İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, insan kalp dokusundan iki ayrı multipotent perivasküler öncül hücre popülasyonunu izole etmektir. Bu yöntem, perivasküler hücre popülasyonunun alt kümelerinin bu sürece yaptığı katkı gibi, kardiyak rejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, seçili başlıca ekzosyon tekniklerine kıyasla, daha düşük heterojenliğe sahip progenitör hücre popülasyonları ve artırılmış canlılık sağlamasıdır.

Perivasküler kök hücre alt tiplerinin kardiyomiyojenik potansiyele sahip olduğu gösterildiğinden, bu tekniğin iskemik kalp hastalığı tedavisinde etkileri olabilir. Bu yöntem, perivasküler hücrelerin kardiyak rejenerasyondaki roluna dair içgörü sağlayabilmenin yanı sıra, miyokardiyal fibrozis gibi kalp hastalığının diğer yönlerinin araştırılmasında da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, doku tazeliğine bağlı olarak canlı hücre kullanımı nedeniyle zorluk yaşayabilirler.

Bu prosedüre başlamak için, perikard, ana damarlar ve atriyumlar çıkarıldıktan sonra, numuneyi bir petri kabındaki yıkama ortamına yerleştirin. Ardından, ventriküler miyokardiyumu yaklaşık bir kübik milimetrelik küçük parçalara ayırın ve en yüksek hücre verimini elde etmek için bunları hemen işleyin. Daha sonra, taze sindirim solüsyonu hazırlayın ve bunu bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.

Ardından, süspansiyondaki doku parçalarını 100 mikronluk bir süzgeçten geçirin ve PBS ile iki kez yıkayın. Doku parçalarını, sıkıca kapatılan kapaklı steril 30 mililitrelik bir kaba aktarın. Digestyon solüsyonunu ekleyin ve kabı, kapalı bir plastik poşet içinde 120 RPM'ye ayarlanmış 37 degrees Celsius sıcaklığındaki sallamalı su banyosuna yerleştirin.

15 dakika sonra, kabı üç kez tersyüz edin. Ardından, kabı tekrar 15 dakika daha su banyosuna yerleştirin. Sonrasında kabı çıkarın ve kollajenazları %20 FBS ile desteklenmiş beş mililitre DMEM ile söndürün.

Ardından, doku kümelerini parçalamak için 10 mL'lik bir serolojik pipetle 10 ila 20 kez nazikçe pipetleme yaparak sindirilmiş dokuyu tritüre edin. Daha sonra, tek hücre süspansiyonu elde etmek için süspansiyonu sırasıyla 100 mikron, 70 mikron ve son olarak 40 mikronluk hücre süzgeçlerinden geçirin. Bunu takiben, hücre süspansiyonunu 200 x g'de dört dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı dikkatlice dökün ve pelletini, dört mililitre yıkama ortamı ile seyreltmeden önce, oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir mililitre kırmızı kan hücresi liz tamponunda yeniden süspande edin. Santrifüj aşamasını tekrarlayın ve pelletini bir mililitre yıkama ortamında yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonunun 1/10 oranında seyreltimini hazırlamak için 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 90 mikrolitre yıkama ortamı ile seyreltin.

Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 10 µL'sini 10 µL trypan blue boyası ile karıştırın ve hücre sayımı için karışımın 10 µL'sini standart bir hemositometreye yerleştirin. Bu prosedürde, spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için hücre süspansiyonuna 50 µL fare serumu ekleyin ve 4 °C'de 20 dakika inkübe edin. Ardından, hücre süspansiyonunu 200 x g'de dört dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve yıkama ortamında yeniden süspande edin. Ardından, izotip ve boyanmamış kontroller için hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini iki polistiren yuvarlak tabanlı akış sitometrisi tüpünün her birine paylaştırın ve kalan hacmi çok renkli boyama için üçüncü bir tüpe aktarın. Çok renkli boyama için tek hücre süspansiyonuna beş antikor ekleyin.

Antikorları hücrelerle karıştırmak için nazikçe pipetleyin ve tüm tüpleri dört derece Celsius'ta, karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. Beş akış sitometrisi tüpündeki 100 mikrolitre yıkama ortamına bir damla pozitif boncuk ekleyerek kompanzasyon kontrol boncuklarını hazırlayın. Antikorları beş tüpün her birine ayrı ayrı ekleyin.

Ardından, tüm tüpleri 4 °C'de 20 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. Bu sırada, her biri 500 µL EGM-2 kültür medyumu içeren hücre toplama tüplerini hazırlayın ve bunları 4 °C'ye yerleştirin. Antikor inkübasyonunun ardından, bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak amacıyla hücreleri ve boncukları yıkamak için 5 mL yıkama medyumu ekleyin.

Tüm tüpleri 200 x g hızda dört dakika boyunca santrifüjleyin. Yıkama ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın ve süpernatanı dikkatlice dökün. Ardından hücreleri, 250 µL başına 1 × 10⁶ hücre konsantrasyonunda yıkama besiyerinde yeniden süspande edin.

Ardından, boncukları 100 µL yıkama ortamında yeniden süspande edin. Hücre ve boncuk süspansiyonlarını buz üzerinde ve karanlıkta hücre ayırıcıya transfer edin. Pozitif boncuk kompanzasyon kontrol tüplerine bir damla negatif boncuk ekleyin ve floresan kompanzasyonunu ayarlamak için bunları kullanın.

Ardından, arka plan floresansını belirlemek ve voltajları ayarlamak için boyanmamış kontrol hücreleri çalıştırın. Sonrasında, spesifik olmayan bağlanma ile ilgili arka plan floresans eşiklerini belirlemek için kontrol izotipleri çalıştırın. Çok renkli boyanmış örneği çalıştırın ve perisit ile adventisiyal hücre popülasyonlarını toplama tüplerine toplayın.

Bu prosedürde, büyüme alanı başına santimetrekare başına 100 µL steril %0,2 jelatin çözeltisi ekleyin ve kuyucukların tamamını kaplamak için manuel olarak çalkalayın. Ardından, plakaları 10 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin. Sonrasında, jelatin çözeltisini tamamen uzaklaştırın.

Kültür plakaları hazırlanırken toplanan hücreleri buz üzerinde tutun. Ardından, taze toplanmış hücreleri 200 x g'de dört dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini uygun miktarda EGM-2 içinde nazikçe yeniden süspande edin. Sonrasında, hücreleri jelatin kaplı plakalara ekimleyin.

Bu şekilde, canlı hücreler önce CD45-pozitif hücreleri, ardından CD56-pozitif hücreleri dışlamak için kapılandı. Daha sonra CD56-negatif fraksiyondan CD144-pozitif endotel hücreler çıkarıldı. Bu final popülasyondan, CD146-pozitif, CD34-negatif perisitler ve CD146-negatif, CD34-pozitif adventisyal hücreler seçildi ve ardından toplandı.

FACS ile saflaştırılmış miyokardiyal perisitlerin ve adventisyal hücrelerin her iki kültürü de iğsi veya yıldız benzeri bir hücre morfolojisi sergiler. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık beş saat sürecektir. Bu prosedür uygulanırken, en taze örneklerin en yüksek canlı hücre verimini sağlayacağını unutmak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, bu hücrelerin iskemik kalp hastalığının tedavisindeki uygunluğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla hücresel kardiyomiyoplasti gibi diğer yöntemler uygulanabilir.