Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl

Bu modelin genel amacı, ileri glikasyon ve ürün maruziyetine bağlı bazal membran sertliği ve kalınlığının, metastatik prostat kanserinin erken ve ileri evrelerine karşılık gelen invaziv hücre davranışını nasıl modüle edebileceğini araştırmaktır. Bu yöntem, yaşa bağlı patolojiler alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Artan bazal membran sertliği ve kalınlığının kanserin ilerlemesine ve ayrıca diyabet gibi metabolik bozukluklara nasıl katkıda bulunduğu gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, klinik ortamda insan prostat tümörlerinde ölçülen sertlik seviyesini taklit etmek için basit bir yöntem sağlamasıdır. Bu tekniğin anlamı, bazal membran sertliğinin moleküler ve hücresel değişiklikleri nasıl desteklediğine dair anlayışımızı geliştirerek prostat kanseri tedavimize ve teşhisimize kadar uzanır. Bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edebilir, çünkü model çok disiplinlidir.

Kimya, fizik ve biyoloji alanlarından teknikleri birleştirmek. Bu yöntem için ilk olarak, prostat bezindeki bazal membran sertliğinin, bilinen transforme epitel hücrelerinde de novo invaziv davranışı teşvik edebileceğini varsaydığımızda aklımıza geldi. Bu yöntemin video gösterimi kritiktir, çünkü disiplinler arası adımların tanımlanması gerekir.

Bazal membranın çapraz bağlanması ve ardından 3D hücre kültürü dahil. Düz bir buz yüzeyi hazırlayarak ve sekiz kuyu odacıklı bir cam slaytı dört santigrat dereceye kadar soğutmak için kullanarak başlayın. Ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet ucunun ucunu kesin ve ucu da dört santigrat dereceye kadar soğutun.

Soğuduktan sonra ucu 200 mikrolitre kapasiteli bir pipetleme yardımcısının üzerine yerleştirin. Ve 40 mikrolitre buz gibi soğuk BM matris çözeltisini soğutulmuş sekiz kuyulu cam slaydın her bir kuyucuğuna aktarmak için kullanın. Ardından, bazal membranın polimerizasyonunu teşvik etmek için hazne sürgüsünü 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Sıvı sulandırılmış bazal membranı rahatsız etmemek için inkübatör kapısını çok dikkatli bir şekilde kapatın. Tam olarak 30 dakika sonra, polimerize, sulandırılmış bazal membranı kaplamak için 250 mikrolitre hazırlanmış bir glikolaldehit çözeltisi ekleyin. Daha sonra, doğal, sulandırılmış bir bazal membran jeline 250 mircolitre steril PDS ekleyerek negatif bir kontrol hazırlayın.

Ayrıca, bazal membran jeline eklemeden önce glikolaldehit çözeltisine 50 milimolar sodyum siyanoborohidrit veya 250 milimolar aminoguanidin ekleyerek iki ek kontrol hazırlayın. Ardından, yarı sert bir jel elde etmek için jelleri altı saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Veya sert bir jel üretmek için 14 saat boyunca.

İnkübasyondan sonra, çözeltileri jellerden dikkatlice çıkarın ve her jele 250 mikrolitre bir molar glisin etil ester ekleyin. Ve onları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Glikolaldehit çözeltisinin ve glisin etil esterin tüm izlerini gidermek için her jeli 500 mircolitre PBS'de 10 kez yıkayın.

Daha sonra dehidrasyonu önlemek için 400 mikrolitre PBS ekleyin ve sulandırılmış bazal membran jellerini gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Devam etmeye hazır olduğunuzda, PBS'yi sulandırılmış bazal membran jellerinden çıkarın ve her kuyucuğa 250 mikrolitre buz gibi, çift damıtılmış su ekleyin. Matrisin tamamen sıvılaştığından emin olmak için jelleri 16 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra sıvılaştırılmış bazal membranı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak çözeltinin floresan emisyonunu ölçün. Daha sonra çözeltiyi santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı çıkarın. Peletleri mililitre başına 20 miligram siyanojen, bromür ve% 70 formik asit içeren bir çözeltinin 500 mikrolitresinde yeniden süspanse edin.

Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, yeniden askıya alınmış bazal membran jelini 3.5 kilodaltonluk bir moleküler ağırlık kesimi olan bir diyaliz kasetine aktarmak için bir mililitrelik tek kullanımlık bir şırınga kullanın. Kaseti, 500 mililitre çift damıtılmış su içeren 500 mililitrelik bir cam kabın içine daldırın.

Ve suyu manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırın. Tüm siyanojen, bromür ve formik asit izlerini gidermek için bu kurulumu gece boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Diyaliz solüsyonu kasetten 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir mililitrelik tek kullanımlık şırınga kullanın.

Ardından çözeltiyi %12'lik bir poliakrilamid jel üzerinde çalıştırarak analiz edin. Siyanojen bromür matris peptitlerinin elektroforetik modelini görselleştirmek için jeli gümüş leke ile boyayın. PBS ile kaplanmış bazal membran jellerinden başlayarak, jelleri 0.1 milimol kalsiyum klorür içeren 300 mikrolitre PBS ile iki kez daha durulayın.

Ve 0.5 milimol magnezyum klorür. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca. Ardından, PBS'yi çıkarın ve sulandırılmış her bir bazal membran jelini kaplamak için 300 mikrolitre %4 paraformaldehit ekleyin.

Sulandırılmış bazal membran bileşenlerini sabitlemek için jelleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, fiksatifi çıkarın ve 75 milimol amonyum klorür ve 0.5 milimol magnezyum klorür içeren 300 mikrolitre bir söndürme çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin ve ardından çözeltiyi çıkarın ve durulamayı dört kez daha tekrarlayın.

Son durulamayı takiben, spesifik olmayan reaksiyonları önlemek için sulandırılmış bazal membran jellerine 300 mikrolitre immünofloresan tamponu ekleyin. Çözelti içindeki jelleri, çalkalanan bir platformda oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ardından immünofloresan bloke edici tamponu çıkarın.

Ve bloke edici tamponda seyreltilmiş 300 mikrolitre primer antikor ekleyin. Sulandırılmış bazal membran jellerini 16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikoru çıkarın ve jelleri 300 mikrolitre immünofloresan tamponu ile üç kez yıkayın.

Her tampon ilavesinden sonra jelleri oda sıcaklığında çalkalanan bir platformda 10 dakika çalkalayın. Daha sonra tamponu çıkarın ve bloke edici tamponda seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikorun 300 mikrolitresini ekleyin. Numuneleri çalkalayan bir platforma yerleştirin ve jelleri oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

İkincil antikoru çıkarın. Numuneyi bir immünofloresan tamponunda, ardından PBS'de durulayın ve ardından numuneleri ikinci kez sabitleyin ve söndürün. Son olarak, jelleri monte edin ve yoğun demetlerin oluşumunu analiz etmek için bir mikroskop kullanın.

Prostat bezi asini oluşturmak için, bazal membran çözeltisinin% 2'si ile desteklenmiş 300 mikrolitre tam KSFM içinde 5.000 RWPE-1 hücresini seyreltin. Prostat tümörü hücre agregatları için, bazal membran çözeltisinin% 2'si ile desteklenmiş 300 mikrolitre RPMI-1640 kültür ortamında 2.500 PC3 hücresini seyreltin. Sulandırılmış bazal membran jellerinin PBS'de gece boyunca inkübe edilmesinin ardından, 500 mikrolitre kültür ortamı ile iki kez durulayın.

Hücreleri tohumlamadan önce. Hücreleri, doğal ve ileri glikasyon son ürünü ile sertleştirilmiş, sulandırılmış bazal membranlara nazikçe tohumlayın. Ve büyüyen asini ve sferoidlerin eşit dağılımını sağlamak için kültürleri dikkatlice bir inkübatöre yerleştirin.

Asini oluşturan hücreler için, ortamı her iki günde bir, bazal membran çözeltisinin% 2'sini içeren taze kültür ortamı ile değiştirin. Hücrelerin normal asini homeostazı için gerekli büyüme faktörlerine sahip olmasını sağlamak. Kültürde altı gün geçirdikten sonra, prostat epitel hücreleri doğal sulandırılmış bazal membran üzerinde asini oluşturur.

Ve epitel hücrelerinin üniformalı sferoidleri halinde düzenlenir. Bu asini ayrıca, apikal ila bazal polariteye ve görünür bir luminal alana sahip yüksek derecede organize PEC'lerin özelliklerine sahiptir. Sertleşmiş zar üzerinde altı gün boyunca kültürlendiğinde, hücreler bozulmuş bir mimariye sahiptir.

Ve şekil olarak küreselden çokgene değiştirin. Ek olarak, bu asiler oldukça düzensizdir. Ve küçük veya var olmayan bir luminal boşluk ile apikal bazal polaritelerini kaybettiler.

Bu aynı zamanda iyi huylu prostat hiperplazisinden etkilenen bir prostat bezinden türetilen hücreler için de geçerlidir. Prostat tümör hücreleri ölçüldüğünde, hücrelerin sert, sulandırılmış bazal membran üzerinde daha uzun olduğu ve ayrıca daha hızlı göç ettiği ve hücre kalıcılığının arttığı bulundu. Bu videoyu izledikten sonra, bazal membran sertliğinin epitel ve tümör hücresi davranışı üzerindeki etkilerini nasıl modelleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, istenen bazal membran sertliği seviyesinin indüklendiğini ve bireysel asini veya s-sferoidlerin uygun şekilde oluşturulduğunu hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, onkoloji alanındaki araştırmacıların prostat bezindeki bazal membran sertliği ile kanser hücresi istilasının indüksiyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu protokolü takiben, bazal membran sertliği ile modüle edilen sinyal yolu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için hücre lizatının immünoblotlanması gibi başka bir yöntem gerçekleştirilebilir.

Sodyum siyanoborohidrit, siyanojen bromür ve formik asit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve çeker ocakta çalışırken laboratuvar önlüğü, eldiven, yüz siperi ve solunum cihazı giymek gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.