolojik ölçümler konusundaki yardımları için Thomas Cox ve Janine Erler'e (Biyoteknoloji Araştırma ve İnovasyon Merkezi, Kopenhag Üniversitesi) teşekkür ederiz. MR-T, Dünya Çapında Kanser Araştırmaları, daha önce Uluslararası Kanser Araştırmaları Derneği (JS'ye 08-0803 Hibe), İngiliz Büyükelçiliği Montevideo ve Agencia Nacional de Investigacion e Innovación (MR-T'ye UK_RH_2015_1_2) tarafından finanse edildi. MC, Prostat Kanseri İngiltere tarafından desteklenmiştir (JS ve GS'ye S14-017 hibesi). KW, Çin Burs Konseyi tarafından finanse edildi. MAM, Suudi Arabistan Kültür Bürosu tarafından finanse edildi.

<ol><li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+assembly+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li>
<li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li>
<li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li>
<li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+structure%2C+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li>
<li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-induced+morphological%2C+biomechanical%2C+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li>
<li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line%3A+BPH-1%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li>
<li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+%28PC-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Urol%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li>
<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
<li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheology%22%5BJournal%5D)">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li>
<li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li>
<li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li>
<li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li>
<li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrason+Imaging%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li>
<li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benign+prostatic+hyperplasia%3A+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , Article ID:329456 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Saf RBM jeller 6 MECS 3D ​​glandüler asinüs üretilmesi için bir protokol I RBM matrise kolajen 4 mg / ml tip eklenmesiyle yapılan bir çalışmada değiştirildi. kollajen eklenmesi 1589 ± 380 Pascal 175 ± 37 artan RBM jel elastik modül ile sonuçlanmıştır. Sertlik Bu 9.1 katlık bir artış MECS 21 büyüme, hayatta kalma, göç ve farklılaşmayı modüle. - (-) - RBM jele ilave edilmiştir tip I kollajenin enzimatik olmayan çapraz bağlanmasını teşvik etmek riboz Protokol D ile muamele aşaması içerecek şekilde tekrar modifiye edildi. Sertlik Elde edilen 15 kat artış onların invaziv davranış 22 teşvik etmek MECS onkojenik dönüşümü ile işbirliği bulunmuştur. Ben RBM jeller kollajenin ekleme Çeşidi deneysel yaklaşım sadece stroma arasındaki fiziksel bariyer sonra insan dokusunda meydana kolajen lifleri ile MECS doğrudan etkileşimi kolaylaştırırve BM sağladığı epitel proteolitik bozulmaya uğrar. Saf RBM jeller GLA ile ön işlemden de Halk 3D bez asinüsü üreterek, mevcut protokol BM sertliği başına onların invaziv davranış (Şekil 3) tetikleyebilir nasıl incelemek için bir yol açar. Bu protokol kaynaklı BM sertlik seviyeleri fizyolojik alaka var. 6 saat, 14 saat süre ile, 50 mM GLA ile inkübasyon, sırasıyla PBS (Tablo 1) ile muamele RBM jeller 122 ± 55 Pascal göre 175 ± 90 ve 322 ± 160 saf RBM jel elastik modülü artmıştır. RBM sertliği bu 1,7-3,2 misli artış normal prostatta ve BPH dokusunun 23-26 ile karşılaştırıldığında habis gözlenen sertlik 2.5- 3.4-kat artış tartışıldı. Son yayında PEC asini YAŞ ve RBM sertlik birikimi ile oluşturulan 13 morfolojik değişiklikler belirtildiği gibi ar dan istatistiksel olarak anlamlı vardiyası için sayısal olabilirçokgen şekline ounded luminal / toplam asinar alan ve yaş bakımından zengin RBM (Şekil 3) içerisine acina taşıma çıkıntı yapan hücrelerin azalmıştır. İmmünoblotting da EMT belirteçleri değerlendirmek ve kasılma davranışı (örneğin fosforlu miyosin hafif zincir-2, pMLC2 13) sert RBM normale karşı yetiştirilen Halk (Şekil 3) (E-kadherin 13 örneğin kaybı) kullanılabilir. 130: ve GM130 erken endozomal antijeni 1: immünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi kullanılarak daha fazla değerlendirilmesi (örneğin, laminin, kolajen IV ve AGE birikimi 13), hücresel apikal-to-bazal polarite (örneğin, apikal EEA1 lokalizasyonu BM görselleştirmek için uygulanabilir kDa sis-Golgi işaretleyici 13) ve yapışma moleküllerinin hücre modelleri (hücre-hücre kavşaklarından 13 örneğin e-kaderin yerelleştirme) (Şekil 3). <img alt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Şekil 3:. Burada sunulan Farklı Protokoller genel şeması (hazırlamak ve glikoladehid (Maillard reaksiyonu) ile yeniden bazal membran (RBM), sert RBM için hücreleri tohum nasıl nasıl sert RBM analiz pekiştirmek için nasıl tasvir Maillard reaksiyonu), ve yaş bakımından zengin RBM neden olduğu hücresel ve moleküler değişimleri analiz etmek için kullanılabilir prosedürlerin ölçüde. YAŞ, gelişmiş Glikasyon Son; BM, bazal membran; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol; EEA1 erken endozomal antijeni 1; GAPDH, gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz, GLA izleyerek, sulu; GEE glisin etil ester; GM130, 130 kDa&#39;lık bir sis-Golgi işaretleyici; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), miyozin hafif zincir-2 siteleri fosforile 18 ve serin 19 treonine; RBM, tekrar oluşturulmuş temel membran; SDS-PAGE sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi. RWPE1 acininin Ölçek çubuğu = 10 mm; PC3 tümör hücresi içinSferoidler Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakam referans 13 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> - (-) - Riboz RBM için çapraz bağlama maddesi olarak seçilmiştir D ise giderme adımları gereklidir. - (-) - 72 saat boyunca riboz, daha önce RBM / kollajen jel 22 için tarif edildiği gibi, RBM jeller dehidrasyon ve çekme ile sonuçlanmıştır protokolü gelişimi sırasında, 1 M, D ile tedavi olduğu bulunmuştur. - (-) - D düşük konsantrasyonlarda değerlendirilmesi riboz ve daha kısa tedavi süreleri bu sınırlamayı aşmak için yardımcı olabilir. RBM sertlik yüksek seviyelerde arzu nerede protokol gelecekteki uygulamalar bir potansiyel sınırlama karşılaştı olabilir. uzun inkübasyon süreleri ve GLA&#39;nın daha yüksek konsantrasyonlar RBM jel sertliği yüksek seviyelerini indüklemek için, kullanılacak ise gerekli olacaktır<html> Bu tedavi koşulları hücrenin hayatta kalması ve çoğalması üzerinde bir etkisi olup olmadığını önceden 13 açıklandığı gibi, değerlendirmek. Ayrıca, serum ile RWPE-1 hücrelerinin inkübasyon kaçınılmalıdır serum veya serum ihtiva eden malzeme, bir fenotipik EMT benzeri geçiş ve maruz indükler unutulmamalıdır. Deneyler kısa RNA (siRNA) oligonükleotidleri müdahale transfeksiyonunu içeren, örneğin, işlemin düşük serum transfeksiyon ortamı hücrelerin geçmeden KSFM yetiştirilen RWPE-1 hücreleri kullanılarak optimize edilmelidir. geçici siRNA kullanılarak modelde yaklaştığında genin seviyesini tehlikeye atabilecek Bu dezavantajı elde susturulması. Bazı protein hedefleri için ayarlanabilir gen susturma ve protein düzeyleri istenen düşüşün indüklenebilir shRNA vektörler istihdam için tavsiye edilir. Stromal hücre veya tümör hücresi bağlantılı lisil oksidaz (LOX) 17 enzimatik çapraz bağlanmasını dahil uyarlamalar da gelecek modelleri içine dahil edilebilir. jove_content &quot;&gt; Bu protokol yanlısı invaziv Halk AGE-bağımlı BM sertliği tarafından tetiklenen mekanizmaların (RWPE-1, BPH-1) ve invaziv PTCs (PC3) anti-metastatik hedeflerin değerlendirilmesi gelecekteki çalışma kolaylaştıracaktır. BPH göz önüne alındığında bir metabolik bozukluk 27 olarak kabul edilir, bu protokol aynı zamanda metabolik bozukluklar ve artan prostat kanseri riski arasındaki bağlantıyı bizim daha iyi anlaşılması yönünde önünü açıyor. AGEs onun maruz tarafından uyarılan BM sertlik diğer kanser invazivlik için bir tetikleyici olabilir göz önüne alındığında türleri, diğer organların (örneğin meme, kolon, yumurtalık, pankreas) normal epitel hücreleri ve tümör hücrelerini birleştirmek benzer modeller kurmak için protokolünü kullanmak için ilgi olacaktır. Birlikte zamanlamaları ile bir protokol dahilinde kritik adımlar, Şekil 4&#39;te özetlenmiştir. İlk aşamasında o onun pol önlemek için thaws ise 4 ° C&#39;de RBM stok solüsyonu korumak için esastırymerization. bunlar, 4 ° C&#39;ye soğutulmuş kadar pipet uçları rM hazır çözelti içine yerleştirilmesi gerekir. Bir sonraki adım için bunların RBM çözeltisi ile kaplanır önce bölmeli lamlar 4 ° C&#39;ye dengelenmiş emin olmak için önemlidir. En kısa RBM çözeltinin sıcaklığı, 4 ° C üzerinde bir artış gibi bir jel oluşturmak için geri dönüşü olmayan bir polimerizasyon geçirecektir. Temel RBM bir daha da hücre kültürü ve mikroskobik analizi için uygun bir yüzey oluşturur sağlamak için polimerleştirme aşamasında rahatsız olduğunu. veya Maillard reaksiyonu (sodyum siyanoborohidrit ve amingoguanidine) önleyicileri olmayan GLA ile inkübasyon süresi RBM jel haline kadar sert belirleyecektir. Sert koşullar (Tablo 1) gerekiyorsa Yarı sert koşullar gerekiyorsa GLA ile 6 saat inkübasyon kullanılması tavsiye ve 14 saat inkübasyon edilir. GLA Alternatif inkübasyon süreleri veya konsantrasyonları farklı düzeylerde ise kullanılabilirsertliğin arzu edilir. RBM jellerinin Bu durumda, reolojik analizde temel bir adım olarak dahil edilmesi gerekir. GEE ile inkübasyon ve PBS ile müteakip yıkama adımları ile Maillard reaksiyonu söndürülmesi adımını takiben, RBM jeller hemen kullanılabilir ya da önceki hücre kültürü için kullanımı ile en fazla 48 saat boyunca 4 ° C&#39;de saklanır. hücre kültürleri ayarlandıktan sonra her iki gün (herhangi bir tedavi de dahil olmak üzere), kültür ortamı değiştirmek önemlidir. Araştırma altındaki parametrelerine göre 3-12 gün için 3 boyutlu hücre kültürleri korumak için tavsiye edilir. 3D için PEC 6 gün sonra kültürleri analiz etmek tavsiye ve 3D PTC ilk etapta kültür 3 gün sonra tavsiye edilir analiz sferoidler için olan asinüsü. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Şekil 4:. Kritik Adımlar ve Zamanlamaları&#39;na ile Protokol Basit Bakış gösterilen flow şeması hazırlamak ve belirtilen kritik adımlar ve zamanlamaları ile glikoladehid (Maillard reaksiyonu) ile yeniden bazal membran (RBM) pekiştirmek için nasıl göstermektedir. Protokol durdurulabilir ve RBM jeller saklanan Nokta de belirtilmiştir. RBM, tekrar oluşturulmuş temel membran; GLA izleyerek, sulu; GEE glisin etil ester; AÇIK, gecede; PBS, fosfat tamponlu salin; RT, oda sıcaklığı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bazal membran (BM), epitel hücrelerinin katmanlarını stroma1'den ayırarak stabil doku sınırlarını koruyan özel bir hücre dışı matris (ECM) tabakasıdır. BM'deki bitişik üçlü kollajen IV sarmalları arasındaki kovalent çapraz bağlanma, düzensiz bir süper bükümlü sarmalağı 2 kurarak yanal ilişkilerini stabilize eder. Bu kollajen IV kafesleri, laminin ve diğer BM bileşenleri ile etkileşimi için bir iskele görevi görür1. BM'nin yapısal düzenlemesi, glandüler epitel3'ün normal gelişimi için gerekli mekanik mukavemeti ve sertliği sağlar. 
Yaşlanma ve hastalık sırasında BM giderek kalınlaşır ve sertleşir3,4. Örneğin, oküler BM'nin elastik modülünde (E) 3 kat artış, normal popülasyonda 50 ila 80 yaşları arasında meydana gelir ve bu sertleşme, diyabet5 gibi metabolik bozukluklarda daha da şiddetlenir. BM'deki sertliğin artmasına neden olan yapısal ve biyomekanik değişiklikler, ECM bileşenleri, kollajen IV ve laminin, ileri glikasyon son ürünlerine (AGE'ler) maruz kaldıktan sonra enzimatik olarak çapraz bağlanmamış hale geldiğinde meydana gelir.
Burada açıklanan yöntemin amacı, metastatik prostat kanserine (PCa) geçiş bağlamında AGE maruziyetine bağlı BM sertliğinin prostat epitel hücresi (PEC) ve prostat tümör hücresi (PTC) invazivliğini nasıl teşvik ettiğinin araştırılması için bir model oluşturmaktı. Bunu yapmak için, sulandırılmış rBM jelleri6'da meme epitel hücrelerinden (MEC'ler) 3D glandüler asini üretmek için kullanılan önceki bir yöntem, rBM jellerinin glikolaldehit (GLA) ile ön işleme tabi tutulduğu ek bir adımı içerecek şekilde uyarlanmıştır. Fotometrik analiz, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS PAGE), konfokal mikroskopi ve reometrik analiz dahil olmak üzere, ön işlem görmüş rBM jellerinin GLA kaynaklı çapraz bağlanmasını ve sertleşmesini değerlendirmek için çeşitli teknikler açıklanmaktadır. Önceden sertleştirilmiş rBM üzerinde kültür için seçilen prostat hücre tipleri şunları içerir: RWPE-1, normal bir prostat bezindentüretilen PEC'ler 7; BPH-1, BPH8'den etkilenen bir prostat bezinden türetilen PEC'ler; ve PC3, bir prostat kanseri (PCa) hastasının vertebral kemiğinde bulunan ikincil bir tümörden türetilen metastatik PTC'ler9. 
Prostat bezi patolojisi çalışmasını ilerletmenin yanı sıra, rBM jellerinin GLA ile tedavisi ile sertleştirilmesi protokolü, BM sertliğinin yaşa bağlı diğer patolojilere ve metabolik bozukluklara nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için uyarlanabilir. Örneğin, model, uygun hücre tiplerinin dahil edilmesiyle meme, kolon, yumurtalık ve pankreas gibi organlarda BM sertliği tarafından metastatik kanserin nasıl indüklendiğini araştırmak için doğrudan uygulanabilir. Ayrıca, protokol, sert BM'nin diyabetle ilişkili mikrovasküler hastalık, retinopati, nefropati ve nöropatide hastalık ilerlemesinin biyomekanik mekanizmalarını nasıl desteklediğini araştırmak için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>I - Tek katmanlı kültür için malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>CaP Hücre Hattı Veritabanı</td><td>PCaCL-132</td><td>İletişim: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>Komple keratinosit serumsuz besiyeri&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>° C'de 37 ° C'de ısıtmayın; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>Fetal baldır serumu&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>Mağaza -20 &ordm'de; Alikotlarda C3</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin (Dulbecco A) tabletleri</td><td>Oksoit</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp;</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözümü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>II - 3D kültür için malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Aminoguanidin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>396494</td><td>Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder</td></tr><tr><td>Oda slaytları, 8 kuyulu&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>Kültür Matrisi sulandırılmış bazal membran (rBM) azaltılmış büyüme faktörü ekstraktı&nbsp;</td><td>AMS Biyoteknoloji</td><td>3445-005-01</td><td>-80 &ordm'de Bodrum membranı (BM) saklayın; Alikotlarda C</td></tr><tr><td>Siyanojen bromür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>Temas eden cilt ve soluma yoluyla toksik</td></tr><tr>:<td>Formik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Glisin etil ester hidroklorür (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>Gözleri tahriş eder</td></tr>: <tr><td>Glikolaldehit dimer (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum siyanobororohidrit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>Son derece yanıcı; Temas eden cilt ve soluma ile toksik</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 0.22 mikron</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>III - Maillard reaksiyonunu ölçmek için malzeme< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>ışığa duyarlı ve -20 ° C'de saklayın; Alikotlarda C</td></tr><tr><td>Klonlama silindirleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG (H + L) Alexa Fluor 488 eşlenik</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>ışığa duyarlı</td></tr><tr><td>Keçi tavşan önleyici IgG (H + L) Alexa Fluor 488 eşlenik</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>ışığa duyarlı</td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>-20 &gtm'de saklayın; Alikotlarda C</td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı&nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-pentosidin klonu PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>-20 &gtm'de saklayın; Alikotlarda C</td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan kollajen IV poliklonal antikor&nbsp; &nbsp;</td><td>Acris Antikorları</td><td>R1041</td><td>-20 &gtm'de saklayın; Alikotlarda C</td></tr>, <tr><td>Tavşan anti-laminin, A / C, pAb</td>, <td>Santa Cruz Biotechnology, Inc</td>, <td>sc-7292</td>, <td>-20 &gtm'de saklayın; Alikotlarda C</td></tr><tr><td>Polietilen glikol tert-oktilfenil eter (Triton-X100)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol sorbitan monolaurat (Tween-20)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz kaseti Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333</td><td></td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>IV - Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2 kontrollü gerinim rotasyonel reometre</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert S100 (20X büyütme) mikroskobu Zeiss Axio S100 mikroskobu</td> için <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 kontrollü nemlendirilmiş inkübasyon odası</td><td>Solent Scientific Confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M (40X, 63X büyütme) mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus LH50A mikroskobu, faz kontrastı kullanan bir dijital kamera ile donatılmıştır;</td><td>Olimpos&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar Plus plaka okuyucu spektrofotometresi</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>V - Yazılım</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüsü, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress</td><td>Moleküler Hastalıkları</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prostat kanseri ve diğer yaşa bağlı patolojilerde veya metabolik hastalıklarda bir biyofiziksel tetik olarak bazal membran rijitliğinin eğitim nasıl

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Burada, yaşa bağlı patolojiler ve metabolik hastalıklar (örneğin, kanser, diyabet, mikrovasküler hastalık, retinopati, nefropati ve nöropati) sırasında artan kalınlığı ve bazal membran (BM) sertliği ile ilgili biyofiziksel mikro-incelemek için kullanılabilecek bir protokol açıklar . modelin öncül Maillard reaksiyonu ile ileri glikasyon son ürün (AGE) üretimini teşvik etmek için glikoladehid (GLA) ile işlenmesi suretiyle yeniden BM (RBM) matrisin enzimatik olmayan çapraz bağlar. YAŞ nesil, non-enzimatik çapraz bağlanmasını onaylamak için kullanılır ve GLA sertliği artırılabilir laboratuvar teknikleri örnekleri RBM özetlenmiştir tedavi. fotometrik analiz ve immünoflüoresan mikroskopi, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid tarafından enzimatik olmayan çapraz bağlama ile onun yaş içerik: Bu belirlenmesi için (GLA ile muamele edilmiş) ve sert RBM (fosfat tamponlu tuzlu su, PBS ile muamele edilmiş) yerel RBM hazırlanmasını içerirjel elektroforezi (SDS-PAGE) ve konfokal mikroskopi, ve artan sertlik ile reometre. Burada tarif edilen prosedür, hastalıklı insan prostat dokusu karşı sağlıklı yapılan ölçümler ile uyumlu olarak, 3.2 kata kadar RBM sertliğini (esneklik modülü, E) geliştirmek için de kullanılabilir. yaşlanma ve hastalıklı prostat ile ilişkili biyofiziksel mikro yeniden üç prostat hücre tipleri yerli RBM ve sert RBM için getirilmiştir bezi: RWPE-1, prostat epitel hücreleri (PEC) normal prostat bezinin türetilmiş; BPH-1, benign prostat hiperplazisi (BPH) etkilenen bir prostat bezinin türetilen PECS; ve PC3, metastatik prostat kanseri hücreleri kaynaklanan ikincil kemik tümörü türetilmiş. Birden çok parametre boyut, şekil ve sert RBM karşı doğal ilgili RWPE-1 ve BPH-1 tarafından oluşturulan 3D glandüler asinüs invaziv özellikleri ve ortalama hücre boyu, göç eden hız ve 3D spher hücre hareketinin devam etmesi de dahil olmak üzere, ölçülebiliraynı koşullar altında, PC3 hücrelerinin oluşturduğu Giller. yollar ve proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal de değerlendirilebilir.

Sert RBM 3D Prostat asinüsü Kültür Kültürde 6 gün sonra, Halk, normal prostat dokusu elde edilen (RWPE-1) (Şekil 1 A) Prostat dokusu (SPH-1) epitel düzgün sferoidler şeklinde düzenlenir (Şekil 1B) yerli (PBS ile tedavi edilmiş) RBM form acininin hücreler. Bu acininin da kutuplarına-bazal-apikal ve görünür bir lümen alanı 13,20 ile son derece organize Halk özelliklerine sahip. Normal prostat dokusu elde Halk oluşturduğu acininin (RWPE-1) (Şekil 1 A) ve (GLA ile muamele edilmiş) sertleştirilmiş (AGE zengin) RBM BPH dokusunun (BPH-1), (Şekil 1B), bir bozulmuş bir mimariye sahip (vites şekil ve hücrelerde çokgen için sfero itibaren) AGE zengin RBM) (Şekil 1A içine asinüs göç / çıkıntılı. Bunlar<html> acininin aynı zamanda küçük veya hiç lümen boşluk 13 ile apikal-to-bazal polarite kaybetmiş yüksek dağınık Halk ile karakterize edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Şekil 1:. Ana ve sert tekrar oluşturulmuş temel membran (RBM) 3D Bez asinüs olarak yetiştirilir Prostat Epitelyal hücreler (A), RWPE-1 hücrelerinin aydınlık ve görüntüler, PBS (ana) ya da işlemden RBM jelleri üzerinde 6 gün, 12 saat kadar yetiştirilen 14 saat (; sert AGE-zengin) için 50 mM glikoladehid; Ölçek çubuğu 50 mikron =. Panel A&#39;da açıklandığı gibi büyütüldü (B) BPH-1 hücreleri; Ölçek çubukları 50 mikron =; Veri 3 bağımsız deneyler temsilcisidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> Tablo 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tablo 1:. Yerli Yarı Sert ve sert tekrar oluşturulmuş temel membran (RBM) Yetiştirilen Prostat Epitelyal RWPE-1 asinüs özellikleri RWPE-1 acininin GLA (RBM 14 saat (yerli) izleyerek, sulu PBS ile önceden tedavi edilen büyütüldü ) 6 saat (yarı-sert) veya 14 saat (sert) için GLA. asiner şekli için, yüzde (%) yuvarlak standart sapma (SD) ±, yarı köşeli ve çokgen acininin (50 acininin durum başına miktarı) 5 bağımsız deneyden hesaplandı. Bağıl asiner boyutu 3 bağımsız deneyler (yerli RBM =% 100) hesaplandı. invaziflik için, bir veya daha fazla çıkıntı yapan hücrelerin SD asinüs ±% 3 bağımsız deney ile hesaplandı. Katlama değişim doğal koşullar için karşılık gelen değeri ile yarı sert veya sert koşullar altında elde edilen ortalama değer bölünmesi ile hesaplanır. P değerleri, Öğrenci t-testi (α = 0.05) kullanılarak hesaplandı. ontent &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; YAŞ bağımlı artmış RBM sertlik PC3 prostat tümörü hücre göçü teşvik PC3 hücreleri AGE-zengin (sertleßmiß) üzerinde büyümüş, oysa yerel RBM yetiştirilen PC3 hücreleri birbirlerine (Şekil 2A) için bağımsız olarak, sürekli hücre-hücre teması sağlanarak RBM hareket geçirmek. Kültür PC3 hücreleri 72 saat yerli üzerine odaklar (sferoidler) oluşturmak sonra sferoidler değil yapmak ve bağımsız (Şekil 2B) göç sert (YAŞ-zengin) RBM üzerinde PC3 hücreleri ise, RBM (PBS tedavi). Sert (YAŞ-zengin) RBM üzerinde PC3 hücreleri yerli RBM (Şekil 2C) yetiştirilen PC3 hücreleri daha uzundur. Sert RBM üzerinde PC3 hücreleri yerli RBM (Şekil 2B) yetiştirilen PC3 hücreleri daha hızlı göç ederler. Sert RBM ilgili PC3 hücreleri doğal RBM (Şekil 2E) üzerinde büyümüş PC3 hücreleri ile karşılaştırıldığında kalıcılık olarak bir azalma sergilerler. <img alt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2:. Yerli ve Sert Sulandırılmış Bodrum Membran (RBM) üzerine Prostat Tümör Hücre Göç (A) 14 saat süreyle PBS (yerli) veya 50 mM glikoladehid ile tedavi RBM jeller üzerinde yetiştirilen PC3 hücreleri aydınlık görüntüleri (YAŞ zengin, sert) . Hücreler, bir aydınlık mikroskop (10x objektif) ve yörüngeleri üretmek için takip hücre ardından 12 saat boyunca saat başına 1 resim bir alıcı oranı kullanılarak görüntülendi. Gösterilen görüntüler, 0, 3, 6, 9 ve 12 saat sonraki zaman noktalarında karşılık gelmektedir. tek hücre yörüngeleri 12 saat bir zaman noktası için gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Panel (A) &#39;da tarif edildiği gibi (B)&#39; PC3 hücreleri 72 saat için yerli veya sert RBM kültüre ve görüntüsü alınmıştır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Detay 2X büyütme seçilen alanı göstermektedir. (C) Ortalama ± SD hücre uzunluğu (um); yerli RBM ve sert RBM arasında anlamlı bir fark (p = 1.2 x 10 -23). ( <strHücre yörüngeleri hesaplanan ong&gt; D) Ortalama ± SD hızı (mm / saat); yerli RBM ve sert RBM (p = 0.004) arasında anlamlı fark. Hücre hareketi (E) Ortalama ± SD sebat (oran D / T, burada D = baştan hücre yörünge, hücre yörünge T = toplam uzunluğu sonuna mesafe); yerli RBM ve sert RBM (p = 0.0007) arasında anlamlı fark. CE&gt; 10 hücre analiz edildi paneller için, veri 3 bağımsız deneyler temsilcisidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Burada çapraz ve ileri glikasyon nihai ürünlerin (AGE) tarafından uyarılan bazal membran (BM) artan sertlik patolojik ilgisi biyofiziksel mikro modelleme için bir protokol açıklar.

Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Bu modelin genel amacı, gelişmiş glikasyon ve ürün maruziyeti nedeniyle bazal membran sertliğinin ve kalınlığının, metastatik prostat kanserinin erken ve ileri evrelerine karşılık gelen invaziv hücre davranışını nasıl modüle edebileceğini araştırmaktır. Bu yöntem, yaşa bağlı patolojiler alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, artan bazal membran sertliği ve kalınlığının kanser progresyonuna ve ayrıca diyabet gibi metabolik bozukluklara nasıl katkıda olduğu gibi.Bu tekniğin temel avantajı, klinik ortamda insan prostat tümörlerinde ölçülen sertlik seviyesini taklit etmek için basit bir yöntem sunmasıdır. Bu tekniğin önemi, bazal membran sertliğinin moleküler ve hücresel değişiklikleri nasıl teşvik ettiğine dair anlayışımızı geliştirerek prostat kanseri tedavisi ve teşhisine kadar uzanmaktadır. Model multidisipliner olduğu için, bu yönteme yeni başlayan kişiler zorluk yaşayabilir.Kimya, fizik ve biyoloji alanlarından tekniklerin birleştirilmesi. Bu yöntemle ilgili fikri ilk olarak, prostat bezindeki bazal membran sertliğinin, bilinen transforme epitel hücrelerde de novo invaziv davranışı teşvik edebileceği hipotezini kurduğumuzda geliştirdik. Disiplinler arası adımların açıklanması gerektiği için bu yöntemin video ile gösterimi kritik önem taşımaktadır.Bazal membranın çapraz bağlanmasını ve ardından 3D hücre kültürünü içerir. İşleme, düz bir buz yüzeyi hazırlayarak ve bunu sekiz kuyucuklu chamber cam lamı dört derece santigrat dereceye soğutmak için kullanarak başlayın. Ardından, 200 microliter pipet ucunun ucunu kesin ve pipet ucunu da dört derece santigrat dereceye soğutun.Soğuduktan sonra, ucu 200 µL kapasiteli bir pipetleme yardımcısına yerleştirin. Bunu kullanarak, soğutulmuş sekiz kuyucuklu oda cam lamının her bir kuyucuğuna 40 µL buz gibi soğuk BM matrisi solüsyonu aktarın. Ardından, bazal membranın polimerizasyonunu teşvik etmek için oda lamını 37 °C'de 30 dakika bekletin.Sıvı halde yeniden oluşturulmuş bazal membranı rahatsız etmemek için inkübatör kapağını çok dikkatli bir şekilde kapatın. Tam olarak 30 dakika sonra, polimerize olmuş, yeniden oluşturulmuş bazal membranı kaplayacak şekilde 250 µL hazırlanmış glikolaldehit çözeltisi ekleyin. Ardından, doğal, yeniden oluşturulmuş bazal membran jelini 250 µL steril PDS ekleyerek bir negatif kontrol hazırlayın.Ayrıca, bazal membran jelini eklemeden önce glikolaldehit solüsyonuna ya 50 millimolar sodyum siyanoborohidrür ya da 250 millimolar aminoguanidin ekleyerek iki ek kontrol hazırlayın. Ardından, yarı sert bir jel üretmek için jelleri 37 degrees Celsius'de altı saat boyunca veya sert bir jel üretmek için 14 saat boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, solüsyonları jellerden dikkatlice uzaklaştırın ve her bir jele 250 µL 1 M glisin etil ester ekleyin. Ardından bunları 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Glikoldehit solüsyonunun ve glisin etil esterin tüm kalıntılarını gidermek için her bir jeli 500 µL PBS ile 10 kez yıkayın.Ardından,dehidrasyonu önlemek için 400 µL PBS ekleyin ve yeniden oluşturulmuş bazal membran jellerini 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Devam etmeye hazır olduğunuzda, yeniden oluşturulmuş bazal membran jellerinden PBS'yi uzaklaştırın ve her bir kuyucuğa 250 µL buz gibi soğuk, çift distile su ekleyin. Matrisin tamamen sıvılaştığından emin olmak için jelleri 4 °C'de 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin.Ardından, sıvılaştırılmış bazal membranı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve çözeltinin floresan emisyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün. Daha sonra çözeltiyi santrifüjleyin ve oluşan süpernatantı uzaklaştırın. Pelleti, 20 miligram/mililitre siyanojen bromür ve %70 formik asit içeren 500 mikrolitre çözeltide yeniden süspande edin.Numuneleri oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Ardından, yeniden süspanse edilmiş bazal membran jelini, 3,5 kilodalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir diyaliz kasetine aktarmak için bir mililitrelik tek kullanımlık bir şırınga kullanın. Kaseti, 500 mililitre çift distile su içeren 500 mililitrelik cam bir beherin içine daldırın.Ardından, suyu manyetik bir karıştırma çubuğuyla karıştırın. Siyanojen bromür ve formik asidin tüm kalıntılarını gidermek için bu düzeneği dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca bekletin. Diyaliz edilen çözeltiyi kasetten 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir mililitrelik tek kullanımlık bir şırınga kullanın.Ardından, çözeltiyi %12'lik poliakrilamid jel üzerinde çalıştırarak analiz edin. Siyanojen bromür matris peptidlerinin elektroforetik paternini görüntülemek için jeli gümüş boyama ile boyayın. PBS ile kaplanmış bazal membran jellerinden başlayarak, jelleri 0,1 milimol kalsiyum klorür içeren 300 mikrolitre PBS ile iki kez daha durulayın.Ve 0,5 millimole magnezyum klorür. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca. Ardından, PBS'yi uzaklaştırın ve yeniden oluşturulmuş her bazal membran jelini kaplayacak şekilde 300 microliter %4 paraformaldehit ekleyin.Yeniden oluşturulan bazal membran bileşenlerini sabitlemek için jelleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, fiksatif çözeltiyi uzaklaştırın ve 75 millimol amonyum klorür ile 0,5 millimol magnezyum klorür içeren 300 mikrolitre sönümleme çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin, ardından çözeltiyi uzaklaştırın ve durulama işlemini dört kez daha tekrarlayın.Son durulamanın ardından, spesifik olmayan reaksiyonları önlemek için yeniden konstitüe edilmiş bazal membran jellerine 300 mikrolitre immünofloresan tamponu ekleyin. Jelleri, oda sıcaklığında bir çalkalayıcı platform üzerinde iki saat boyunca çözelti içinde inkübe edin. Ardından immünofloresan bloklama tamponunu uzaklaştırın.Ardından, bloklama tamponu ile seyreltilmiş 300 µL primer antikor ekleyin. Yeniden oluşturulmuş bazal membran jellerini 4 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, primer antikoru uzaklaştırın ve jelleri 300 µL immünofloresan tamponu ile üç kez yıkayın.Her tampon eklemesinden sonra jelleri, bir çalkalama platformu üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çalkalayın. Ardından tamponu uzaklaştırın ve bloklama tamponunda seyreltilmiş 300 µL floresan işaretli sekonder antikoru ekleyin. Numuneleri bir çalkalama platformuna yerleştirin ve jelleri oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.Sekonder antikoru uzaklaştırın. Örneği önce bir immünofloresan tamponuyla, ardından PBS ile durulayın ve sonrasında örnekleri ikinci kez sabitleyip sönümleyin. Son olarak, jelleri lam üzerine monte edin ve yoğun demetlerin oluşumunu analiz etmek için bir mikroskop kullanın.Prostat bezi asini oluşturmak için, 5.000 RWPE-1 hücresini, %2 bazal membran çözeltisi eklenmiş 300 mikrolitre komple KSFM içinde dilüe edin. Prostat tümör hücresi agregatları için, 2.500 PC3 hücresini, %2 bazal membran çözeltisi eklenmiş 300 mikrolitre RPMI-1640 kültür ortamında dilüe edin. Yeniden oluşturulan bazal membran jellerinin PBS içinde gece boyunca inkübasyonunun ardından, jelleri 500 mikrolitre kültür ortamı ile iki kez yıkayın.Hücreleri ekmeden önce, hücreleri doğal ve gelişmiş glikasyon son ürünü ile sertleştirilmiş yeniden oluşturulmuş bazal membranlara nazikçe ekin. Ardından, büyüyen asinilerin ve sferoidlerin eşit dağılımını sağlamak için kültürleri dikkatlice bir inkübatöre yerleştirin.Asini oluşturan hücreler için, normal asini homeostazı için gerekli büyüme faktörlerini sağlamak amacıyla, ortamı her iki günde bir %2 bazal membran çözeltisi içeren taze kültür ortamı ile değiştirin. Kültürde altı gün geçtikten sonra, prostat epitel hücreleri doğal yeniden yapılandırılmış bazal membran üzerinde asini oluşturur.Ve epitel hücrelerin tekbiçimli sferoitleri şeklinde organize olurlar. Bu asini'ler aynı zamanda apikalden bazale polariteye sahip, oldukça organize PEC'lerin özelliklerini ve görünür bir lüminal boşluğu taşırlar. Sertleştirilmiş membran üzerinde altı gün boyunca kültüre edildiklerinde, hücrelerin mimarisi bozulmuştur.Ve şekil olarak sferoidden poligonal yapıya dönüşürler. Ayrıca bu asinüsler oldukça düzensizdir. Küçük veya hiç olmayan bir lüminal boşlukla birlikte, apikal-bazal polaritelerini kaybetmişlerdir.Bu durum, benign prostat hiperplazisinden etkilenmiş bir prostat bezinden türetilen hücreler için de geçerlidir. Prostat tümör hücreleri ölçüldüğünde, hücrelerin sert, yeniden oluşturulmuş bazal membranda daha uzun olduğu, ayrıca daha hızlı göç ettiği ve hücre kalıcılığının arttığı saptanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bazal membran sertliğinin epitel ve tümör hücresi davranışı üzerindeki etkilerinin nasıl modelleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü uygularken, istenen bazal membran sertlik düzeyinin indüklendiğinden ve münferit asinilerin veya s-sferoidlerin uygun şekilde oluştuğundan emin olmak önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, onkoloji alanındaki araştırmacıların prostat bezinde bazal membran sertliği ile kanser hücresi invazyonunun indüklenmesini araştırmalarına olanak sağlamıştır. Bu protokolü takiben, bazal membran sertliği tarafından modüle edilen sinyal yolaklarına ilişkin ek soruları yanıtlamak için hücre lizatlarının immunoblotting yöntemi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Sodyum siyanoborohidrür, siyanojen bromür ve formik asit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocak içerisinde çalışmakla birlikte laboratuvar önlüğü, eldiven, yüz siperliği ve respiratör takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

how-to-study-basement-membrane-stiffness-as-biophysical-trigger

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Hücresel fonksiyonları katmanlarından sertlik etkisi modellenmiş...

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

İşte biz cep sertliği ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşımın genel prensip hücre yüzeyine bir mikropipet yoluyla uygulanan iyi tanımlanmış bir negatif basınca tepki olarak zar deformasyon ölçmektir. Bu yöntem substrat bağlı hücrelerin biyomekanik özelliklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Parçacık izleme microrheology olmayan yıkıcı ölçmek ve 3 boyutlu uzamsal tümör modellerinde hücre dışı matris mekanik özelliklerinde değişiklikler eşlemek için kullanılabilir.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

Aortların fareden izolasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak elastik modüllerinin ölçümü için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Yakın zamanda retina kapiller sertleşmesini diyabetle ilişkili retina disfonksiyonu için yeni bir paradigma olarak tanımladık. Bu protokol, fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin retinal endotel kültürlerinden izolasyon adımlarını detaylandırır ve ardından atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sertlik ölçüm tekniğinin bir açıklaması yapılır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu

Bu protokol, murin akciğer dokusunun kriyoseksiyonlarının nasıl hazırlanacağını, atomik kuvvet mikroskobu kuvvet haritası deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini ve doğal murin pulmoner bazal membranının Young modülünü belirlemek için verilerin nasıl analiz edileceğini görselleştirir.

Atomik Kuvvet Mikroskobundan Türetilmiş Kuvvet Haritalarından Doğal Murin Pulmoner Bazal Membranlarının Young Modülünün Çıkarılması

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Keşfedin, bazal membran rijitliğinin prostat kanserinde invaziv hücre davranışını nasıl etkilediğini. Bu yöntem, yaşla ilişkili patolojiler ve metabolik hastalıklarda biyofiziksel tetikleyicileri anlamak için kullanılır.

Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl (Video) | JoVE Journal

Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl

Daha fazla video keşfet