Name: Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Keşfedin, fare embriyonik fibroblastlarını indüklenmiş trofoblast kök hücrelerine dönüştürme yöntemini. Bu teknik, embriyonik ve ekstraembriyonik soy hattı arasındaki bariyeri incelemek için geçici transgen ifadesi kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm fare deneyleri, hayvan koruma ve yerel kurumsal hayvan bakım komiteleri (Landesamt fuer Natur, Çevre und Verbraucherschutz, Kuzey Ren-Vestfalya [onay kimlik numarası onayı ile anlaşarak Alman hukukuna göre yapılmıştır: 84-02.04.2013 AZ .A428]). 1. Medya Hazırlık <ol><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), penisilin / streptomisin (1x): 293T orta hazırlayın. </li><li> DMEM,% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), 1 x esansiyel olmayan amino asitler, penisilin / streptomisin (1x): MEF orta hazırlayın. </li><li> TS orta hazırlayın (ağırlık / FGF4 / heparin o): Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) 1640,% 20 (h / h) FBS (kök hücre kültürü dereceli), penisilin / streptomisin (1x), L-glutamin (2 mM ), sodyum piruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0.1 mM). </li><li> kök hücre (RPMI 1640,% 20 (h / h) FBS: FGF4 / heparin (TH + F4H) TS orta hazırlayınKültür derecesi), penisilin / streptomisin (1x), L-glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0.1 mM), 25 ng / ml FGF4 / ml heparin 1 ug. Not: FGF4 ve heparin, doğrudan kullanımdan hemen önce ortama ilave edilir. </li><li> FGF4 / heparin (TS-CM + F4H) TS-CM Hazırlama:% 70, MEF-durumunu TS ortamı +% 30 taze hazırlanmış TS ortamı + 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml heparin. Not: FGF4 ve heparin, doğrudan kullanımdan hemen önce ortama ilave edilir. </li><li> Transfeksiyon ortamı hazırlayın: İleri DMEM,% 2 (v / v) FBS (hücre kültürü dereceli kök), L-glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (1x). </li><li> Virüs üretimi orta hazırlayın: İleri DMEM,% 5 (h / h) FBS (hücre kültürü dereceli kök), L-glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (1x). </li></ol> 2. Fare Embriyonik fibroblast Derivasyon <ol><li> 129S2SV kadın ve homozigot erkek R26 :: rtTA fareler (suşu adı ağırlık kullanarak set zamanlı çiftleşmelerin; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Ve servikal dislokasyon ile E 13.5 kurban fareler üzerinde standart protokollere 8&#39;e göre birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) izole eder. Bundan sonra, MEF medyada bir 150 mm tabağına bir embriyodan plaka hücreleri. </li><li> Birincil MEF kültürleri 150 mm tabaklar üzerinde konfluense ulaştıktan sonra, 10 mi, PBS ile iki kez yıkama hücreleri ve 4 ml% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu ekleyin. 37 ° C&#39;de inkübatör içinde 4 dakika - 3 yemekler inkübe edin. </li><li> Kuluçka kontrolünden sonra ters bir mikroskop (10X lens kullanarak) ile çanak ayrılmış hücreler eğer. trypsinization durdurmak ve bir 50 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu toplamak için MEF medya 5 ml ekleyin. </li><li> Havuz hücre çeşitli yemekler süspansiyon ve 50 ml konik tüp içine toplamak. 200 x g&#39;de 3 dakika 10 ° C santrifüjleyin hücre süspansiyonu. </li><li> % 10 (hac / hac), dimetil sülfoksid ihtiva eden FBS içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın. Daha fazla kullanım için parçalar halinde MEFS dondurun. Not: Alternatif olarak, yaban TYP kullanınE birincil MEFS; Bununla birlikte, rtTA ifade ek lentiviral vektör (Maherali ve ark., 9 ile tarif FUdeltaGW-rtTA plasmidi kullanılarak, örneğin), diğer lentiviral vektörleri ile birlikte transdüse edilmesi gerekmektedir. </li><li> MEF-klimalı TS ortamı hazırlanması Not: Ön dönüşüm deneyleri, MEF-klimalı (CM) TS medya (bölüm 6&#39;da açıklanan) Bireysel ITSC hatlarının alt kültür için gerekli olan, hazırlıklı olmak vardır. <ol><li> Plaka yemekleri istenilen sayıda MEF ortamda 150 mm çanak başına 1 x 10 7 mitotik inaktive MEFS. 9 Gy dozda γ-ışıması ile MEFS inaktive. Not: 150 mm tabak başına verimi yaklaşık 60 mi CM taşımaktadır. </li><li> kaplama, aspirat gün sonra ve MEF orta atmak ve geri 37 ° C&#39;de inkübatör içine MEFS ve yer yemekleri mitotik inaktive her yemeğin üzerine taze (FGF4 / heparin olmadan) TS orta hazırlanmış 20 ml ekleyin. </li><li> inkübasyondan sonra,mitotik inaktive MEF&#39;ler üç gün TS ortamı, 50 ml konik tüp içinde ortam toplanır. 0.2 um&#39;lik bir filtreden orta filtre edin ve 2.6.4 devam edin. CM bir başka üretim hattının hazırlanması için taze bir TH ortamı 20 ml CM değiştirin. Not: Mitotik inaktive MEF&#39;ler üç kereye kadar CM hazırlanması için de kullanılabilir. </li><li> Kısım -20 ° C&#39;de 50 ml konik tüp ve deposuna süzüldü CM 35 mi kadar gerekli. Çözündükten sonra, en fazla bir ay boyunca 4 ° C &#39;de% 70, TS-CM elde etmek için ve mağaza taze hazırlanmış TH ortamı 15 ml ekleyin. </li></ol></li></ol> 293T Hücreleri 3. lentiviral Vektör Üretimi Not: Tüm adımlar Biyogüvenlik Seviye 2 lisanslı laboratuvar alanı yürütülmektedir. <ol><li> Önceki dönüşüm deneyleri, aşırı ifadesi Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2 ve mCherry bağımlı doksisiklin (DOK) için lentiviral vektörler hazırlamak. Her bir lentivirüs için, ko-transfeksiyonu 293T hücreleri kullanılarakBir ambalaj plazmid ve VSV-G ifade eden zarf plazmid (plazmid bilgi için malzemeler Tablo bakınız) ile birlikte ilgili lentiviral transferi vektör. Not:. Yararlı bilgiler için virüs üretimi Gavrilescu ark 10 bakınız ilgili. o retrovirüs üretimini tarif rağmen, 293T hücreleri ve plazmid DNA kalitesi ile ilgili genel yorumlar da lentivirüs üretimi için doğrudur. DİKKAT: lentiviral vektörler ve iş ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri alınması gereken bir Biyogüvenlik Seviye 2 tesislerinde yapılmalıdır. </li><li> Kat poli-L-lisin (100 ug / ml) çözeltisi, 5 ml yemekler kapsayan ve hafifçe eşit kaplama çözeltisi dağıtmak sallayarak çözeltisi ile beş, 100 mm&#39;lik tabaklar. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde yemekler yerleştirin. 30 dakika soluklu kaplama çözümden sonra ve bir kez PBS ile bulaşıkları yıkayın. </li><li> 10 ml 293T hücre medya çanak başına plaka 7 x 10 6 293T hücreleri, sWirl yemekler eşit 37 ° C&#39;de geri inkübatör içine hücreleri ve yer yemekleri dağıtmak için. </li><li> Ertesi sabah, transfeksiyon ortamı, 5 ml büyüme ortamı değiştirin. geri 37 ° C&#39;de inkübatör içine klorokin çözeltisi (25 mM) ve yer yemekleri 1,000x stokunun 6 ul ekleyin. </li><li> Bu arada, transfeksiyon karışımı hazırlandı: <ol><li> Her lentiviral vektör için iki 5 ml reaksiyon tüpleri hazırlayın, A ve B etiketli </li><li> 2x HEPES Ekle 600 ul tüp A. tuz (HBS) tamponlu </li><li> 18.5 mikrogram Lentivector DNA ve 9,25 mg psPAX2 ve pMD2.G. ve 9.25 mikrogram ile tüp B karışımı 61.5 ul CaCl2 çözeltisi (2 M), Steril kültür notu H 2 O ile 600 ul ses seviyesini ayarlamak </li><li> vorteks ederken tüp B damla bilge tüp A dan çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika için transfeksiyon karışımı inkübe edin. </li></ol></li><li> çok dikkatli transfeksiyon karışımı ekleyin 100 mm çanak hazırlanan 293T hücrelere damla damla. bir6 saat için fter 5 orta kaldırmak ve virüs üretim ortamının 10 ml ile değiştirin. 37 ° C&#39;de geri kuvöz içine yemekleri yerleştirin. Not: kaldırma ve 293T hücreleri kolayca çanak ayırmak beri orta değiştirirken dikkatli olun. klorokin uzun süreli maruz kalma hücrelerine toksik olduğu Orta değişiklik transfeksiyon sonra 5-6 saat çok önemlidir. </li><li> Ertesi sabah, dikkatli bir şekilde çıkarın ve orta atmak ve virüs üretim ortamının 7 ml ile değiştirin. </li><li> Ertesi sabah, virüs ihtiva eden ortam ilk parti hasat edilir. Aspire 15 ml konik tüp içinde orta ve toplamak. Yine, hücreler üzerine virüs üretim ortamının 7 ilave edin. İkinci parti ertesi gün hasat edilene kadar mağaza buzdolabında orta virüs içeren. </li><li> Ertesi sabah 15 ml ilk parti ihtiva eden konik bir tüp ekleyerek virüs içeren ortam ikinci parti aspire. 293T hücreleri artık atılabilir. Filtre 0.45 um sur yoluyla orta virüs içerenfactant içermeyen selüloz asetat -Membran filtresi. Alikot filtre, virüs ihtiva eden daha başka kullanım için 80 ° C &#39;de orta ve depolar. Not: Virüs üretimi de 6 oyuklu tabaklarda gerçekleştirilebilir. buna göre hacimleri ve hücre sayıları küçültün. </li></ol> 4. Fibroblast İletimi 4 Faktörler ve mCherry Kontrol Vektör Not: Tüm adımlar, Biyolojik Güvenlik Seviye 2 tesiste gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Deneysel anahat şematik bir temsili. Şekil 1&#39;e bakın primer rtTA-MEF&#39;ler bir kısım Çözülme ve MEF ortam 2 ml toplam hacim içinde 6 oyuklu çanak oyuk başına 3.33 x 10 5 hücre plaka. en az 3 kuyu hazırlayın ve 4 faktör (4F) mCherry ve kontrol, onları etiketlemek. Not: rtTA ifade lentiviral vektör Aşama 4.2 sırasında Lentivector kokteyline ilave edilir Alternatif olarak, vahşi tip MEF&#39;ler kullanılabilir. </li><li> hücreler takip eden günlük tam cryopre eldeservation sırasıyla İletimi ortamı, 0.6 ml (4F), 0.9 mi (MCherry) ve 1 ml (kontrol) ile üç 6-Wells MEF ortamı değiştirin. Oda sıcaklığında PLV-teto-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets ve -mCherry virüsünün tek bir kısım Çözülme ve de 4F her bir virüs içeren süpernatan 100 ul (Tfap2c, Gata3, Eomes ETS2) ekleyin. Not: vahşi tip MEF&#39;ler durumunda, 100 ul preplated ortamın hacmini azaltmak ve buna ek olarak 4F karışımı içeren süpernatant FUdeltaGW-rtTA virüsünün 100 ul ilave edin. </li><li> de mCherry ile etiketlenmiş için MCherry virüs içeren ortam 100 ul ekle. her kuyuya 8 ug / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ekleyin. 37 ° C&#39;de inkübatör içinde çanak yerleştirin ve virüs içeren süpernatan ile MEF&#39;ler O / N inkübe edin. Not: vahşi tip MEF&#39;ler durumunda, 100 ul preplated ortamın hacmini azaltmak ve buna ek olarak FUdeltaGW-rtTA virüs içeren süpernatan 100 ul ilave edin. </li><li> Ertesi sabah, dikkatlice çıkarınvirüs içeren ortam ve 2 ml PBS ile üç kez yıkanır. Son olarak, (FGF4 / heparin olmadan) TS medya 2 ml ekleyin. Not: kalıt aktarımlı MEF&#39;ler doğrudan ITSC İndüksiyon deneyleri için kullanılan ya da daha fazla kullanım için dondurulabilir. </li></ol> 5. Fibroblast ITSC Dönüştürme Not: Tüm adımlar Biyogüvenlik Seviye 2 lisanslı laboratuvar alanı yürütülmektedir. <ol><li> 4 dakika - 2 mi, PBS ile ve 0.5 ml tripsin / EDTA solüsyonu 3 inkübatörde inkübe ekledikten sonra iki kez kalıt MEFS yıkayın. hücrelerin düzgün ayrılması için bir ters mikroskop altında bakın. <ol><li> 1 ml TS orta ekleyerek tripsin inaktive. 200 x g&#39;de 3 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu aktarın. Süpernatantı atın ve 2 ml TS ortamda hücrelerin tekrar süspansiyon. hücreleri saymak için untransduced kontrol örneği kullanın. </li><li> Levha 4F-MEF&#39;ler, MCherry-MEF&#39;ler ve 2 x 10 5 yoğunluğunda untransduced kontrol MEF&#39;ler her10 mi TS 100 mm hücre kültür çanağı başına hücre ortamı 2 ug / ml Dox (TS ortamı + FGF4 / heparin + DOX) ihtiva etmektedir. </li><li> Alternatif olarak, küçük yemekler transdiferansiyonun gerçekleştirin. Buna göre istenilen çanak boyutu, ölçek hacmine cm2 başına 3.6 x 10 3 hücre Plate. </li></ol></li><li> Sonraki gün, transdüksiyon verimliliği hesaplamak için MCherry proteininin ifadesini izlemek (10X objektif ve kırmızı floresans uyarma için uygun olan bir filtre kullanılarak) Epifloresans mikroskop kullanılarak. Not: İletimi verimliliği% 100&#39;e yakın olmalıdır. artan hücre ölümü transgen indüksiyondan sonra belirgin ise, bu virüs titresi çok yüksek olduğu anlamına gelir. Transdüksiyon, virüs ihtiva eden ortam daha düşük bir miktarı ile tekrar edilmelidir. </li><li> Şimdi değişim medya andan itibaren tüm yemekleri kaplama gün sonra 10 kadar her gün üzerinde. Bundan sonra, Dox (TS ortamı + FGF4 / heparin olmadan) TS ortam hücreleri beslenir. </li><li> ters bir mikroskop monitör için kullanılmasıgörünümü kadar 3 hafta boyunca 4F çanak (Şekil 2B ve C bakın) &#39;alanlar transdiferansiye&#39;. Bu tür koloniler iki kontrol yemekleri (mCherry MEFS ve untransduced MEFS) görünür olmamalıdır. </li></ol> Bireysel ITSC Hatları 6. İzolasyonu Not: Aşama 6.3 için bir doku kültürü kapağı gerekli değildir. Bakteriyel kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için% 70 etanol ile inverted mikroskop aşağı silinmesi tavsiye edilir. Bireysel ITSC kolonileri gün 21 ve transdiferansiyonun 28 gün arasında izole edilebilir. <ol><li> 96 U-alt sıra çanak 12 kuyu içine% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu 40 ul ekle ve buz üzerinde çanak yerleştirin. </li><li> koloni izolasyonu, 4F-MEF transdiferansiasyon çanak aspire orta önce. 10 ml PBS ile bir kez hücreler yıkanır. Yine, ters bir mikroskop altında 10 ml PBS ekleyin ve yer çanak. </li><li> c, ayrı ayrı koloniler 40 ul ayarlanmış bir 100 ul pipet asansör kullanarakpipet ile onları ircling ve kayan koloni aspire. bir koloni devri hücreleri hazırlanan 96-iyi çanak bir kuyunun içine her. emilmesinden sonra 12 koloniler 5 dakika için 37 ° C inkübatörde 96 gözlü tabak yerleştirin. </li><li> TS-CM ortamı (% 30 taze TS ortamı +% 70 CM + FGF4 / heparin) hazırlanmış 500 ul ile 24-iyi çanak bir kuyuya birkaç kez ve transfer hücre süspansiyonu aşağı yukarı pipetleme hücreleri ayırmak. </li><li> Ertesi gün, ölü hücrelerin çıkarılması için yeni TS-CM ortamı ile orta yerine. her gün orta değiştirin. </li><li> Parlak sınırları ile epitel kolonilerin görünümü için Monitör (Şekil 2&#39;ye bakınız). koloniler görünür sonra, kültür% 70 konfluent kadar veya en fazla bir hafta ve yavaş yavaş daha yemekler genişletmek. Bundan sonra, serum içeren ortamda veya serumsuz tanımlanmış ortam 3,5,11 standart protokollere göre niyetli TSCs gibi kültür hücreleri. </li></ol>

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li>
<li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+S+%22Science%22">Science</a>. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li>
<li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta%2Factivin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li>
<li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550(2007).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada sunulan 4 faktörü (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) esaslı transdiferansiasyon protokolü sadakatle oluşturmak fare embriyonik fibroblastlar gelen iTSCs dönüştürülmüş güvenilir bir yöntem sunmaktadır. Dahası, yöntem olmasına rağmen embriyonik fibroblastlar 3 ile karşılaştırıldığında verimlilik bir damla ile, aynı zamanda doğum sonrası kuyruk fibroblastlar için geçerlidir. Genel olarak, birincil fibroblast kaliteli transdiferansiasyon sonuçları ve bakım kritik bir faktör erken geçiş hücreleri (geçit üç iki) k...

Son zamanlarda, kök hücreler dönüşüm trofoblast fare embriyonik kök hücre çeşitli yaklaşımlar karşılaştıran bir çalışma, tüm analiz sistemleri, soy dönüşüm eksik kaldığını ortaya koymuştur. Bunun yerine bu yüzden trofoblast kök denilen uyarılmış trofoblast kök hücreler (iTSCs) hücre benzeri hücreler kökenli 1 hücre kaderi bir hafıza istinat oluşturulmuştur. Burada, ITSC nesil farklı bir yaklaşım izledi. Fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) 2 pluripotent kök hücrelerin doğrudan indüklenmesi benzer şekilde, iTSCs doğrudan farklılaşmış somatik dokudan dönüştürüldü. İlk olarak, biz MEFS aşırı eksprese zaman TSC kaderi uyaran 12 aday faktörleri belirledi. Daha sonra, faktör Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ITSC indüksiyonu 3 için gerekli ve yeterli olduğu tespit edilmiştir. Eş zamanlı olarak, başka bir grubu, bağımsız olarak iTSCs halinde MEFS dönüştürmek için yeterli olması Tfap2c, Gata3 ve Eomes bulundu. Bununla birlikte, buÇalışma, transgen ekspresyonu için gereken zamanın büyük ölçüde daha uzun ETS2 transdiferansiasyon kokteyl 4&#39;ten olmadığı zaman, farklı dönüşüm kinetik gösteren, çalışmamızda karşılaştırılır. Uyarılmış ve blastosist türetilmiş trofoblast kök hücre kültürü içeren geleneksel fetal sığır serumu (FBS), büyüme inaktive MEF&#39;ler 5,6 salgılanan faktörler varlığında dayanır. ITSC ​​İndüksiyon sırasında, bu faktörler transgenlerin tam kombinasyon yoktur ve transdiferansiyonun geçiren değildir MEF&#39;ler, tarafından sağlanır. Ancak, bir kez bireysel ITSC kolonileri onlar büyüme inaktive MEFS tarafından öngörülmekte olan medya, gerek alt kültür. Orada kaynaktan, iTSCs kültürlenmiş ve standart protokollere göre blastosist türetilmiş TSCs gibi tedavi olabilir. Not, hücre kültürü yemekleri jelatinleştirmeden olmadan Tanaka et al. 5, rutin kültür TSCs ve iTSCs aksine.

<table><tbody><tr><td>Doksisiklin hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>Steril PBS'de çözün, 2 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Klorokin difosfat tuzu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>Steril hücre kültürü dereceli suda 25 mM stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Polibren (Heksadimetrin bromür)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Steril hücre kültürü dereceli suda 8 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>insan rekombinant Fibroblast Büyüme Faktörü 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>PBS'de steril% 0.1 BSA'da çözün, 25 ve mikro hazırlayın; g/ml stok çözeltisi. Alikotları -80 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>Steril PBS'de çözerek 1 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -80 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>ProFeksiyon Memeli Transfeksiyon Sistemi</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, glutamin yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>İleri DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Hiklon</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat-membran filtresi</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Pirüvat;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO), hücre kültürü sınıfı</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>Fareler B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td><td>JAX Fareler</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles Nehri</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

trofoblast kök hücre içine fare embriyonik fibroblastlar doğrudan dönüşüm protokolü

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trofoblast kök hücreleri (TSCs) memeli gelişiminin ilk hücre kaderi karar bir sonucu olarak ortaya çıkar. Onlar kendini yenilemek ve plasentanın fetal kısmına hücre popülasyonu veren yükselişi kök vivo eşdeğer trofoblast soy tüm alt içine ayırt etmek yeteneğini koruyarak, in vitro kültüre edilebilir. Bu nedenle, TSCs in vitro ekstra embriyonik hücre kaderi kararı karşısında plasental gelişim ve embriyonik incelemek için eşsiz bir model sunuyoruz. itibaren blastosist aşamasına gelen DNA metilasyonu ve histon modifikasyonları oluşan ayrı bir epigenetik bariyer sıkıca her iki soy ayırır. Burada, tam aşırı ifadesi fare embriyonik fibroblastlar trofoblast anahtar düzenleyiciler Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ve geçici bu soy engeli aşmak için bir protokol açıklar. uyarılmış trofoblast kök hücreler kendini yenilemek mümkün ve türetilmiş trofoblast kök hücreleri blastokist hemen hemen aynıdır imorfoloji, işaretleyici gen ifadesi ve metilasyon motifinin n terimleri. In vitro ve in vivo deneylerde Fonksiyonel bu hücrelerin trofoblast soy polyploid trofoblast dev hücrelerin üretilmesi ve blastosist enjekte edildiğinde plasentayı kimerize boyunca ayırt etmek mümkün olduğunu onaylayın. somatik doku trofoblast kök hücrelerin uyarılması, bu ekstra-embriyonik soyunun genetik ve epigenetik özelliklerini incelemek için yeni yollar açar ve ilgili embriyo zarar vermeden trofoblast kök hücre hatları üretme imkanı sunuyor.

4F transgen ifadesi aktive çanak, hücreler hızla morfolojisi (Şekil 2A ve B karşılaştırın) değiştirin. Gün etrafında 14-21 farklı transdiferensiye alanlar (iki örnek Şekil 2B ve C olarak verilmiştir) ortaya çıkar. Bu birincil koloniler tipik TSC morfolojisi eksikliği; ancak onlar sıkı kenarları ve iyi niyetli bir TSCs son derece anımsatan parlak sınırları ile alt-kültür, karakteristik epitel morfoloji ortaya (Şekil 2B) kez. Trofoblast tr...

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Bu prosedürün genel amacı, fare fibroblastlarından gerçek indüklenmiş trofoblast kök hücreleri veya iTSC'ler üretmektir. Bu yöntem, embriyonik soy ile embriyo dışı soyu ayıran bariyerin doğasına ilişkin kök hücre alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, transgenik ekspresyonun yalnızca geçici olarak aktive edilmesi ve böylece stabil olarak dönüştürülmüş hücrelerin seçilmesinin kolaylaştırılmasıdır.Uygun kişisel koruyucu ekipmanların kullanıldığı biyogüvenlik seviyesi iki laboratuvarında, beş adet 100 mililitrelik kabı beş mililitre Poli-L-lizin çözeltisiyle kaplayın ve kaplama çözeltisini eşit şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın. Kapları 30 dakika boyunca 37 derece Celsius'lik bir inkübatöre yerleştirin, ardından Poli-L-lizini aspire edin ve kapları bir kez PBS ile durulayın. Sonrasında, her bir kap için 10 mililitre 293 T hücre medyumunda 7 × 10⁶ 293 T hücresi ekleyin, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için kapları dairesel olarak sallayın ve kapları inkübatöre geri yerleştirin.Ertesi sabah, büyüme ortamını beş mililitre transfeksiyon ortamı ile değiştirin. Ardından, kültürleri altı mikrolitre 1000X stok Klorokin solüsyonu ile işlemden geçirin ve plakları 37 degrees Celsius'ye ayarlanmış inkübatöre geri yerleştirin. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, her bir Lentiviral vektör için, 600 mikrolitre Lentivektör DNA solüsyonunu, vorteksleme yaparken 600 mikrolitre 2X HEPES tamponlu salin içine damla damla ekleyin ve transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında inkübe edin.15 dakika sonra, karışımı hazırlanan 293 T hücrelerine damla damla ve çok dikkatli bir şekilde ekleyin ve kapları inkübatöre geri yerleştirin. Beş ila altı saat sonra, besiyerini 10 mililitre virüs üretim besiyeri ile değiştirin ve plakaları tekrar inkübatöre yerleştirin. Ertesi sabah, bir gece daha inkübasyon için besiyerini dikkatlice yedi mililitre taze virüs üretim besiyeri ile değiştirin.Ardından, her plakadaki besiyerini ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve bir gece daha inkübasyon için plakaların üzerine yedi mililitre taze virüs üretim besiyeri ekleyin. Ertesi sabah, virüs içeren ikinci besiyeri grubunu hasat ederek süpernatantı ilk virüs grubuyla birleştirin ve virüs içeren besiyerini, -80 derecede 500 mikrolitrelik alikotlar halinde saklamak üzere 0.45 mikronluk sürfaktan içermeyen selüloz asetat membran filtreden süzün. Fibroblastları indüklenmiş trofoblast kök hücrelerine dönüştürmek için, transduksiyon yapılmış fare embriyonik fibroblastlarını veya MEF'leri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Ardından hücreleri 37 °C'de 0,5 ml Trypsin EDTA çözeltisi ile ayırın. Üç ila dört dakika sonra, hücrelerin plakadan ayrıldığını ters mikroskop altında doğrulayın ve ardından Trypsin'i 1 ml TS ortamı ile etkisizleştirin. Hücre süspansiyonlarını ayrı 15 ml'lik konik tüplere aktarın ve hücreleri santrifüjleyin.Ardından pelletleri iki mililitre TS ortamında yeniden süspanse edin ve fibroblast büyüme faktörü dört ve Heparin içeren, Doxycycline ile desteklenmiş 10 mililitre TS ortamında, 100 mililitrelik kap başına 2 × 10⁵ mCherry veya kontrol olarak transdüksiyon yapılmamış MEF'leri gece boyu kültür için ekimleyin. Ertesi gün, bir epifloresan mikroskop altında mCherry protein ekspresyonunu kullanarak transdüksiyon verimliliğini tahmin edin. Transdüksiyon verimliliği yaklaşık %100 ise kültürleri inkübatöre geri yerleştirin ve 10. güne kadar tüm kaplardaki ortamı gün aşırı değiştirin.Ardından, dört faktör içeren kapta transdiferansiye olmuş alanların görünümünü izlemek için ters mikroskop kullanarak hücreleri, üç haftaya kadar Doksiklin içermeyen, fibroblast büyüme faktörü dört ve Heparin içeren taze TS besiyeri ile besleyin. Bu aşamada MEF'ler morfolojik olarak trofoblast kök hücrelerine benzemediğinden, transdiferansiye olan alanların tanımlanması kritiktir. Hücre boyutları ve büyük çekirdekleri ile tanımlanan trofoblast dev hücrelerinin bitişiğinde, yoğun şekilde birikmiş kolonileri arayın.Tekil iTSC hatlarını izole etmek için, öncelikle bakteriyel kontaminasyon riskini en aza indirmek amacıyla invert mikroskobu %70 etanol ile silin. Ardından, 96'lık U tabanlı bir kuyucuk plakasının 12 kuyucuğuna 40 µL %0,5 Trypsin EDTA ekleyin ve plakayı buz üzerine yerleştirin. Şimdi, dört faktörlü MEF transdiferansiyasyon kabındaki medyumu aspire edin ve hücreleri 10 mL PBS ile bir kez yıkayın.Yıkama işleminden sonra, hücrelere 10 mililitre taze PBS ekleyin ve plakayı ters mikroskop tablasına yerleştirin. 40 mikrolitreye ayarlanmış 100 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, pipet ucuyla her bir tekil koloninin etrafını çevreleyin ve yüzen koloniyi aspire edin. 12 koloni toplayana kadar her bir koloniyi 96 kuyucuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.Ardından kolonileri 37 °C'de beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda hücreleri pipetleyerek ayırın ve hücre süspansiyonlarını, gece boyu kültür için 500 µL complete TS artı fibroblast büyüme faktörü ve Heparin içeren bir 24 kuyucuklu plağın ayrı kuyucuklarına aktarın. Ertesi gün, ölü hücreleri uzaklaştırmak için besiyerini taze complete TS artı fibroblast büyüme faktörü ve Heparin besiyeri ile değiştirin ve plağı inkübatöre geri yerleştirin.Sürekli olarak kültürler, parlak sınırlı epitelyal kolonların oluşumu açısından günlük olarak izlenir. Kolonlar gözlemlendiğinde, hücreler bir haftaya kadar veya %70 konfluensle ulaşana kadar kültüre edilir. Dört faktörün transgen ekspresyonunun aktive olduğu kültürlerde, hücreler hızla morfoloji değiştirir.14 ile 21. günler civarında, belirgin transdiferansiye alanlar ortaya çıkar. Bu primer koloniler tipik trofoblast kök hücre morfolojisinden yoksundur; ancak alt kültür edildiklerinde, gerçek trofoblast kök hücrelerini güçlü bir şekilde anımsatan, sık kenarlara ve parlak sınırlara sahip karakteristik bir epitelyal morfoloji gözlemlenir. Dört faktörle indüklenen trofoblast kök hücreleri, trofoblast transkripsiyon faktörleri Cdx2 ve Tfap2c için pozitif kaldığında, bu hatların sonraki In vitro veya InVivo analizlerde kullanılabileceği düşünülür.Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün şekilde yürütülürse altı hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, üretilen iTSC'lerin kimerizasyon potansiyeline ilişkin ek soruları yanıtlamak için blast yardımlı enjeksiyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, erken soy ayrışması alanındaki araştırmacıların farelerde embriyonik ve embriyo dışı hücre kaderi dönüşümünü incelemelerine olanak sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, yeni embriyonik fibroblastların doğrudan indüklenmiş trofoblast kök hücrelerine nasıl dönüştürüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir. Lentiviral vektörlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve biyogüvenlik seviye ikiye uygun çalışma prosedürlerinin uygulanması gibi önlemlerin her zaman takip edilmesi gerektiğini unutmayın.

protocol-for-direct-conversion-murine-embryonic-fibroblasts-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Bu çalışmada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretiyoruz.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Bu el yazması, Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5'in retrovirüs aracılı bir iletimini kullanarak çeşitli yeniden programlanmış kardiyak alt tiplerin oluşturulması ve ölçülmesi için adım adım bir protokolü açıklar.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Bu protokol, farelerde hamilelik sırasında maternal vaskülatürdeki değişiklikleri değerlendirmek için bir tekniği tanımlar. Stereolojik yöntemler kullanılarak, desidual spiral arterlerin yeniden şekillenmesi kantitatif olarak değerlendirildi ve sonuçlar immünohistokimya kullanılarak kalitatif olarak doğrulandı.

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

Keşfedin, fare embriyonik fibroblastlarını indüklenmiş trofoblast kök hücrelerine dönüştürme yöntemini. Bu teknik, embriyonik ve ekstraembriyonik soy hattı arasındaki bariyeri incelemek için geçici transgen ifadesi kullanır.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Daha fazla video keşfet