Name: Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin, allogreft kalplerden izole edilen makrofaj popülasyonlarını fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize etme tekniklerini. Bu yöntem, transplantasyon biyolojisinde bağışıklık yanıtlarını anlamak ve greft sağkalımını iyileştirmek için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mount Sinai&#39;deki Araştırma Mükemmellik Akım Sitometresi, Mikrocerrahi ve Biyo-depo / Patoloji Merkezlerinin teknik katkılarını kabul ediyoruz. Bu çalışma, COST Action BM1305: Hücre Tolerojenik Tedavilere Odaklanma ve İyileşme Eylemi (A FACTT), Mount Sinai Recanati / Miller Transplantasyon Enstitüsü kalkınma fonları, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R ve SAF2016-80031-R tarafından desteklenmiştir. JO

<html> Bu çalışmada fareler, Birleşik Devletler Tarım Bakanlığı yönergelerine ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Halk Sağlığı Hizmeti Kılavuzu&#39;nun önerileri uyarınca yerleştirildi. Hayvan kullanımını içeren tüm deneysel teknikler, Sina Üniversitesi Tıp Fakültesi&#39;nin onaylı protokolleri olan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca gerçekleştirildi. 1. Medya Hazırlığı <ol><li> 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM zorunlu olmayan amino asitler, 5 mM HEPES ve 0.05 mM 2 kullanarak,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (10,000 U / mL) ile komple RPMI 1640 ortamı hazırlayın. mersaptoetanol. </li></ol> 2. Allograft İzolasyon ve Tek Hücreli Süspansiyon NOT: Pulmoner arter ve inferior kava veninin transplantasyon ve anastomoz tekniği başlangıçta Corry ve işbirlikçileri tarafından tanımlanmıştır ve Liu ve Kang&#39;da görselleştirilebilirS = &quot;xref&quot;&gt; 10 , 11 ( Şekil 1A ). <ol><li> Bir indüksiyon odasında% 4-5 izofluran içeren bir fare anestezisi. Servikal dislokasyonla onu kurban edin. </li><li> Standart makasla orta hat abdominal insizyon yapın ve aorta lokalize etmek için abdominal içeriği kaldırın. NOT: Transplante kalp, alıcı abdominal aortanın sağ tarafında olacaktır ( Şekil 1B ). </li><li> İnce keskin dişli forseps kullanarak yavaşça grefti çekin ve hemen buz gibi RPMI ortamına yerleştirin. NOT: Grefti aorta ayırmak için bir ameliyat makasının kullanılması grefte zarar verebilir ve bazı dokuların alıcının üzerine yapışmasına neden olabilir. </li><li> Tüm greftler toplandıktan sonra, doku işleme için steril bir kültür başlığına taşıyın. Grefti bir petri kabına yerleştirin ve steril, kütik, mikrocerrahi makası kullanarak dokuyu küçük parçalara (1 mm) zar atın. </li><li> Keskin dişli forc ileEps, parçaları 5 mL kollajenaz A (steril 1x PBS&#39;de 0.1 mg / mL kollajenaz) ile 50 mL&#39;lik bir tüpe aktarın. 37 ° C&#39;lik bir banyoda 1 saat inkübe edin. </li><li> Kollajenazı nötralize etmek için 1 mL&#39;lik bir şırınganın pistonu yardımıyla 100 μm&#39;lik süzgeçle numuneyi aktarmak için 5 mL&#39;lik RPMI ortamı ekleyin. </li><li> Numuneyi 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de döndürün. </li><li> Pelleti 1 mL ACK liziz tamponuna tekrar süspanse edin. İyi karıştırın ve 4 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. </li><li> Liziz tamponunu nötralize etmek için 1 mL RPMI ortamı ekleyin ve numuneyi 4 ° C&#39;de 5 m süreyle 400 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> RPMI ortamı 200 mcL hücre pelletini süspanse edin ve 5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp aktarın. NOT: Polipropilen tüpler daha az yapışmayı destekler. Ayrıca, hücreleri 4 ° C gibi düşük sıcaklıklarda tutmak, yapışmayı azaltır. </li></ol> 3. Fluoresansla aktive edilmiş Hücre Sıralamasını Kullanarak Greftle Sızma Makrofajlarının İzolasyonuing <ol><li> Fc reseptör bloke edici mAb (sıçan anti-fare CD16 / 32) kullanarak miyeloid hücreler üzerindeki istenmeyen spesifik bağlanmayı bloke edin. Yüzey boyamadan 15 dakika önce örnek başına 1-2 μL ekleyin. </li><li> Anti-fare CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI ortamında 0.6 μg / μL son konsantrasyon), anti-fare CD45 APC / eFluor780 (0.6 μg / μL), anti-fare Ly6C APC (2 μg / μL) Ve anti-fare Ly6G Pe / Cy7 (2 ug / ml). Floresan antikorları ışığa karşı korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 45 dakika boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında tüpleri inkübe edin. NOT: Tek leke dengelemeleri için negatif bir kontrol tüpü (leke yok) ve flokromların her biri ile tek tek etiketlenmiş hücreler içeren tüpler hazırlayın. Kapıyı ayarlamaya yardımcı olmak için, izotip kontrolleri özellikle Ly6C (IgG2a) ve Ly6G (IgG2b) için kullanılabilir. </li><li> Hücreleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın ve 400 xg&#39;de 5 dakika süreyle 4 ° C&#39;de döndürün. Tripan mavisi ve hemositomet kullanarak hücreleri sayın.R ve 1 x 10 6 hücre başına 1 mL RPMI ortamında seyreltin. Sınıflamadan önce, numuneleri 5 mL, 70 μm hücre süzgeç borusu başlığı ile aktarın. Bir hücre yaşayabilirlik markörü olarak DAPI (1 μg / mL) ekleyin ve sıralama yapmaya devam edin. </li><li> Makrofajlar hassas ve kırılgan hücreler olduğundan, sıralama koşullarını 20 psi&#39;ye ayarlayın ve makrofajları 4 yönlü saflık modu kullanarak izole etmek için 100 μm&#39;lik bir meme boyutu kullanın. </li><li> Toplama tüplerini 1 mL&#39;lik RPMI ortamı ile 5 mL&#39;lik bir polipropilen tüp içerisinde hazırlayın. </li><li> Sorgulayıcı yazılımını kullanarak yeni deneyler açın ve ayarları tanımlamak için boş bir panelle boş deney seçin. </li><li> En düşük ileriye ve yan dağılım gösteren döküntüleri ve kümeleri hariç tutarak, tüm lökositlerde ileri (FSC) karşı yan dağılım (SSC) ve kapıyı gösteren bir nokta çizelgesi kurun. Bu ana kapıda, SSC&#39;yi vs. DAPI ve kapıları DAPI hücrelerinde görüntüleyen yeni bir nokta çizelgesi oluşturun. <ol><li> Yeni kontrol edilen bu nüfusta reklam oluşturunCD11b&#39;yi CD45&#39;e ve kapıyı çift-pozitif (CD11b + CD45 + ) makrofajları ve nötrofilleri görüntüleyen ot parsel. </li><li> Buradan Ly6C - Ly6G görüntüleyen ve istenen popülasyonları gösteren son bir nokta çizelgesi oluşturun: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - ve Ly6C int Ly6G + ( Şekil 2 ). </li></ol></li><li> Sıralamadan sonra saflık ve hücre yaşayabilirliğini kontrol edin (&gt;% 90) ve toplama tüplerini 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 400 xg&#39;de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometreyi kullanarak hücreleri sayın ve tam RPMI ortamında istenen konsantrasyonda ( örn., 1 x 10 6 makrofaj / mL) tekrar süspanse edin. </li><li> 100 uL komple RPMI ortamı ile 96 oyuklu, yuvarlak tabanlı bir plakada oyuk başına 50 x 10 3 makrofaj. Hücreleri en az 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de rahatsız bırakmayın. </li></ol> 4. İzolatioFloresansla Etkinleştirilmiş Hücre Ayırma Kullanan T Hücrelerinin n NOT: C57BL / 6-Foxp3tmlFlv / Jn, Foxp3 (forkhead kutusu P3) genini monomerik kırmızı flüoresan proteini (mRFP) ile birlikte işaretleyen hücrelere işaret eden, X bağlantılı hedeflenmiş bir kapanmış fare suşudur. <ol><li> Adım 2.1&#39;de daha önce anlatıldığı gibi C57BL / 6 ve C57BL / 6-Foxp3tmlFlv / J (H-2b) farelerini anestezikle ve feda edin. Dalak ve lenf düğümlerini (LN: kasık, lomber, aksiller, brakiyal ve servikal) izole edin ve onları hızlıca buz gibi soğuk RPMI ortamına yerleştirin. </li><li> LN&#39;yi izole etmek için fareyi yatay bir pozisyona getirin, alttan üste doğru orta hat cilt insizyonu yapın, dikkatli bir şekilde periton keserek cildi hafifçe dışarıya yayın. Tüm inguinal, bel, aksiller, brakiyal ve servikal LN toplandığında ( Şekil 1C , kırmızı renklidir), periton kesilir ve bağırsağın sol üst tarafındaki dalağı izole eder. </li><li> Dalak ve LN&#39;yi 100 μm&#39;lik bir filtre yerleştirerek ayırın.50 mL&#39;lik bir tüpün üstünde. 1 mL&#39;lik şırınganın pistonu kullanarak, dokuyu hafifçe bastırın. Filtreyi temizleyene kadar RPMI ortamı ile gerektiği kadar çalkalayın. NOT: Her fareden alınan LN ve dalaklar, aynı tüp içerisinde bir araya getirilebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 400 xg&#39;de döndürün. </li><li> Pelleti 2 mL ACK liziz tamponuna tekrar süspanse edin. İyi karıştırın ve 4 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. </li><li> Liziz tamponunu nötralize etmek için 2 mL RPMI ortamı ekleyin. 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 400 xg&#39;de döndürün. </li><li> RPMI ortamı 200 mcL hücre pelletini süspanse edin ve 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp aktarın. </li><li> Anti-fare CD4 APC (0.6 μg / μL) ve / veya anti-fare CD8 PeCy7 (2 μg / μL) için boyayın. Floresan antikorları ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 45 dakika süreyle 4 ° C&#39;de buzdolabında tüpleri inkübe edin. NOT: Tek lekeli telafi için negatif bir kontrol tüpü hazırlayın (leke yoktur) veFlorokromların her biri ile tek tek etiketli hücreler içeren tüpler. </li><li> Hücreleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın ve 400 xg&#39;de 5 dakika süreyle 4 ° C&#39;de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. NOT: CFSE boya, genellikle 50 ug&#39;de karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester tozu olarak sağlanır. 5 mM son stok solüsyonu için bir CFSE şişesine 18 uL DMSO ekleyin ve birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> CFSE etiketi için, CD8 lekeli hücreleri, stok çözeltisinden 5 μM CFSE&#39;nin nihai bir çalışma konsantrasyonunda PBS içinde mL başına 10 6 hücreye kadar bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon haline getirin. Daha önce tarif edildiği gibi 5 dakika süreyle 20 ° C&#39;de bir banyoda inkübe edin 6 . NOT: (ÖNEMLİ ADIM) Düşük konsantrasyonda (≤10 6 / mL) hücreler için, hücrelerin, CFSE&#39;nin toksik etkilerini tamponlamak için ilave protein varlığında etiketlenmesi gereklidir. Bu nedenle, PBS% 5 FBS içerebilir. Unutmayın ki benDiom kullanılırsa, serbest amino asitler CFSE için rekabet ederek etiketleme verimliliğini düşürebilir. </li><li> CFSE&#39;yi 2 mL RPMI ortamı ile nötralize edin. 400 xg&#39;de 5 dakika süreyle 4 ° C&#39;de döndürün. 1 x 10 6 CD8 T hücre başına 1 mL RPMI orta ekleyin. </li><li> Sınıflamadan önce, numuneyi 5 mL&#39;lik tüp kapakta 70 μm&#39;lik hücre süzgeci ile aktarın. Bir hücre canlılığı markörü olarak 50 μL 1x DAPI (1 μg / mL) ekleyin ve sıralama devam edin. NOT: 1x, reaktifin diğer bileşene göre 1: 1 oranı anlamına gelir. </li><li> Çifte pozitif CD8 + CFSE + T hücrelerini izole etmek için sıralama koşullarını 20 psi ve 100 μm nozul boyutunda ayarlayın ( Şekil 3A ). </li><li> Toplama tüplerini 1 mL&#39;lik RPMI ortamı ile 5 mL polipropilen tüp içerisinde hazırlayın ve sıralamaya devam edin. </li><li> Sorgulayıcı yazılımını kullanarak yeni deneyler açın ve ayarları tanımlamak için boş bir panelle boş deney seçin. </li><li> CD4 + T hücre izolasyonu için,Dendritik hücreler gibi büyük taneli hücrelerin yanı sıra enkaz hariç, FSC&#39;yi SSC ve kapı lenfositlerini çalar. <ol><li> Bu ana kapıda, SSC&#39;yi vs. DAPI ve kapıları DAPI hücrelerinde görüntüleyen yeni bir nokta çizelgesi oluşturun. </li><li> Bu yeni kapılı popülasyonda, tüm CD4 + hücrelerini izole etmek için SSC&#39;ye CD4&#39;ü gösteren bir nokta çizelgesi oluşturun ( Şekil 3B ). Alternatif olarak saf T hücre popülasyonlarının izolasyonunu sağlamak için bir anti-CD3 mAb kullanılabilir. NOT: Tüm CD4 + T hücrelerinin küçük bir fraksiyonu (% 5-10) Foxp3 + mRFP + olmalıdır. </li></ol></li><li> Sıralamadan sonra saflık ve hücre yaşayabilirliğini kontrol edin (&gt;% 90) ve toplama tüplerini 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 400 xg&#39;de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 2x10 6 T hücre başına 1 mL eksiksiz RPMI ortamı kullanarak tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Daha önceden sıralanmış makrofajlar ile T hücrelerini kültürleyerek bastırma tahlilini oluşturun. Plaka 10 x 10 4 CD4 + T ve 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T hücrelerinin aynı oyukta 100 ul tamamlanmış RPMI ortamında eklendi. 96 saat boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de inkübe edin. NOT: Makrofajlar ve T hücreleri 1: 4 oranında kullanılmıştır. </li><li> Azid içeren tamponu temizlemek için bunları kullanmadan önce T hücre bölünmesini T hücresi etkinleştiricisi CD3 / CD28 manyetik boncuklarını 2 mL PBS içinde yıkayarak stimüle edin. Her göz başına 5 μL fare T hücresi etkinleştiricisi CD3 / CD28 boncuk ekleyin. NOT: Manyetik boncuklar, antijen sunan hücrelere benzer boyuttadır ve anti-CD3 ve anti-CD28 mAb ile birleşir ve T hücrelerinin aktivasyonu ve genişletilmesi için basit bir yöntem sunar. </li></ol>

<ol><li>Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+act+as+effectors+of+tissue+damage+in+acute+renal+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection.</a> Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).</li>
<li>Oberbarnscheidt, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self+recognition+by+monocytes+initiates+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection.</a> J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).</li>
<li>Garcia, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+suppressive+cells+mediate+cardiovascular+transplantation+tolerance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).</li>
<li>Conde, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN%28%2B%29+Macrophages+Control+the+Induction+of+Transplantation+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance.</a> Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> J Vis Exp. (70), e4287(2012).</li>
<li>Poujol, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+evaluation+of+lymphocyte+transformation+test+based+on+5-ethynyl-2%27deoxyuridine+incorporation+as+a+clinical+alternative+to+tritiated+thymidine+uptake+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement.</a> J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).</li>
<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), e238(2007).</li>
<li>Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Suppressor+Cells+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Transplant+Rep%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation.</a> Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).</li>
<li>Gallina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gr-1%2BCD115%2B+immature+myeloid+suppressor+cells+mediate+the+development+of+tumor-induced+T+regulatory+cells+and+T-cell+anergy+in+tumor-bearing+host%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host.</a> Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).</li>
<li>Luan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+accumulate+in+renal+transplant+patients+and+mediate+CD4%28%2B%29+Foxp3%28%2B%29+Treg+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion.</a> Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).</li>
<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, farklı murin deneysel modellerindeki diğer dokular için de geçerli olan, deneysel bir mürin kalp transplantasyon modelinde greft infiltre eden miyeloid hücre alt gruplarını immüno-karakterize eden yöntemleri tanımlamaktadır. 20 psi&#39;de düşük basınç hücreli sıralama, saf hücre alt gruplarının iyi bir verimliliğini izole etmek için tercih edilen yöntemdi. Her bir miyeloid alt kümesinin saflığını muhafaza etmek, farklı miyeloid popülasyonlar arasındaki baskılayıcı kapasitenin kesin sonuçlarını oluşturmak iç...

Bu protokol, T hücre yanıtlarını modüle edebilme yeteneklerine göre, kardiyak allograftlardan izole edilen dokuya sızdıran makrofajların fonksiyonunu incelemek için in vitro teknikleri tanımlamaktadır. Literatürde yaygın olarak tarif edilen floresan hücre izleme boyaları, akış sitometrisiyle kombinasyon halinde, in vitro ve in vivo spesifik hücre tiplerinin baskılayıcı fonksiyonlarını incelemek için güçlü araçlardır . Protokolümüz , in vitro lenfosit proliferasyonunu izlemek için karboksiflüoresase süksinimidil ester (CFSE) yöntemini izlemektedir. Bir CFSE etiketli hücre bölünürse, nesli karboksiflüoresantin ile etiketlenen moleküllerin sayısının yarısını alır 6 . Akış sitometresi ile hücre floresanındaki karşılık gelen düşüş, hücre bölünmesini değerlendirmek için, baskılayıcı makrofajların T hücre immün yanıtlarını modüle etme kapasitesini izlemek için kullanılabilir. CFSE floresein bazlı bir boya olduğu için, bir br ile uyumludur.Çok renkli akış sitometrisi için uygun hale getiren, diğer florokromlardan daha geniş bir yelpazede. Fenotipleme için florokromların uygun seçimi, aşırı spektrum örtüşmesini ve özellikle CFSE 7 gibi görünür protein boyaları ile antikor pozitif hücrelerin tanınamamasını önlemek açısından önemlidir. Floresan boyaları, radyoetiketlenmiş timidin (TdR) 8 kullanan timidin toplama testi gibi hücre çoğalmasını ölçen alternatif teknikler üzerine kullanmanın birçok avantajı vardır. Bu deney, mitotik hücre bölünmesi sırasında kromozomal DNA&#39;nın yeni iplikçiklerine dahil edilmiş, parçalanmış timidin (3H-TdR) kullanmaktadır. Bu tahlil ile ilgili bir güvenlik endişesi, radyoizotopların kullanılmasıdır, çünkü bir sintilasyon beta-sayacı, hücre bölünmesinin derecesini belirlemek için hücrelerden alınan DNA&#39;daki radyoaktiviteyi ölçmek için kullanılır. Metodolojik olarak, kıyılmış timidin kıçAy, boyama sonrası düşük hücre sayısı ve gecikmiş analiz gibi önemli klinik laboratuvar kısıtlamalarına uyacak kadar esnek değildir. Aksine, CFSE boyamasının hücre proliferasyonunu önlediği ve CD69, HLA-DR ve CD259 gibi kritik aktivasyon belirteçlerine müdahale ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, her bir metodolojinin avantajlarını ve kısıtlamalarını anlamak, özellikle farklı renk türlerini izlemek için birden fazla boyanın kullanıldığı çok renkli çalışmalar için doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik önem taşır.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Medya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>%10 FBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1.000x 2-merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100x Kalem/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x Non Esential amino asitler</td><td>Corning</td><td>25025039</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES tamponu&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25060CL</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Sodyum Piruvat</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptavidyn</td><td>ThermoScientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen A</td><td>Roche</td><td>70381322</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (kalsiyumsuz & magnezyum)</td> <td>Corning</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>70 ve mikro; m Hücre süzgeci</td><td>Fisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>ACK lizis tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>CFSE-FITC</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Fare T hücre aktivatörü CD3 / CD28</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu&nbsp; U-alt plaka</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Antikorlar:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-Ly6C-APC</td><td>eBioscience</td><td>175932-80</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6G-Pe / Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b-Percp / Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45011282</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC / Cy7</td><td>eBioscience</td><td>47045182</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4-APC</td><td>eBiyobilim</td><td>17004181</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-P/ Cy7</td><td>eBiyobilim</td><td>25008181</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Akış Sitometresi</td><td>BD Biyobilim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Yazılımı</td><td>BD Biyobilim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J & nbsp;</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>008374</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000651</td><td></td></tr></tbody></table>

greft reaktif bağışıklığı engelleyen düzenleyici makrofajların fonksiyonel karakterizasyonu

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Nakil yapılan organlarda makrofaj birikimi, allograft reddi 1&#39;in bir özelliği olarak uzun zamandır bilinmektedir. Immunogenic monocytes, transplantasyondan hemen sonra allogrefte infiltre olur, nakledilen organa karşı bir greft reaktif yanıt verir ve organ reddi başlatır 2 . Son yıllardaki veriler, baskılayıcı makrofajların başarılı uzun vadeli transplantasyon 3&#39;ü kolaylaştırdığını ve transplantasyon toleransının indüksiyonu için gerekli olduğunu göstermektedir4. Bu makrofaj fonksiyonunun izolasyonu ve analizi için yeni bir yol haritası isteyen, makrofaj ontogenezi, aktivasyonu ve fonksiyonunun çok boyutlu bir kavramını önermektedir. Makrofajların esnekliği nedeniyle makrofajları doku ortamına bağlı olarak izole etmek ve karakterize etmek için bir metodoloji sağlamak ve fonksiyonlarını farklı senaryolara göre tanımlamak gerekir. İşte, açıklıyoruzGreft sızdıran makrofajların bağışıklık karakterizasyonu için bir protokol olabilir ve CD8 + T proliferasyonunu inhibe etme ve CD4 + Foxp3 + Treg genleşmesini in vitro teşvik etme kapasitelerini fonksiyonel olarak değerlendirmede kullandığımız yöntemler olabilir .

Temsili sonuçlar yukarıdaki protokolde açıklanan geçiş stratejisini göstermektedir. Sonuçlar, greftle sızdıran makrofajlar ile birlikte kültürden sonra T-hücresi çoğalma aktivitesinin analizini de göstermektedir. Makrofaj alt gruplarının in vitro baskılayıcı kapasitesi Şekil 4'te analiz edilmiştir. Sonuçlar, toleranslı alıcılardan elde edilen Ly6C lo Ly6G - makrofajların baskılayıcı olduğunu göstermektedir. Sonuçlar aynı zamanda, Ly6C ...

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Bu in vitro prosedürün genel amacı, bir kitle nakli modelinde allogreftlenmiş kalplerden izole edilen makrofaj popülasyonlarını fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize etmektir. Bu yöntemler, allograf sağkalımı ve toleransında başarının nasıl geliştirileceği hakkında bulduğumuz bağışıklıktaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli bir doku infiltrasyonu ile kardiyak allograf izole edilmiş mikrofaj alt kümesinin konak doku yanıtını nasıl modüle ettiğinin incelenmesine izin vermesidir.Allogreftten tek hücreli bir süspansiyon oluşturduktan sonra, miyeloid hücreler üzerindeki spesifik olmayan bağlanmayı, 15 dakika boyunca monoklonal antikoru bloke eden bir ila iki mikrolitre FC reseptörü ile bloke edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri uygun floresan konjuge miyeloid hücre yüzeyi antikorları ile ışıktan korunarak dört santigrat derecede 45 dakika boyunca boyayın. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile RPMI ortamında iki kez yıkayın.Ve saymak için peleti tripan mavisi içinde yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri taze ortamda mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila altıncı hücreye seyreltin. Ve hücreleri 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüpe süzün.Sıralamadan hemen önce, hücreleri bir canlılık belirteci olarak DAPI ile boyayın ve akış sitometresini uygun makrofaj sıralama parametrelerine ayarlayın. Sıralanan hücreleri toplamak için bir mililitre RPMI ortamı içeren beş mililitrelik konik tüpleri yerleştirin ve numune tüpünü sitometreye yükleyin. Akış sitometresi yazılımında, boş bir panele sahip boş bir deney seçin ve bir ileri ve yan saçılma nokta grafiği ayarlayın.Hücre kalıntıları ve en düşük ileri ve yan saçılmaya sahip kümeler hariç olmak üzere lökositlerin kapısını açın. Bu üst geçitten, DAPI'ye karşı yan saçılmayı ve DAPI negatif hücrelerindeki geçidi görüntüleyen yeni bir nokta grafiği oluşturun. Bu yeni kapılı popülasyonda, CD11b'ye karşı CD45'i gösteren bir nokta grafiği oluşturun ve CD11b CD45 çift pozitif makrofajları ve nötrofilleri geçit edin.Ardından, istenen popülasyonun geçitlenmesine izin vermek ve hücreleri sıralamak için Ly6C'ye karşı Ly6C'yi gösteren son bir nokta grafiği oluşturun. Sıralamanın sonunda, numunelerin saflığını ve canlılığını onaylayın. Sıralanan hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze RPMI ortamında saymak için yeniden askıya alın.Makrofaj popülasyonlarını, 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakada, oyuk başına 100 mikrolitre tam ortam başına beş kez 10 ila dördüncü makrofajları tohumlamak için uygun konsantrasyona seyreltin. Daha sonra hücreleri en az 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. T'yi izole etmek için, knock-in fareyi sırtüstü pozisyona getirin.Önce orta çizgide bir cilt kesisi yapın, peritonu dikkatlice kesin ve cildi nazikçe ayırın. Periferik lenf düğümlerini ve dalağı toplayın ve dokuları 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine 100 mikrometrelik bir filtreye yerleştirin. 1 mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak, lenfoid dokuları filtreden hafifçe bastırın ve ağ temiz olana kadar filtreyi taze RPMI ortamıyla durulayın.Tek hücreli süspansiyonu santrifüjleme ile toplayın ve peleti iki mililitre ACK lizis tamponunda yeniden gönderin. Dört santigrat derecede beş dakika sonra, lizis tamponunu iki mililitre taze RPMI ortamı ile nötralize edin ve hücreleri santrifüjleyin. Peleti 200 mikrolitre taze ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri uygun T hücresi yüzey boyama antikorları ile süzmek için beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.Işıktan korunan dört santigrat derecede 45 dakika sonra, hücreleri taze RPMI ortamında iki kez yıkayın ve hücreleri tripan mavisi dışlama ile sayın. Daha sonra, CD8 ile boyanmış hücreleri, 20 santigrat derecelik bir su banyosunda beş dakika boyunca CFSE'de mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila altıncı hücreye seyreltin. İnkübasyonun sonunda, CFSE'yi iki mililitre RPMI ortamı ile nötralize edin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.Hücreleri, mililitre RPMI orta konsantrasyonu başına 10 ila altıncı CD8 lekeli T hücresinde bir kez yeniden askıya alın ve tüm hücre örneklerini 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplere süzün. Daha sonra hücreleri DAPI ile etiketleyin ve akış sitometresini az önce gösterildiği gibi sıralama için hazırlayın. CD4 pozitif T hücresi izolasyonu için, enkaz ve büyük granüler miyeloid hücreler hariç, lenfositler üzerinde geçit oluşturmak için bir ileri ve yan saçılma nokta grafiği oluşturun.Bu üst geçitten, DAPI'ye karşı yan saçılmayı görüntüleyen bir nokta grafiği oluşturun ve DAPI negatif hücrelerinde geçit oluşturun. Bu yeni geçitli popülasyonda, yan saçılmayı ve CD4'ü görüntüleyen bir nokta grafiği ve CD8'i CFSE'ye karşı görüntüleyen bir nokta grafiği oluşturun. Sonra kapılı T hücresi popülasyonlarını sıralayın.Sıralamanın sonunda, numunelerin saflığını ve canlılığını onaylayın ve hücreleri sayım için santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 96 saatlik bir ko-kültür için her bir makrofaj oyuğuna mililitre RPMI konsantrasyonu başına 10 ila altıncı T hücresi ve tam RPMI ortamında 100 mikrolitre T hücresine seyreltin. Son olarak, T hücrelerini aktive etmek ve genişletmek için her bir oyuğa beş mikrolitre PBS yıkama T hücresi aktivatörü CD3 CD28 manyetik boncuk ekleyin.Tolerize alıcılardan elde edilen Ly6Clo Ly6G-macraphages, CD8 pozitif T hücreleri üzerinde baskılayıcı bir etki gösterir ve Ly6C ara ürünü Ly6CG pozitif hücrelerden de gözlenen mütevazı bir baskılayıcı aktivite gösterir. Bununla birlikte, sadece Ly6Clo Ly6G hücreleri, CD4 pozitif Foxp3 pozitif TReg'in in vitro genişlemesini teşvik eder. Birlikte, bu veriler greft sızan CD11B pozitif Ly6Clo Ly6G negatif makrofajların, CD8 T hücresi proliferasyonunu inhibe etme ve CD4 pozitif Foxp3 pozitif TReg genişlemesini teşvik etme yetenekleri de dahil olmak üzere, monosit türevli baskılayıcı hücrelerle ilişkili olduğu bildirilen özelliklerin çoğuna sahip olduğu sonucunu desteklemektedir.Bu prosedürü denerken, her bir makrofaj alt kümesinin baskılayıcı kapasitesi hakkında kesin veriler oluşturmak için saflığı korumak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen farklı lökosit popülasyonlarını izole etmek için ticari zenginleştirme kapılarının kullanılması gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Makrofaj sıralaması, bu prosedürün en uzun kısmıdır, ancak ustalaştığında, tekniğin bu kısmı uygun şekilde yapılırsa sekiz saat içinde tamamlanabilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların, katı organ nakli simülasyon modelinde makrofajlara sızmanın baskılayıcı kapasitesini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, fare kalbi allografından seçilen farklı makrofaj popülasyonlarının nasıl karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

functional-characterization-regulatory-macrophages-that-inhibit-graft

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Makrofajlar homeostasis merkezi bir rol oynar ve birçok dokularda patoloji. Burada sunulan protokol makrofajlar tüketen için kullanılan yöntemleri...

Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Burada murin peritoneal makrofajları izole etmek için basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu prosedürü, Toll benzeri reseptörlerin uyarılması üzerine gen ekspresyon analizi yapmak için RNA ekstraksiyonu takip eder.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

Farelerde aort interpozisyon greftlemesi için bir protokol açıklıyoruz. Protokolün amacı, arterlerdeki alloimmün reaksiyonlar ve organ nakli başarısızlığına katkıda bulunan ortaya çıkan arteriyel değişikliklerle ilgili patolojik süreçleri ve terapötik stratejileri incelemek için bir model sağlamaktır.

Aloimmün kaynaklı Vasküler Reddi ve Nakli arterioskleroz Fare Modeli

Burada, naif ve kronik lenfositik koryomenenjit virüsü ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T (Treg) hücrelerinin fenotipini analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, Treg hücrelerinin baskılayıcı aktivitesini değerlendirmek için bir süreç sunuyoruz.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Burada, hoşgörü Ekiminde teşvik ve içinde in vitro ve in vivo değerlendirmek için bir protokol farklı hücre alt kümeleri alıcıdan gelen süpresif kapasitesi ve donör veya eksojen antijenleri doğru alıcının bağışıklık durumu mevcut.

Vitro ve In Vivo değerlendirme T, B ve Myeloid hücrelerin süpresif etkinlik ve nakli alıcılardan gelen Humoral yanıt

Antikor bazlı ilaçlara inflamatuar hastalıkları tedavisinde devrim. Belirli hedefleri üzerinde doğrudan etkileri sahip olmanın yanı sıra, antikorlar makrofajlar anti-inflamatuar olmak için etkinleştirebilirsiniz. Bu protokolü nasıl anti-inflamatuar makrofaj açıklar harekete geçirmek-ebilmek var olmak istimal fare kemik iliği makrofajlar ve Periton makrofajlar kullanarak içinde vivo biçilen in vitro .

Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Protokol histopatolojik tetkik ve folat reseptör beta makrofaj ve toplam bağışıklık hücre ilişki içinde dev hücreli arterit temporal arter biyopsisi sızmak profiline immünhistokimya kullanımını göstermektedir.

Folat reseptör Beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık Microenvironment profil için bir Immunohistopathologic çalışma

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Monositler ve makrofajlar, sağlık ve hastalık için çok önemli olan çok plastik ve yeniden programlanabilir bağışıklık hücreleridir. Belirli farklılaşma programları ve fenotipleri benimseyerek çok çeşitli uyaranları algılar ve bunlara yanıt verirler. Makrofaj polarizasyonunu ve yeniden programlamayı incelemek için bir in-vitro modeli standartlaştırdık ve araştırma için değerli bir araç sağladık.

İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

Öğrenin, allogreft kalplerden izole edilen makrofaj popülasyonlarını fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize etme tekniklerini. Bu yöntem, transplantasyon biyolojisinde bağışıklık yanıtlarını anlamak ve greft sağkalımını iyileştirmek için kritik öneme sahiptir.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet