Name: Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler Brucella Hela Hücrelerinin Enfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Öğrenin, mikroskopi tabanlı yüksek verimli tarama ile HeLa hücrelerinde Brucella enfeksiyonuna katılan konakçı faktörlerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu siRNA tarama yöntemi, patojen-konakçı etkileşimlerini hızlıca keşfetmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İsviçre Sistem Biyolojisi Girişimi SystemsX.ch çerçevesinde Araştırma ve Teknoloji Geliştirme (RTD) projesi InfectX ve TargetInfectX için sırasıyla 51RT 0_126008 ve 51RTP0_151029 hibeleri ile desteklenmiştir. İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan (SNSF) hibe 310030B_149886 kabul ediyoruz. S.H.L ve A.C.'nin çalışmaları, Biozentrum'un Uluslararası Doktora Programı "Mükemmellik Bursları" tarafından desteklenmiştir. Simone Muntwiler teknik yardım için teşekkür ederiz. pNF106'yı sağladığı için Dirk Bumann'a ve pJC43 ve pJC44 için Jean Celli'ye teşekkür ederiz.

<ol><li>Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+global+map+of+human+brucellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The new global map of human brucellosis.</a> Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).</li>
<li>Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+human+pathogenic+Brucella+species+with+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).</li>
<li>Guzman-Verri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+of+the+Rho+subfamily+are+required+for+Brucella+abortus+internalization+in+nonprofessional+phagocytes%3A+direct+activation+of+Cdc42%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42.</a> J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).</li>
<li>Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+intracellular+replication+requires+trafficking+through+the+late+endosomal%2Flysosomal+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment.</a> Traffic. 9, 678-694 (2008).</li>
<li>Boschiroli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brucella+suis+virB+operon+is+induced+intracellularly+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).</li>
<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
<li>Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acidification+of+phagosomes+containing+Brucella+suis+is+essential+for+intracellular+survival+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages.</a> Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).</li>
<li>Anderson, T. D., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+morphometric+analysis+of+Brucella+abortus-infected+trophoblasts+in+experimental+placentitis.+Bacterial+replication+occurs+in+rough+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum.</a> Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).</li>
<li>Ramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+large-scale+RNAi+screens+for+pathogen+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry.</a> BMC genomics. 15, 1162(2014).</li>
<li>Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+InlC+secretion+to+investigate+cellular+infection+by+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes.</a> J Vis Exp. , e51043(2013).</li>
<li>Kentner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+reroutes+host+cell+central+metabolism+to+obtain+high-flux+nutrient+supply+for+vigorous+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).</li>
<li>Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+coopts+the+small+GTPase+Sar1+for+intracellular+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).</li>
<li>von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+affairs%3A+investigating+the+Brucella+intracellular+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle.</a> FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Bakteriyel patojenler, ökaryotik konakçı hücreleri kendi çıkarları doğrultusunda manipüle etmek için çok sayıda strateji geliştirmiştir. Akut enfeksiyonlara neden olan patojenler genellikle hızlı çoğalma gösterir ve buna bağışıklık sisteminin önemli ölçüde alarma geçmesi ve enfekte olmuş hücrelerin canlılık kaybı eşlik eder. Buna karşılık, Brucella ve kronik enfeksiyonlara neden olan diğer patojenler, konakçı hücreler içinde uzun süreli etkileşimler kurmayı başarır. Bu nedenle, bakterilerin hücresel homeostazı b...

Brucella türleri α-proteobakteride sınıfına ait gram-negatif, fakültatif hücre içi patojenlerdir. Bunlar endemik bölgelerde ciddi ekonomik kayıplara neden sığır, keçi veya koyun gibi kendi doğal hosts kürtaj ve kısırlığa neden olur. Bruselloz tüm dünyada her yıl yarım milyon yeni insan enfeksiyonları üzerinde 1 yol açan en önemli zoonoz hastalıklardan biridir. insana İletim en yaygın pastörize olmamış süt gibi enfekte hayvanlarla doğrudan temas yoluyla veya kontamine gıda tüketilmesi neden olmaktadır. ateşli hastalık belirtileri bruselloz tanısında zorluklar neden olan belirsiz bulunmaktadır. Eğer tedavi edilmezse, hasta artrit, endokardit ve nöropati 2 gibi daha ciddi semptomları olan bir kronik enfeksiyon gelişebilir. Hücresel düzeyde Brucella fagositik ve fagositik olmayan hücreleri istila edebilir ve bir hücre içi içinde çoğaltırBrucella içeren yeni vakuol (BCV) olarak bilinen bölme. Bakterilerin içselleştirilmesi Rac, Rho ve Cdc42 3 direkt aktivasyonu ile aktin hücre iskeletinin düzenlenmeleri gerekmektedir. Ökaryotik konak hücre içinde, BCV endositik yolu boyunca trafik işlemlerini ve lizozomlar ile etkileşim rağmen, bakteriler bozulmasını 4 önlemek için yönetmek. Veziküler ATPaz ile BCV asitleştirilmesi bakteriyel tip IV salgılama sistemine (T4SS) 5 ekspresyonunu indüklemek için gereklidir. Brucella onun replikatif niş kurmak için T4SS salgıladığı bakteriyel efektörler hücre içi niş 7 kurulması kusurlara T4SS 6 silinmesi veya vesiküler ATPaz kurşun inhibisyonu için, gerekli olan inanılmaktadır. Bakteriler onlar kadar insan ticareti aşamasında çoğaltmak yok bir ER-kaynaklı vakuoler bölmesini 8 ulaşır. Hücre içi çoğalması meydana geldiğinde, BCV cl bulunanBu calnexin ve glukoz-6-fosfataz 6 olarak ER işaretleri ile ose birliği. Brucella bir ER-benzeri bölmeye, hücrelere girer lizozomal bozulması önler ve nihayet çoğaltır hangi moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Enfeksiyon farklı aşamalarında yer alan konak faktörleri esas hedeflenen yaklaşımlar veya Drosophila hücreleri 9 gerçekleştirilen küçük ölçekli bir küçük müdahale edici RNA (siRNA) ekran tarafından tespit edilmiştir. Bunlar, Brucella enfeksiyonu sırasında bireysel konak faktörleri katkısı ışık tutmuştur ama biz tüm sürecin kapsamlı bir anlayış uzak hala. Burada, otomatik geniş alan, flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü analizi ile kombinasyon halinde, büyük ölçekli RNA interferans (RNAi) tarama kullanılarak insan konakçı faktörlerin tanımlanmasını sağlar protokolleri sunulmaktadır. HeLa hücrelerinin ters siRNA transfeksiyon describ olarak gerçekleştirilired önce 10,11 küçük değişikliklerle. Son nokta tahlil çıkış ve komşu hücrelerin enfeksiyon dışında Brucella hücre içi yaşam döngüsünün büyük bir kısmını kapsamaktadır. daha uç nokta deneyi tanımlanan isabet karakterize etmek için, enfeksiyonun erken dönemlerinde yer faktörleri tanımlamak için değiştirilmiş bir protokol kullanılmıştır. Yapısal olarak GFP eksprese eden bir Brucella abortus suşu bakteri iki gün hücrelerini enfekte etmek için izin verilen nokta deneyi için kullanılmaktadır. Bu süre boyunca, bakteri ER-türevi replikatif niş hücreleri, trafik butonu ve peri-nükleer alanı içinde replike. GFP sinyali yüksek düzeyde daha sonra güvenli bir çoğaltma bakteriler içeren tek tek hücrelerin tespit etmek için kullanılabilir. Bir yüksek verimli bir deney Brucella giriş incelemek için, hücre içi ve hücre dışı bakteriler ayırt edebilmek için önemlidir. yöntem, burada circumv sunulmaktadırhücre içi ve hücre dışı bakteri-oranları farklı antikor boyama. Bu DsRed yapısal ifadesi ile bir arada bir tetrasiklin indüklenebilir GFP eksprese eden bir Brucella suşunun dayanır. bir kurucu DsRed markör mevcudiyeti numunede mevcut olan tüm bakteri belirlenmesini sağlar. GFP tanımı gentamisin aynı anda hücre dışı bakteri inaktivasyonu ile toksik olmayan tetrasiklin analog anhydrotetracycline (ATC) ilave (GM) tarafından indüklenir. Hücre geçirmez antibiyotik Gm dışı bakterileri öldürür iken, ATC konak hücre içine girer ve hücre içi bakteriler seçici GFP ifade uyarabilir. Bu ikili raportör geniş alan mikroskopi kullanılarak hücre dışı bakteriler (sadece DsRed sinyali) ile ilgili bir hücre içi bakteri (GFP ve DsRed sinyali) sağlam ayrılmasını sağlar. Hücre içi Brucella ile tespit GFP ifade ulaşmak için biz ATC tarafından indüksiyon 4 saat bir dinleri sonuçlanır buldukmümkün sinyali. Seçici hücre içi bakteriler GFP ifade Benzer indüksiyon şemaları hücre içi Shigella 12 incelemek için önceden kullanılır olmuştur.

<table><tbody><tr><td>Triptik Soya Agar (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Triptik Soya Suyu (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml vidalı kapaklı şişe</td><td>Corning</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Isıyla İnaktive</td></tr><tr><td>Edilmiş Tripsin-EDTA (%0,5)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x stok çözeltisi, PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Hücre Sayacı</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td> içinde 1:10 oranında seyreltin <td>Alternatif hücre sayma cihazları kullanılabilir</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 kuyucuklu plaka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>Soyulabilir alüminyum folyo</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif dağıtıcısı: "Multidrop 384 Reaktif Dağıtıcısı"</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td><td>Alternatif reaktif dağıtıcısı kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Transfeksiyon reaktifi: "Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik plaka yıkayıcı: "Plaka yıkayıcı ELx50-16"</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>Bu plaka yıkayıcı, 384 kuyulu plakalar için uygun 16 kanallı bir manifold içerir. Bir biyogüvenlik kabinine sığar ve yıkama sırasında plakayı kaplayan bir kapağa sahiptir, bu da aerosol üretimi riskini azaltır. Benzer özelliklere sahip alternatif plaka yıkayıcıları kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Anhidrotetrasiklin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 & # 956; % 100 etanol içindeki g / ml çözeltisi -20 ° C'de tutulur; C alüminyum folyo</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>içinde ışıktan korumalı 0.2 M HEPES tamponunda çözün, pH 7.4. -20 ° C'de saklayın; C ve kullanmadan bir gün önce taze olarak çözdürün. Dikkat, PFA solunduğunda, cilt ile temas ettiğinde ve yutulduğunda toksiktir.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Şifreli siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Yapı: pJC44 4 EcoRI ile sindirildi, ardından Klenov enzimi ile künt uçlar oluşturuldu ve ardından SalI ile sindirildi. TetR-GFP, prAC090 ve prAC092 primer kullanılarak pNF106'dan amplifiye edildi. SalI ile sindirimi takiben, TetR-GFP ürünü sindirilmiş pJC44 vektörüne bağlandı.</td></tr><tr><td>Astar prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC</td></tr><tr><td>HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Mikro</td><td>Moleküler Cihazlar&nbsp;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>Hassas motorlu Z-tablası ile donatılmış otomatik hücresel görüntüleme mikroskobu. Otomatik mikroskopi için alternatif sistemler ve aşağıda belirtilen donanım ve yazılım için alternatif bileşenler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Lazer Otomatik Odaklamalı</td><td>Moleküler Cihazlar&nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>CFI Süper Fluor 10X objektif</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prizma: 10X, Yaylı</td></tr><tr><td>Fotometri CoolSNAP HQ Tek Renkli CCD Kamera</td><td>Moleküler Cihazları&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1.392 x 1.040 görüntüleme pikseli, 6,45 x 6,45 ve mikro; m piksel, 12 bit sayısallaştırma</td></tr><tr><td>MetaXpress yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lümen</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>Hafif motor. Aşağıdaki ışık kaynakları kullanılır: mor (DAPI), camgöbeği (GFP), yeşil/sarı (RFP)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td>için</tr><tr><td>Tek Bant Uyarıcı DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>için Tek Bant Dikroik DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr>GFP <td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için Tek Bant UyarıcıGFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td>için</tr><tr><td>Tek Bant Dikroik GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr> için <tr><td>Tek Bant Uyarıcı RFP için Tek Bant Uyarıcı</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>RFP için Tek Bant Verici</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr>RFP <td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td> <td>için Tek Bant Dikroik</td></tr></tbody></table>

yer alan ana faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; brucella</em&gt; hela hücrelerinin enfeksiyon

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella türleri doğal olarak ana hayvanları enfekte fakültatif hücre içi patojenlerdir. insanlara İletim en sık enfekte hayvanlarla doğrudan temas yoluyla veya kontamine gıda tüketilmesi neden olmaktadır ve şiddetli kronik enfeksiyonlara yol açabilir. Brucella profesyonel ve profesyonel olmayan fagositik hücreleri istila ve endoplazmik retikulum (ER) türevi vakuollerde içinde çoğaltır olabilir. ER-benzeri bölmeye Brucella konakçı hücreler içine giriş lızozomal degradasyon kaçınma ve replikasyon için gereken ana faktörler büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada HeLa hücrelerinde Brucella giriş ve replikasyonda rol oynayan konak faktörleri tanımlamak için iki analizler açıklanmaktadır. Alternatif tarama yöntemleri uygulanabilir ise protokolleri, RNA interferansı kullanımını tarif eder. deneyler, floresan etiketli bakterilerin saptanması otomatik kullanarak floresan etiketli konakçı hücreler dayanmaktadırgeniş alan mikroskobu. floresan görüntüler tek bir hücre bazlı enfeksiyonu puanlama sağlar CellProfiler standart bir görüntü analiz boru hattı kullanılarak analiz edilir. uç nokta deneyi olarak, hücre içi çoğaltma enfeksiyondan iki gün sonra ölçülür. Bu çoğalma başarıyla böylece güçlü konak hücreler içinde çoğaldı olacak bir hücre içi niş kurduk bakteriyel giriş. Brucella sonra 12 saat civarında başlatılan onların replikatif niş trafik bakterileri sağlar. hücre içi bakteri büyük ölçüde bireysel hücre dışı ya da hücre içi replikatif olmayan bakteri sayıca bu yana, kurucu GFP eksprese eden bir suş kullanılabilir. Güçlü GFP sinyali daha sonra enfekte olmuş hücreleri tanımlamak için kullanılır. Buna karşılık, giriş analizi için hücre içi ve hücre dışı bakteriler arasında ayırt etmek için gereklidir. Burada, bir tetrasiklin-indüklenebilir GFP için bir suş kodlaması kullanılır. indüksiyonGentamisin ile hücre dışı bakterilerin eşzamanlı inaktivasyonu ile GFP tek hücre içi bakteriler GFP ifade edememek ile, hücre içi ve GFP sinyaline dayalı dışı bakteriler arasındaki farklılaşma sağlar. hücre içi çoğalması başlamadan önce bu tek hücre içi bakteri sağlam algılanmasını sağlar.

Şekil 1A, otomatik olarak uç nokta deneyi enfekte hücreleri tanımlamak için kullanılan görüntü analizinin bir örneği göstermektedir. DAPI ile boyanmış HeLa hücrelerin çekirdekleri tespit edildi, 25 piksel çekirdeğin uzantısı çekirdeğini çevreleyen 8 piksel genişliğinde bir peri-çekirdek ve bir Voronoi hücre gövdesi hesaplandı. bakteriler esas olarak peri-nükleer bir alanda prolifere için, hücrenin, bu alanda GFP yoğunluğu enfekte olan ve olmayan enfekte olmuş hücrelerde ...

Brucella enfeksiyonunda rol oynayan konak faktörlerinin mikroskopi tabanlı yüksek verimli taraması için iki test tanımlanmıştır. Giriş testi, Brucella girişi için gerekli olan konak faktörlerini ve hücre içi replikasyon için gerekli olanları uç nokta testini tespit eder. Alternatif yaklaşımlar için uygulanabilir olsa da, protokolleri göstermek için HeLa hücrelerinde siRNA taraması kullanılır.

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Bu yüksek kapasiteli mikroskopi tabanlı assay'in genel amacı, HeLa hücrelerinin Brucella enfeksiyonunda yer alan konakçı faktörlerini belirlemektir. Bu yöntem, hücre içi patojen Brucella tarafından kolonizasyonu teşvik eden veya önleyen konakçı proteinlerinin tanımlanması gibi, konakçı-patojen etkileşimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, veteriner laboratuvarından görüntü analizine kadar uzanan yarı otomatik iş akışının, robotların kullanımına ve verimli yüksek kapasiteli deneylerin oluşturulmasına olanak tanımasıdır.Böylece bu yöntem, siRNA taramaları kullanarak Brucella konak etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilir. Protokolün büyük bir kısmı diğer tarama stratejileri için de uygulanabilir; örneğin siRNA kütüphaneleri için.HeLa hücreleri kültüre alındıktan ve siRNA'lar ile tarama plakaları metin protokolüne göre hazırlandıktan sonra, siyah bir 384 kuyucuklu plaka oda sıcaklığında 300 ×g'de 20 dakika santrifüj edilerek çözdürülür. Oda sıcaklığındaki FCS içermeyen DMEM kullanılarak transfeksiyon medyumu hazırlanır. Transfeksiyon reaktifi 1:200 oranında seyreltilir ve kullanmadan önce dikkatlice karıştırılır.Bir reaktif dağıtıcı kullanarak 384 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 25 µL transfeksiyon medyumu ekleyin ve plakayı ileri geri hareket ettirerek çözeltileri karıştırın. siRNA transfeksiyon reaktifi kompleks oluşumuna izin vermek için plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bu sırada, kültür medyumunu aspire ederek ve 75 cm²'lik bir flasktaki subkonfluan hücreleri bir kez yıkamak için 2,5 mL PBS içinde %0,05 trypsin EDTA ekleyerek HeLa hücrelerini hazırlayın.Ardından 1.5 milliliters taze tripsin ekleyin ve hücreler yuvarlaklaşana kadar flaskı iki ila üç dakika boyunca 37 degrees Celsius'ta bekletin. Hücreleri yeniden süspand etmek için 10 milliliters ön ısıtılmış dmem %60 FCS kullanın. Daha sonra, %16 FCS içeren dmem içinde mililitre başına 10,000 hücreden oluşan bir hücre süspansiyonu hazırlamadan önce hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayıcı kullanın.Transfeksiyon reaktifi içeren her bir kuyucuğa 50 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Bu işlem, kuyucuk başına 500 hücre düşmesini sağlayacaktır. Hücrelerin eşit şekilde dağılması için plakayı ileri geri hareket ettirin.Ardından, hücrelerin çökmesine izin vermek için plakayı oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletin. Plakayı mühürlemek için parafilm kullanın. Ve 72 saat boyunca, 37 °C sıcaklıkta, %5 CO2 içeren, önceden ısıtılmış bir alüminyum plaka üzerindeki nemli bir inkübatörde inkübe edin.Sınıf üç patojen B.abortus ile çalışmak tehlikelidir ve koruyucu tulum, koruyucu eldiven, maske ve gözlük takılmasını içeren yerel biyogüvenlik düzenlemelerine uyulması gerekir. Enfeksiyondan bir gün önce, önceden belirlenmiş miktardaki B.abortus başlangıç kültürünü 250 mililitrelik vidalı kapaklı bir şişede 50 mililitre TSB KM besiyerine inoküle edin.Şişeyi kapatmak için parafilm kullanın ve bakterileri 37 °C'de, bir çalkalayıcıda 100 RPM hızında, 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk 0,8 ila 1,1 olana kadar gece boyunca büyütün. Bakteri kültürünün 600 nm optik yoğunluğunu ölçün. Ardından, istenen enfeksiyon çokluğunu elde etmek için bakteri kültürünü %10 FCS içeren DMEM içinde seyrelterek enfeksiyon ortamını hazırlayın.Veya MOI. Otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak transfeksiyon medyumunu 50 µL enfeksiyon medyumu ile değiştirin. Steril kabin içerisinde plakayı santrifüj kafesine yerleştirin ve 384 kuyucuklu plakayı 400 ×g ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, plakayı mühürlemek için parafilm kullanın ve plakayı 37 °C ve %5 CO2 sıcaklığındaki önceden ısıtılmış bir alüminyum plaka üzerinde dört saat boyunca inkübe edin. Otomatik plaka yıkayıcı ile yapılan inkübasyonun ardından, hücre dışı bakterileri inaktive etmek amacıyla hücreleri yıkamak için 100 µg/mL dentrimysen veya GM içeren %10 FCS'li DMEM kullanın. Daha sonra, plakayı mühürlemek için parafilm kullanın ve bitiş noktası analizi için plakayı inkübatördeki önceden ısıtılmış alüminyum plaka üzerine tekrar yerleştirerek 40 saat daha bekletin.Hücreleri sabitlemek için önce kuyucukları yıkamak amacıyla PBS kullanın. Ardından, PBS'yi pH 7.4'te %3,7'lik PFA (50 µL) ile değiştirin.Ve hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, fiksasyon ortamını değiştirmek için 50 µL PBS kullanın. Numuneleri otomatik plaka yıkayıcı ile boyamak için, hücreleri permeabilize etmek amacıyla önce 10 dakika boyunca PBS içinde %1 Triton X-100'den 50 µL kullanarak başlayın.Hücreleri üç kez PBS ile yıkadıktan sonra, mililitre başına bir mikrogram DAPI içeren 50 µL PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücreleri ışıktan korumadan önce üç kez PBS ile yıkayın. Plağı otomatik mikroskoba aktarın.Mikroskop parametrelerini ayarlayın. 10-X objektifi seçin. Ardından, 384 kuyucuklu plakaya karşılık gelen plaka formatını seçin.Kuyu başına dokuz bölge edinin. Lazer tabanlı odaklamayı etkinleştir seçeneğini seçin. Ardından, plaka ve kuyu tabanına odaklanın.Ardından, örnek bulma için ilk kuyucuğu başlangıç kuyucuğu olarak ve site odaklaması (autofocus) için tüm bölgeleri belirleyin. Sonra, DAPI kanalı için odak Z ofsetini manuel olarak ayarlayın. Daha sonra, odağı kuyucuk tabanına ayarlamak için Örneği Bul (Find Sample) düğmesine basın.Pozlama süresi için iyi bir tahmin elde etmek amacıyla AutoExposure işlevini kullanın. Düşük aşırı pozlamayla geniş bir dinamik aralık sağlamak için DAPI kanalı pozlama süresini manuel olarak düzeltin. Plaka boyunca çeşitli bölgeleri görüntülemek için bu pozlama süresini kullanın.Ardından, en parlak pikseller bölgeler üzerindeki maksimum parlaklığın yaklaşık %80'ine ulaşana kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın. Odak ve pozlama süresini ayarlama adımlarını diğer tüm kanallar için de uygun şekilde tekrarlayın. Daha sonra, tüm plağın görüntüleme işlemine başlayın.Bitiş noktası analizi için tüm plakayı görüntülemek amacıyla DAPI ve GFP kanallarını kullanın. Bitiş noktası analizindeki boyanmış hücreler üzerinde bir görüntü analizi gerçekleştirmek için, bir gölgeleme modeli hesapladıktan sonra, metin protokolündeki Görünüm çıktı ayarları altındaki talimatlara göre görüntülerin bulunduğu giriş klasörünü ve sonuçların yer alacağı bir çıktı klasörünü seçin. Ardından, görüntülerin ortak olarak sahip olduğu metni tanımlayın ve gölgeleme modellerini yükleyin.Test modunu başlat (Start test mode) düğmesine tıklayın ve tüm modüller için duraklatma ve görüntüleme ayarlarının devre dışı olduğundan emin olun. Dokuzuncu modül olan ImageMath için duraklatma ve görüntüleme ayarını etkinleştirin. Etkinleştirilen duraklatma sembolü sarı renkte görünecektir.Etkinleştirilen görüntüleme fonksiyonu açık bir göz şeklinde görünecektir. Ardından, analizi dokuzuncu modüle kadar çalıştırmak için Çalıştır'a tıklayın. Dokuzuncu modülde, ikinci görüntüyü şununla çarp parametresini, çekirdekleri baskılamadan Brucella'daki DAPI sinyalini baskılayacak bir değere ayarlayın.Modül değerlerini test etmek için Step'e basın. Yeni açılan görüntüye sağ tıklayın ve görüntü kontrastını log normalized olarak ayarlayın. Tekrar olarak, dokuzuncu modüle geri dönün.Brucella sinyali tamamen bastırılırken, aynı zamanda aşırı çıkarma işlemini belirten siyah alanların minimize edilene kadar "ikinci görüntü ile çarp" (multiply the second image by) parametresini ayarlayın ve modül üzerinden tekrar geçin. Belirli modüller için uygun parametreleri bulmak, parametrelerin kademeli olarak optimize edilmesini gerektirir. Farklı değerler deneyerek modüller üzerinden defalarca geçmek ve görüntülenen sonuç üzerindeki etkiyi gözlemlemek kesinlikle önemlidir.Modül 10 için duraklatmayı ve görüntülemeyi etkinleştirin. Birincil nesneleri tanımlayın. Eşik değerindeki parametre alt sınırını, çekirdeklerin segmente edileceği ve arka planın yok sayılacağı kadar yüksek bir değere ayarlayın.Uygun bir değer belirlemek için modül üzerinden ilerleyin, ardından girdi görüntüsüne sağ tıklayarak pik değerinin tipik olarak arka planı gösterdiği histogramı görüntüleyin. Arka plan yoğunluğundan başlayarak, çıktı görüntüsünde gösterildiği gibi çekirdeklerin iyi bir segmentasyonu sağlanana kadar parametreyi artırın. Görüntü analiz hattının amacı, replike olan bakteriler içeren hücreleri tanımlamaktır.Bu, çekirdek, çekirdek çevresi ve Voronoi hücre gövdesi için patojen sinyaline farklı eşik değerleri atanarak gerçekleştirilir. Modül 15 için duraklatma ve görüntüleme seçeneklerini etkinleştirin. Daha önce gösterildiği gibi nesneleri filtreleyin ve Run düğmesine basın.Parametrenin minimum değerini, yalnızca çekirdeğinde Brucella belirgin şekilde görülen hücrelerin tutulması ve diğer tüm hücrelerin filtrelenmesi için yeterince yüksek olacak şekilde ayarlayın. Uygun bir değer belirlemek için modülü aşın ve çıktı görüntüsünü görüntüleyin. Yalnızca çekirdeğinde Brucella belirgin olan hücreler kalana kadar değeri kademeli olarak artırın.Metin protokolüne uygun olarak modül 16 ve 17'deki peri-nükleer ve Voronoi hücre gövdesinde bakteri bulunan hücreler için filtreleme yaptıktan sonra, test modundan çıkın ve tam analizi çalıştırmadan önce hiçbir modülün ekranının görünmediğinden emin olmak için modüllerin yanındaki tüm göz sembollerinin işaretini kaldırın. Son olarak, analizi başlatmak için Analyze Images düğmesine basın. Analiz tamamlandığında, analizin tüm plaka boyunca güvenilir bir şekilde çalışıp çalışmadığını doğrulamak için ortaya çıkan PNG görüntülerini ve CSV hesap tablosunu inceleyin.Giriş analizini ve enfeksiyon puanlamasını metin protokolüne uygun olarak gerçekleştirin. Bu şekil, bitiş noktası analizinde enfekte hücreleri otomatik olarak tanımlamak için kullanılan görüntü analizine bir örnek göstermektedir. DAPI ile boyanmış HeLa hücresi çekirdekleri tanımlanmıştır.Çekirdeği çevreleyen sekiz piksel genişliğinde bir peri-nükleus ve çekirdeğin 25 piksel genişletilmesiyle bir Voronoi hücre gövdesi hesaplandı. Patojen sinyali en az bir kompartmanda karşılık gelen eşik değerini aştığında, hücre enfekte olarak kabul edildi.Brucella'nın konak hücrelere başarılı bir şekilde tutunabilmesi için aktin yeniden düzenlemeleri gereklidir. Bu nedenle, ARP23'ün tüketilmesi, siRNA taraması için uygun bir pozitif kontroldür. ARPC3'ün tüketilmesi, enfeksiyondan iki gün sonra çoğalan bakterilere sahip hücrelerin sayısını azaltmıştır.Scrambled işlem görmüş kontrol hücrelerle karşılaştırıldığında. Otomatik görüntü analizi, bu grafikte kontrol hücrelerine kıyasla ARPC3 eksiltilmiş HeLa hücrelerinde enfeksiyonda sayısal olarak bir azalma gözlemlenmiş olduğunu göstermiştir. ARPC3 eksiltilmesinin, giriş analizinde de kontrol hücrelerine kıyasla Brucella enfeksiyonunda bir azalma sağladığı görülmüştür.Sarı ile gösterilen hücre içi Brucella sayısındaki azalmadan anlaşıldığı üzere. Son olarak, otomatik görüntü analizi ile yapılan enfeksiyon kantifikasyonu, ARPC3 eksikliğinin hem enfekte hücre sayısını hem de enfekte hücrelerdeki hücre içi bakteri sayısını azalttığını doğrulamıştır. Uzmanlaşıldığında, bu protokol deneyin başlangıcından itibaren bir buçuk hafta içinde görüntü analizi sonuçları sağlayabilir.Bu prosedürü uygularken, seçilen parametrelerin tüm plaka boyunca iyi sonuç verdiğinden emin olmak için görüntü analiz sonuçlarının dikkatle incelenmesi önemlidir. Bu prosedürün ardından, belirli bir konak faktörünün Brucella ile nasıl etkileşime girdiğini izlemek gibi ek sorulara yanıt bulmak için canlı hücre görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Veya bir genin eksilmesinin enfeksiyonun hücre içi dinamiklerini nasıl etkilediği. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, enfeksiyon biyolojisi alanındaki araştırmacıların HeLa hücre deneyi ile Brucella enfeksiyonu için gerekli olan konak faktörlerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hücre içi patojen Brucella abortus'un HeLa hücrelerini başarıyla kolonize etmesini destekleyen veya önleyen konak faktörlerinin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Brucella abortus ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve yerel biyogüvenlik düzenlemelerine kesinlikle uyulması gerektiğini unutmayın.

microscopy-based-assays-for-high-throughput-screening-host-factors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Casanova, A. ve diğerleri. Hela hücrelerinin brücella enfeksiyonunda rol alan konak faktörlerinin yüksek verimli taraması için mikroskopi tabanlı testler. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, siRNA aracılı STING knockdown ile epitel hücrelerinde Brucella abortus enfeksiyonunun yüksek verimli görüntülemesini göstererek sitozolik DNA algılamanın hücre içi bakteriyel çoğaltma ve konak doğuştan bağışıklık yanıtı üzerindeki rolünü araştırıyor.

Konak epitel hücrelerinde hücre içi Brucella abortus enfeksiyonunun yüksek verimli görüntülemesi

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Bu teknik, önceki memeli hücrelerinin protozoal enfeksiyonlara karşı doğal ev sahibi hücrelerin önceden yetiştirilir bakteriyel patojenlerin hücre içi büyüme, hasat normalleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sahne emiş hem de hedef hücre tipleri için konukçu hücrelerin geniş bir çeşitliliği için modifiye edilebilir.

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Bu çalışma, bakteri canlılığını hızlı bir şekilde değerlendirmek için floresan ve lüminesans kullanarak, yakın zamanda oluşturulmuş bir çift raportör suşu ile Mycobacterium abscessus'a karşı yüksek verimli tarama için bir test geliştirdi. Bu protokol, bu ilaca dirençli bakterilere karşı yeni ilaçları taramayı amaçlayan araştırmacılar için geçerli olacaktır.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Öğrenin, mikroskopi tabanlı yüksek verimli tarama ile HeLa hücrelerinde Brucella enfeksiyonuna katılan konakçı faktörlerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu siRNA tarama yöntemi, patojen-konakçı etkileşimlerini hızlıca keşfetmenizi sağlar.

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler

Daha fazla video keşfet