İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu
8 Ekim 2016
İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.
Bu prosedürün genel amacı, insan kalp dokusundan multipotent perivasküler öncü hücrelerin iki ayrı popülasyonunu izole etmektir. Bu yöntem, perivasküler hücre popülasyonunun alt kümelerinin bu sürece yaptığı katkı gibi kardiyak rejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, heterojenliğin azalmış progenitör hücre popülasyonları ve bir dizi ana ex-adezyon tekniğinin gelişmiş canlılığı ile sonuçlanmasıdır.
Bu tekniğin iskemik kalp hastalığının tedavisinde etkileri vardır, çünkü perivasküler kök hücre alt tiplerinin kardiyomiyojenik potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Bu yöntem, perivasküler hücrelerin kardiyak rejenerasyondaki rolü hakkında fikir verebilse de, miyokardiyal fibroz gibi kalp hastalığının diğer yönlerinin araştırılmasına da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, doku tazeliğinin bir sonucu olarak canlı hücre kullanımı nedeniyle mücadele edeceklerdir.
Bu işleme başlamak için, perikard, ana damarlar ve kulakçıkları çıkardıktan sonra, numuneyi bir petri kabındaki yıkama ortamına yerleştirin. Daha sonra, ventriküler miyokard'ı yaklaşık bir milimetreküplük küçük parçalar halinde kesin ve en yüksek hücre verimini elde etmek için hemen işleyin. Daha sonra taze sindirim solüsyonu hazırlayın ve bir su banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın.
Daha sonra askıda kalan doku parçalarını 100 mikronluk bir süzgeçten süzün ve PBS ile iki kez yıkayın. Doku parçalarını, sıkıca kapatılmış bir kapağı olan 30 mililitrelik steril bir kaba aktarın. Sindirim solüsyonunu ekleyin ve kabı kapalı bir plastik torba içinde 37 santigrat derece çalkalayarak 120 RPM'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin.
15 dakika sonra kabı üç kez ters çevirin. Ardından, 15 dakika daha su banyosuna geri koyun. Daha sonra,% 20 FBS ile desteklenmiş beş mililitre DMEM ile kollajenazları çıkarın ve söndürün.
Daha sonra, herhangi bir doku kümesini parçalamak için 10 mililitrelik serolojik pipetle 10 ila 20 kez hafifçe pipetleyerek sindirilmiş dokuyu ezin. Daha sonra, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için süspansiyonu sırayla 100 mikron, 70 mikron ve son olarak 40 mikron hücre süzgeçlerinden süzün. Bunu takiben, hücre süspansiyonunu dört dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve peleti, dört mililitre yıkama ortamı ile seyreltmeden önce oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir mililitre kırmızı hücre parçalama tamponunda yeniden süspanse edin. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve peleti bir mililitre yıkama ortamında yeniden süspanse edin. Bir ila 10 hücre süspansiyonu seyreltmesi yapmak için 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 90 mikrolitre yıkama ortamı ile seyreltin.
Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini 10 mikrolitre tripan mavisi lekesi ile karıştırın ve karışımın 10 mikrolitresini hücre sayımı için standart bir hemositometreye yerleştirin. Bu prosedürde, hücre süspansiyonuna 50 mikrolitre fare serumu ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını bloke etmek için 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu dört dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
Süpernatanı çıkarın ve yıkama ortamında tekrar süspanse edin. Daha sonra, izotip ve boyanmamış kontroller için iki polistiren yuvarlak alt akış sitometri tüpünün her birine 50 mikrolitre hücre süspansiyonu alikot edin ve kalan hacmi çok renkli boyama için üçüncü bir tüpe yerleştirin. Çok renkli boyama için tek hücreli süspansiyona beş antikor ekleyin.
Antikorları hücrelerle karıştırmak için nazikçe pipetleyin ve tüm tüpleri karanlıkta 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Beş akış sitometri tüpünde 100 mikrolitre yıkama ortamına bir damla pozitif boncuk ekleyerek kompanzasyon kontrol boncuklarını hazırlayın. Antikorları beş tüpün her birine ayrı ayrı ekleyin.
Ardından, tüm tüpleri karanlıkta 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, her biri 500 mikrolitre EGM-2 kültür ortamı içeren hücre toplama tüplerini hazırlayın ve bunları dört santigrat dereceye yerleştirin. Antikor inkübasyonunu takiben, bağlanmamış antikorları çıkarmak için hücreleri ve boncukları yıkamak için beş mililitre yıkama ortamı ekleyin.
Tüm tüpleri dört dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Yıkama ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın ve süpernatanı dikkatlice boşaltın. Daha sonra, hücreleri yıkama ortamında 250 mikrolitre başına 10 ila 6. hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.
Daha sonra, boncukları 100 mikrolitre yıkama ortamında tekrar süspanse edin. Hücre ve boncuk süspansiyonlarını karanlıkta buz üzerindeki hücre sıralayıcıya aktarın. Pozitif boncuk kompanzasyon kontrol tüplerine bir damla negatif boncuk ekleyin ve bunları floresan telafisini ayarlamak için kullanın.
Ardından, arka plan floresansını oluşturmak ve voltajları ayarlamak için boyanmamış kontrol hücrelerini çalıştırın. Daha sonra, spesifik olmayan bağlama ile ilgili arka plan floresan eşiklerini belirlemek için kontrol izotiplerini çalıştırın. Çok renkli lekeli numuneyi çalıştırın ve perisit ve adventisyel hücre popülasyonlarını toplama tüplerine toplayın.
Bu prosedürde, büyüme alanının santimetre karesi başına 100 mikrolitre steril% 0.2 jelatin çözeltisi ekleyin ve tüm kuyucukları kaplamak için manuel olarak çalkalayın. Bundan sonra, plakaları 10 dakika boyunca dört derece Celsisu'da inkübe edin. Ardından jelatin çözeltisini tamamen çıkarın.
Kültür plakalarını hazırlarken toplanan hücreleri buz üzerinde tutun. Daha sonra, taze toplanan hücreleri 200 x g'da dört dakika santrifüjleyin ve hücre peletini uygun miktarda EGM-2 içinde nazikçe yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri jelatin kaplı plakalar üzerine tohumlayın.
Bu şekilde, canlı hücreler önce CD45 pozitif hücreleri, ardından CD56 pozitif hücreleri dışlayacak şekilde kapılandı. CD144 pozitif endotel hücreleri daha sonra CD56 negatif fraksiyondan çıkarıldı. Bu son popülasyondan CD146 pozitif, CD34 negatif perisitler ve CD146 negatif, CD34 pozitif adventitial hücreler seçildi ve daha sonra toplandı.
FACS ile saflaştırılmış miyokardiyal perisitlerin ve adventisyel hücrelerin her iki kültürü, hücre morfolojisini yıldız yapmak için bir iğ sergiler. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık beş saat sürecektir. Bu prosedürü denerken, en taze numunelerin en iyi canlı hücre verimini sağlayacağını unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, bu hücrelerin iskemik kalp hastalığının tedavisine uygunluğu gibi ek soruları yanıtlamak için hücresel kardiyomiyoplasti gibi başka yöntemler de uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, insan kalp dokusundan iki farklı çok potansiyelli perivasküler öncü hücre popülasyonunu izole etmek için bir yöntem sunmaktadır. Teknik, kalp yenilenmesi ve bu süreçteki perivasküler hücrelerin rolü hakkındaki anlayışı geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kalp yenilenmesi
- Kök hücre biyolojisi
- Perivasküler hücre popülasyonları
Arka Plan
- İnsan kalp dokusu çok potansiyelli perivasküler öncü hücreler içerir.
- Bu hücreler miyokardiyal yenilenme sürecine katkıda bulunabilir.
- Çalışma, CD146 + CD34 - perisitiler ve CD34 + CD146 - adventisyal hücrelere odaklanmaktadır.
- Bu popülasyonları anlamak, iskemik kalp hastalığı için terapiler hakkında bilgi sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Spesifik perivasküler hücre popülasyonlarını izole etmek ve saflaştırmak.
- Kalp yenilenmesine katkılarını araştırmak.
- İzole edilen hücrelerin heterojenliğini azaltmak ve canlılığını artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- CD146 + CD34 - perisitiler ve CD34 + CD146 - adventisyal hücrelerin izolasyonu.
- Ana ex-adezyon tekniklerinin uygulanması.
- Hücre canlılığı ve heterojenitesinin değerlendirilmesi.
- Miyokard fibrozisi araştırmasına potansiyel uygulama.
Ana Sonuçlar
- İki farklı perivasküler hücre popülasyonunun başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Geleneksel yöntemlere göre progenitör hücrelerin artan canlılığı.
- Perivasküler hücrelerin kalp yenilenmesindeki rolüne dair içgörüler.
- Yöntemin diğer kalp hastalığı araştırmalarına uygulanabilirliği.
Sonuçlar
- Teknik, kalp yenilenmesi mekanizmalarına dair anlayışı artırır.
- İskemik kalp hastalığı için terapilerde ilerlemelere yol açabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, kalp sağlığı için daha geniş etkileri inceleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating defined perivascular precursor cell populations from human myocardium enables mechanistic de-risking in cardiac regeneration research by reducing cellular heterogeneity and improving viability. This approach supports target validation and phenotypic screening for ischemic heart disease therapies by providing reproducible, disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in preclinical models through standardized isolation of CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding perivascular cell contributions to cardiac regeneration.
- Operational Value: Reduces biological noise through prospective isolation of homogeneous multipotent precursor subpopulations.
- Strategic Value: Supports target de-risking by clarifying functional roles of specific perivascular subsets in myocardial repair pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with defined surface marker profiles for consistent compound screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via FACS-based purification of pericyte and adventitial cell populations.
- Strategic Value: Facilitates scalable platform reuse for evaluating drug effects on cardiac progenitor cell function and viability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human cardiac cell models for investigating myocardial fibrosis and ischemic injury mechanisms.
- Operational Value: Enables translational continuity from discovery to preclinical validation using clinically relevant perivascular subsets.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by improving predictive value of preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying purified perivascular precursor cells for hypothesis testing in early discovery, assay-ready cells for screening applications, and translationally relevant models for preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through isolation of defined perivascular cell populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell suspensions with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of cell viability, purity, and functional readouts following isolation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human-derived, disease-relevant cardiac progenitor cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable FACS-based isolation platform applicable across cardiac disease models and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in perivascular cell function.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cardiac progenitor cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency through better target validation and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac regeneration programs based on validated precursor cell activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell sorting, and primary tissue handling.
- Dependent on access to FACS instrumentation, antibody panels, and sterile cell culture infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different tissue sources or disease models.
- Limited by tissue freshness requirements, as viable cell yield declines with sample degradation.
