Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, farelerde intravenöz enjeksiyondan sonra Murin C1498 hücrelerini ve indükledikleri akut lösemiyi karakterize etmektir. Bu prosedürün ana avantajı, bir C1498 hücre enjeksiyonundan sonra indüklenen murin miyelomonositik löseminin insan hastalığının birçok özelliğini sunmasıdır. Bu hayvan modeli, lösemi gelişimine ve bağışıklık yetmezliğine yol açan mekanizmaların neler olduğu gibi Hematoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu hayvan modelinin anlamı, yeni kemoterapi ve immünothereputik ajanların test edilmesini kolaylaştırdığı için lösemi tedavisine kadar uzanır. Beş ila altı haftalık dişi konjenik C57 siyah 6 fareyi steril bir laminer akış başlığına aktararak başlayın. Ardından, hayvanı bir kısıtlayıcıya yerleştirin.

Daha sonra, 100 mikrolitre hücreli 29 gauge iğne ile donatılmış bir milileter şırınga yükleyin. Distal ucun kuyruğunu kavrayın ve kuyruk derisini% 70 etanol batırılmış bir gazlı bezle dezenfekte edin. Altıncı hücrelere 10 kez yavaşça lateral kuyruk damarına enjekte etmeye devam edin.

Tüm hücreler teslim edildiğinde, iğneyi çıkarın ve steril gazlı bezle enjeksiyon görünce hafif bir baskı uygulayın. Ardından, önümüzdeki birkaç hafta boyunca dikkatli bir şekilde izleyerek hayvanı kafesine geri koyun. 17 ila 19 gün sonra, anestezi uygulanmış lösemik hayvanın gözünün medial kantusuna bir kılcal tüp yerleştirin.

Oribtal sinüsten kılcal boruya 100 ila 200 mikrolitre kan çekilecektir. Tüpü çıkarın ve steril bir gazlı bezin göze nazikçe uygulanmasıyla kanamayı kontrol edin. Daha sonra kanı bir EDTA tüpüne aktarın ve mononükleer hücre izolasyonu gerçekleşene kadar tüpü buz üzerinde saklayın.

Kan mononükleer hücrelerini izole etmek için, önce 500 mikrolitrelik bir son hacme kadar bir milimolar EDTA ile desteklenmiş PBS ekleyin. Ardından, numuneyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, 30 mikrolitre ayırma solüsyonunu kanın altına dikkatlice yerleştirmek için 500 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın ve katmanları karıştırmamaya dikkat edin.

Hücreleri santrifüjleme ile ayırın ve opak beyaz mononükleer hücre tabakasını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Ardından, bağışıklık hücrelerini bir mililitre PBS'de yıkayın. Bunları santrifüjleyin ve peleti boyama ve akış sitometrisi ile analiz için 600 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Kemik iliğini izole etmek için, fareyi plastik bir tahtanın üzerine sırtına yerleştirin ve hayvanların uzuvlarını sabitleyin. Hayvanı% 70 etanol ile dezenfekte edin. Ardından, her bir bacağı uyluk kemiğinin üst kısmından eklemin üzerinde kesin ve kulak kaval kemiğini uyluk kemiğinden ayırmak için hafifçe çekin.

Kemiklerden cildi ve kasları çıkarmak için forseps ve makas kullanın ve kemikleri buz üzerindeki bir petri kabına aktarın. Ekstremiteleri çıkarmak için makas kullanın. Ardından, beş mililitre soğuk PBS içeren 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 26 gauge bir iğneyi her seferinde bir kemiğin ucuna yerleştirin ve kemik iliklerini tabağa yıkayın.

Kemik iliği hücrelerini parçalamak için hücre süspansiyonunu iğne ucundan birkaç kez geçirin. Ardından, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri 70 mikronluk yeni bir filtreden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Hücreleri santrifüjleyin ve peleti iki mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Tüpü hemen 50 mililitreye kadar soğuk PBS ile doldurun ve hücreleri santrifüjleyin. Daha sonra, kemik iliği peletini soğuk FACS tamponunda mililitrede 10 ila altıncı hücreye bir kez yeniden süspanse edin. Kemik iliği hücrelerini önce boyamaya hazırlamak için, slaytları önceden takılmış filtre kartlarıyla tek kullanımlık odalara yerleştirin ve odaları bir sitosantrifüje yerleştirin.

Her filtre kartı bölmesine 100 mikrolitre FACS tamponu ekleyin ve slaytları kısaca santrifüjleyin. Döndürmenin sonunda, her odaya 100 mikrolitre hücre ekleyin ve hücreleri santrifüjleyin. Ardından, havayla kurutma için slaytları odalardan dikkatlice çıkarın.

Kemik iliği hücrelerini lekelemek için, slaytları beş dakika boyunca May-Grunwald çözeltisi içeren bir coplin kavanozuna daldırın. Daha sonra, slaytları bir dakika boyunca pH'ı 6.8 olan bir tampon çözeltisi kavanozuna aktarın. Ardından, slaytları 10 dakika boyunca Giemsa R solüsyonuna aktarın.

Ardından pH nötr su ile 10 saniyelik bir yıkama yapılır. Yıkamadan sonra, slaytların kurumasını bekleyin ve her numuneye bir damla montaj ortamı uygulayın. Ardından, bir kapak camının bir kenarını sürgünün üzerine yerleştirin ve hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe bastırarak kapak camını dikkatlice hücrelerin üzerine indirin.

Kontrol hayvanlarıyla karşılaştırıldığında, C1498 hücresi enjekte edilen hayvanlar, hücrelerin patlama benzeri görünümüyle gözlemlendiği gibi, kemik iliğinde büyük bir C1498 hücresi infiltrasyonu gösterir. C1498 hücrelerini infiltre eden kemik iliği, akut miyelomonositik löseminin karakteristiği olan sırasıyla monoblastik ve miyeloblastik hücreleri gösteren monositik ve granülositik fenotipler gösterir. C1498 enjekte edilen farelerden alınan kan örneklerindeki mononükleer hücre frekanslarının akış sitometrik analizi, tüm beyaz kan hücresi popülasyonunun yaklaşık dörtte birinin lösemik hücrelerden oluştuğunu göstermektedir.

T ve B lenfosit frekansları, kontrol ve C1498 enjekte edilen hayvanlar arasında benzerdir. Bununla birlikte, monosit frekansları, akut miyelomonositik löseminin bir özelliği olan C1498 enjekte edilen farelerde daha yüksek seviyelerde gözlenir. Sitokimya ve May-Grunwald Giemsa prosedürlerini gerçekleştirirken, uygun pH değerlerini, sıcaklıkları ve inkübasyon sürelerini korumayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, akut miyelomonositik lösemiyi nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Hematoloji alanındaki araştırmacıların diğer hayvan modellerinde spontan ve indüklenmiş akut löseminin doğasını keşfetmelerinin yolunu açtı.