Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler

Bu yüksek kapasiteli mikroskopi tabanlı assay'in genel amacı, HeLa hücrelerinin Brucella enfeksiyonunda yer alan konakçı faktörlerini belirlemektir. Bu yöntem, hücre içi patojen Brucella tarafından kolonizasyonu teşvik eden veya önleyen konakçı proteinlerinin tanımlanması gibi, konakçı-patojen etkileşimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, veteriner laboratuvarından görüntü analizine kadar uzanan yarı otomatik iş akışının, robotların kullanımına ve verimli yüksek kapasiteli deneylerin oluşturulmasına olanak tanımasıdır.

Böylece bu yöntem, siRNA taramaları kullanarak Brucella konak etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilir. Protokolün büyük bir kısmı diğer tarama stratejileri için de uygulanabilir; örneğin siRNA kütüphaneleri için.

HeLa hücreleri kültüre alındıktan ve siRNA'lar ile tarama plakaları metin protokolüne göre hazırlandıktan sonra, siyah bir 384 kuyucuklu plaka oda sıcaklığında 300 ×g'de 20 dakika santrifüj edilerek çözdürülür. Oda sıcaklığındaki FCS içermeyen DMEM kullanılarak transfeksiyon medyumu hazırlanır. Transfeksiyon reaktifi 1:200 oranında seyreltilir ve kullanmadan önce dikkatlice karıştırılır.

Bir reaktif dağıtıcı kullanarak 384 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 25 µL transfeksiyon medyumu ekleyin ve plakayı ileri geri hareket ettirerek çözeltileri karıştırın. siRNA transfeksiyon reaktifi kompleks oluşumuna izin vermek için plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bu sırada, kültür medyumunu aspire ederek ve 75 cm²'lik bir flasktaki subkonfluan hücreleri bir kez yıkamak için 2,5 mL PBS içinde %0,05 trypsin EDTA ekleyerek HeLa hücrelerini hazırlayın.

Ardından 1.5 milliliters taze tripsin ekleyin ve hücreler yuvarlaklaşana kadar flaskı iki ila üç dakika boyunca 37 degrees Celsius'ta bekletin. Hücreleri yeniden süspand etmek için 10 milliliters ön ısıtılmış dmem %60 FCS kullanın. Daha sonra, %16 FCS içeren dmem içinde mililitre başına 10,000 hücreden oluşan bir hücre süspansiyonu hazırlamadan önce hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayıcı kullanın.

Transfeksiyon reaktifi içeren her bir kuyucuğa 50 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Bu işlem, kuyucuk başına 500 hücre düşmesini sağlayacaktır. Hücrelerin eşit şekilde dağılması için plakayı ileri geri hareket ettirin.

Ardından, hücrelerin çökmesine izin vermek için plakayı oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletin. Plakayı mühürlemek için parafilm kullanın. Ve 72 saat boyunca, 37 °C sıcaklıkta, %5 CO2 içeren, önceden ısıtılmış bir alüminyum plaka üzerindeki nemli bir inkübatörde inkübe edin.

Sınıf üç patojen B.abortus ile çalışmak tehlikelidir ve koruyucu tulum, koruyucu eldiven, maske ve gözlük takılmasını içeren yerel biyogüvenlik düzenlemelerine uyulması gerekir. Enfeksiyondan bir gün önce, önceden belirlenmiş miktardaki B.abortus başlangıç kültürünü 250 mililitrelik vidalı kapaklı bir şişede 50 mililitre TSB KM besiyerine inoküle edin.

Şişeyi kapatmak için parafilm kullanın ve bakterileri 37 °C'de, bir çalkalayıcıda 100 RPM hızında, 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk 0,8 ila 1,1 olana kadar gece boyunca büyütün. Bakteri kültürünün 600 nm optik yoğunluğunu ölçün. Ardından, istenen enfeksiyon çokluğunu elde etmek için bakteri kültürünü %10 FCS içeren DMEM içinde seyrelterek enfeksiyon ortamını hazırlayın.

Veya MOI. Otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak transfeksiyon medyumunu 50 µL enfeksiyon medyumu ile değiştirin. Steril kabin içerisinde plakayı santrifüj kafesine yerleştirin ve 384 kuyucuklu plakayı 400 ×g ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, plakayı mühürlemek için parafilm kullanın ve plakayı 37 °C ve %5 CO2 sıcaklığındaki önceden ısıtılmış bir alüminyum plaka üzerinde dört saat boyunca inkübe edin. Otomatik plaka yıkayıcı ile yapılan inkübasyonun ardından, hücre dışı bakterileri inaktive etmek amacıyla hücreleri yıkamak için 100 µg/mL dentrimysen veya GM içeren %10 FCS'li DMEM kullanın. Daha sonra, plakayı mühürlemek için parafilm kullanın ve bitiş noktası analizi için plakayı inkübatördeki önceden ısıtılmış alüminyum plaka üzerine tekrar yerleştirerek 40 saat daha bekletin.

Hücreleri sabitlemek için önce kuyucukları yıkamak amacıyla PBS kullanın. Ardından, PBS'yi pH 7.4'te %3,7'lik PFA (50 µL) ile değiştirin.

Ve hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, fiksasyon ortamını değiştirmek için 50 µL PBS kullanın. Numuneleri otomatik plaka yıkayıcı ile boyamak için, hücreleri permeabilize etmek amacıyla önce 10 dakika boyunca PBS içinde %1 Triton X-100'den 50 µL kullanarak başlayın.

Hücreleri üç kez PBS ile yıkadıktan sonra, mililitre başına bir mikrogram DAPI içeren 50 µL PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücreleri ışıktan korumadan önce üç kez PBS ile yıkayın. Plağı otomatik mikroskoba aktarın.

Mikroskop parametrelerini ayarlayın. 10-X objektifi seçin. Ardından, 384 kuyucuklu plakaya karşılık gelen plaka formatını seçin.

Kuyu başına dokuz bölge edinin. Lazer tabanlı odaklamayı etkinleştir seçeneğini seçin. Ardından, plaka ve kuyu tabanına odaklanın.

Ardından, örnek bulma için ilk kuyucuğu başlangıç kuyucuğu olarak ve site odaklaması (autofocus) için tüm bölgeleri belirleyin. Sonra, DAPI kanalı için odak Z ofsetini manuel olarak ayarlayın. Daha sonra, odağı kuyucuk tabanına ayarlamak için Örneği Bul (Find Sample) düğmesine basın.

Pozlama süresi için iyi bir tahmin elde etmek amacıyla AutoExposure işlevini kullanın. Düşük aşırı pozlamayla geniş bir dinamik aralık sağlamak için DAPI kanalı pozlama süresini manuel olarak düzeltin. Plaka boyunca çeşitli bölgeleri görüntülemek için bu pozlama süresini kullanın.

Ardından, en parlak pikseller bölgeler üzerindeki maksimum parlaklığın yaklaşık %80'ine ulaşana kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın. Odak ve pozlama süresini ayarlama adımlarını diğer tüm kanallar için de uygun şekilde tekrarlayın. Daha sonra, tüm plağın görüntüleme işlemine başlayın.

Bitiş noktası analizi için tüm plakayı görüntülemek amacıyla DAPI ve GFP kanallarını kullanın. Bitiş noktası analizindeki boyanmış hücreler üzerinde bir görüntü analizi gerçekleştirmek için, bir gölgeleme modeli hesapladıktan sonra, metin protokolündeki Görünüm çıktı ayarları altındaki talimatlara göre görüntülerin bulunduğu giriş klasörünü ve sonuçların yer alacağı bir çıktı klasörünü seçin. Ardından, görüntülerin ortak olarak sahip olduğu metni tanımlayın ve gölgeleme modellerini yükleyin.

Test modunu başlat (Start test mode) düğmesine tıklayın ve tüm modüller için duraklatma ve görüntüleme ayarlarının devre dışı olduğundan emin olun. Dokuzuncu modül olan ImageMath için duraklatma ve görüntüleme ayarını etkinleştirin. Etkinleştirilen duraklatma sembolü sarı renkte görünecektir.

Etkinleştirilen görüntüleme fonksiyonu açık bir göz şeklinde görünecektir. Ardından, analizi dokuzuncu modüle kadar çalıştırmak için Çalıştır'a tıklayın. Dokuzuncu modülde, ikinci görüntüyü şununla çarp parametresini, çekirdekleri baskılamadan Brucella'daki DAPI sinyalini baskılayacak bir değere ayarlayın.

Modül değerlerini test etmek için Step'e basın. Yeni açılan görüntüye sağ tıklayın ve görüntü kontrastını log normalized olarak ayarlayın. Tekrar olarak, dokuzuncu modüle geri dönün.

Brucella sinyali tamamen bastırılırken, aynı zamanda aşırı çıkarma işlemini belirten siyah alanların minimize edilene kadar "ikinci görüntü ile çarp" (multiply the second image by) parametresini ayarlayın ve modül üzerinden tekrar geçin. Belirli modüller için uygun parametreleri bulmak, parametrelerin kademeli olarak optimize edilmesini gerektirir. Farklı değerler deneyerek modüller üzerinden defalarca geçmek ve görüntülenen sonuç üzerindeki etkiyi gözlemlemek kesinlikle önemlidir.

Modül 10 için duraklatmayı ve görüntülemeyi etkinleştirin. Birincil nesneleri tanımlayın. Eşik değerindeki parametre alt sınırını, çekirdeklerin segmente edileceği ve arka planın yok sayılacağı kadar yüksek bir değere ayarlayın.

Uygun bir değer belirlemek için modül üzerinden ilerleyin, ardından girdi görüntüsüne sağ tıklayarak pik değerinin tipik olarak arka planı gösterdiği histogramı görüntüleyin. Arka plan yoğunluğundan başlayarak, çıktı görüntüsünde gösterildiği gibi çekirdeklerin iyi bir segmentasyonu sağlanana kadar parametreyi artırın. Görüntü analiz hattının amacı, replike olan bakteriler içeren hücreleri tanımlamaktır.

Bu, çekirdek, çekirdek çevresi ve Voronoi hücre gövdesi için patojen sinyaline farklı eşik değerleri atanarak gerçekleştirilir. Modül 15 için duraklatma ve görüntüleme seçeneklerini etkinleştirin. Daha önce gösterildiği gibi nesneleri filtreleyin ve Run düğmesine basın.

Parametrenin minimum değerini, yalnızca çekirdeğinde Brucella belirgin şekilde görülen hücrelerin tutulması ve diğer tüm hücrelerin filtrelenmesi için yeterince yüksek olacak şekilde ayarlayın. Uygun bir değer belirlemek için modülü aşın ve çıktı görüntüsünü görüntüleyin. Yalnızca çekirdeğinde Brucella belirgin olan hücreler kalana kadar değeri kademeli olarak artırın.

Metin protokolüne uygun olarak modül 16 ve 17'deki peri-nükleer ve Voronoi hücre gövdesinde bakteri bulunan hücreler için filtreleme yaptıktan sonra, test modundan çıkın ve tam analizi çalıştırmadan önce hiçbir modülün ekranının görünmediğinden emin olmak için modüllerin yanındaki tüm göz sembollerinin işaretini kaldırın. Son olarak, analizi başlatmak için Analyze Images düğmesine basın. Analiz tamamlandığında, analizin tüm plaka boyunca güvenilir bir şekilde çalışıp çalışmadığını doğrulamak için ortaya çıkan PNG görüntülerini ve CSV hesap tablosunu inceleyin.

Giriş analizini ve enfeksiyon puanlamasını metin protokolüne uygun olarak gerçekleştirin. Bu şekil, bitiş noktası analizinde enfekte hücreleri otomatik olarak tanımlamak için kullanılan görüntü analizine bir örnek göstermektedir. DAPI ile boyanmış HeLa hücresi çekirdekleri tanımlanmıştır.

Çekirdeği çevreleyen sekiz piksel genişliğinde bir peri-nükleus ve çekirdeğin 25 piksel genişletilmesiyle bir Voronoi hücre gövdesi hesaplandı. Patojen sinyali en az bir kompartmanda karşılık gelen eşik değerini aştığında, hücre enfekte olarak kabul edildi.

Brucella'nın konak hücrelere başarılı bir şekilde tutunabilmesi için aktin yeniden düzenlemeleri gereklidir. Bu nedenle, ARP23'ün tüketilmesi, siRNA taraması için uygun bir pozitif kontroldür. ARPC3'ün tüketilmesi, enfeksiyondan iki gün sonra çoğalan bakterilere sahip hücrelerin sayısını azaltmıştır.

Scrambled işlem görmüş kontrol hücrelerle karşılaştırıldığında. Otomatik görüntü analizi, bu grafikte kontrol hücrelerine kıyasla ARPC3 eksiltilmiş HeLa hücrelerinde enfeksiyonda sayısal olarak bir azalma gözlemlenmiş olduğunu göstermiştir. ARPC3 eksiltilmesinin, giriş analizinde de kontrol hücrelerine kıyasla Brucella enfeksiyonunda bir azalma sağladığı görülmüştür.

Sarı ile gösterilen hücre içi Brucella sayısındaki azalmadan anlaşıldığı üzere. Son olarak, otomatik görüntü analizi ile yapılan enfeksiyon kantifikasyonu, ARPC3 eksikliğinin hem enfekte hücre sayısını hem de enfekte hücrelerdeki hücre içi bakteri sayısını azalttığını doğrulamıştır. Uzmanlaşıldığında, bu protokol deneyin başlangıcından itibaren bir buçuk hafta içinde görüntü analizi sonuçları sağlayabilir.

Bu prosedürü uygularken, seçilen parametrelerin tüm plaka boyunca iyi sonuç verdiğinden emin olmak için görüntü analiz sonuçlarının dikkatle incelenmesi önemlidir. Bu prosedürün ardından, belirli bir konak faktörünün Brucella ile nasıl etkileşime girdiğini izlemek gibi ek sorulara yanıt bulmak için canlı hücre görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Veya bir genin eksilmesinin enfeksiyonun hücre içi dinamiklerini nasıl etkilediği. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, enfeksiyon biyolojisi alanındaki araştırmacıların HeLa hücre deneyi ile Brucella enfeksiyonu için gerekli olan konak faktörlerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hücre içi patojen Brucella abortus'un HeLa hücrelerini başarıyla kolonize etmesini destekleyen veya önleyen konak faktörlerinin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Brucella abortus ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve yerel biyogüvenlik düzenlemelerine kesinlikle uyulması gerektiğini unutmayın.