Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, murin fibroblastlarından bonafide kaynaklı trofoblast kök hücreleri veya iTSC'ler üretmektir. Bu yöntem, kök hücre alanında, embriyonik ile ekstra embriyonik soydan ayıran bariyerin doğası ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, transgenik ekspresyonun yalnızca geçici olarak aktive edilmesi ve kararlı bir şekilde dönüştürülmüş hücrelerin seçimini kolaylaştırmasıdır.

Uygun kişisel koruyucu ekipmanı kullanan bir biyogüvenlik seviyesi iki laboratuvarında, beş adet 100 mililitrelik kabı beş mililitre Poli-L-lizin çözeltisi ile örtün ve kaplama çözeltisini eşit şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın. Bulaşıkları 30 dakika boyunca 37 derecelik bir inkübatöre koyun, ardından Poly-L-lizin'i aspire edin ve bulaşıkları PBS ile bir kez durulayın. Daha sonra, 10 mililitre 293 T hücre ortamında tabak başına yedi kez 10 ila altıncı 293 T hücre tabağı koyun, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için bulaşıkları döndürün ve bulaşıkları inkübatöre geri koyun.

Ertesi sabah, büyüme ortamını beş mililitre transfeksiyon ortamı ile değiştirin. Daha sonra kültürlere altı mikrolitre 1000X Klorokin çözeltisi stoğu uygulayın ve plakaları 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, her bir Lentiviral vektör için, girdaplama sırasında 600 mikrolitre Lentivector DNA solüsyonunu 600 mikrolitre 2X HEPES tamponlu salin içine damla damla ekleyin ve transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında inkübe edin.

15 dakika sonra, karışımı hazırlanan 293 T hücresine çok dikkatli bir şekilde damla damla ekleyin ve bulaşıkları inkübatöre geri koyun. Beş ila altı saat sonra, ortamı 10 mililitre virüs üretim ortamı ile değiştirin ve plakaları inkübatöre geri yerleştirin. Ertesi sabah, başka bir gece inkübasyon için ortamı dikkatlice yedi mililitre taze virüs üretim ortamı ile değiştirin.

Daha sonra, ortamı her bir plakadan ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve başka bir gece inkübasyon için plakalara yedi mililitre taze virüs üretim ortamı ekleyin. Ertesi sabah, virüs içeren ikinci parti virüsü hasat edin, süpernatanı ilk parti virüs ile bir araya getirin ve virüs içeren besiyerini eksi 80'de 500 mikrolitrelik Alikotlarda saklamak için 0.45 mikron yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat membran filtreden süzün. Fibroblastları indüklenmiş trofoblast kök hücrelerine dönüştürmek için, dönüştürülmüş kütle embriyonik fibroblastlarını veya MEF'leri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede 0,5 mililitre Tripsin EDTA çözeltisi ile ayırın. Üç ila dört dakika sonra, hücrelerin ters çevrilmiş bir mikroskop altında plakadan kaldırıldığını onaylayın ve ardından Tripsin'i bir mililitre TS ortamı ile aktive edin. Hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri santrifüjleyin.

Daha sonra peletleri iki mililitre TS ortamında yeniden süspanse edin ve iki kez 10 ila beşinci dört faktör mCherry'yi plakalayın veya fibroblast büyüme faktörü dört ve gece boyunca Doksisiklin ile takviye edilmiş Heparin içeren 10 mililitre TS ortamında 100 mililitrelik tabak başına dönüştürülmemiş MEF'leri kontrol edin. Ertesi gün, bir epifloresan mikroskobu altında, transdüksiyon verimliliğini tahmin etmek için mCherry protein ekspresyonunu kullanın. Transdüksiyon verimliliği yaklaşık% 100 ise, kültürleri inkübatöre geri getirin ve 10. güne kadar tüm bulaşıklardaki ortamı her gün değiştirin.

Daha sonra, hücreleri, dört faktör tabağı üzerindeki transdiferansiye alanların görünümünü üç haftaya kadar izlemek için ters mikroskop kullanarak fibroblast büyüme faktörü dört ve Doksisiklin içermeyen Heparin içeren taze TS ortamı ile besleyin. Transdiferansiye alanların tanımlanması kritiktir, çünkü bu noktada MEF'ler morfolojik olarak trofoblast kök hücrelerine benzememektedir. Hücre boyutları ve büyük çekirdekleri ile tanımlanan trofoblast dev hücrelerine bitişik yoğun yığılmış kolonileri arayın.

Tek tek iTSC hatlarını izole etmek için, bakteriyel kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için önce ters çevrilmiş mikroskobu %70 etanol ile silin. Daha sonra, 96 U alt kuyu plakasının 12 kuyusuna 40 mikrolitre% 05 Tripsin EDTA ekleyin ve plakayı buzun üzerine yerleştirin. Şimdi ortamı dört faktörün MEF transdiferansiyasyon kabından aspire edin ve hücreleri bir kez 10 mililitre PBS ile yıkayın.

Yıkamadan sonra, hücrelere 10 mililitre taze PBS ekleyin ve plakayı ters çevrilmiş mikroskop aşamasına yerleştirin. 40 mikrolitreye ayarlanmış 100 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, her bir koloniyi pipet ucuyla daire içine alın ve elde edilen yüzen koloniyi aspire edin. Her koloniyi, 12 koloni toplanana kadar 96 kuyulu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.

Daha sonra kolonileri 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri pipetleme ile ayırın ve hücre süspansiyonlarını, gece boyunca kültür için 500 mikrolitre tam TS artı fibroblast büyüme faktörü ve Heparin ortamı içeren 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Ertesi gün, ölü hücreleri çıkarmak ve plakayı inkübatöre geri döndürmek için ortamı taze tam TS artı fibroblast büyüme faktörü ve Heparin ortamı ile değiştirin.

Parlak sınırlara sahip Epitel kolonilerinin görünümü için kültürlerin günlük olarak izlenmesi. Koloniler gözlendiğinde, hücreleri bir haftaya kadar veya% 70 birleşene kadar kültürleyin. Dört faktörün transgen ekspresyonunun aktive edildiği kültürlerde, hücreler hızla morfoloji değiştirir.

14 ila 21. günler civarında, farklı transdiferansiye alanlar ortaya çıkar. Bu birincil koloniler tipik trofoblast kök hücre morfolojisinden yoksundur, ancak bir kez alt kültürlendiklerinde, iyi niyetli trofoblast kök hücrelerini oldukça andıran, sıkı kenarları ve parlak sınırları olan karakteristik bir epitel morfolojisi gözlenir. Dört faktörün indüklediği trofoblast kök hücreleri, trofoblast transkripsiyon faktörü, Cdx2 ve Tfap2c için pozitif kaldığında, bu çizgilerin fikri sonraki In vitro veya InVivo analizler için kullanılabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa altı hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, üretilen iTSC'lerin kimerizasyon potansiyeli hakkında ek soruları yanıtlamak için patlama destekli enjeksiyon gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, farelerde embriyonik ve ekstra embriyonik hücre kaderi dönüşümünü araştırmak için alandaki araştırmacıların veya erken soy ayrımının yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, yeni embriyonik fibroblastların doğrudan indüklenmiş trofoblast kök hücrelerine nasıl dönüştürüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Lentiviral vektörlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve biyo güvenlik seviye iki gibi önlemlerin her zaman uygun çalışma prosedürlerine uyulması gerektiğini unutmayın.