Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, fare fibroblastlarından gerçek indüklenmiş trofoblast kök hücreleri veya iTSC'ler üretmektir. Bu yöntem, embriyonik soy ile embriyo dışı soyu ayıran bariyerin doğasına ilişkin kök hücre alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, transgenik ekspresyonun yalnızca geçici olarak aktive edilmesi ve böylece stabil olarak dönüştürülmüş hücrelerin seçilmesinin kolaylaştırılmasıdır.

Uygun kişisel koruyucu ekipmanların kullanıldığı biyogüvenlik seviyesi iki laboratuvarında, beş adet 100 mililitrelik kabı beş mililitre Poli-L-lizin çözeltisiyle kaplayın ve kaplama çözeltisini eşit şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın. Kapları 30 dakika boyunca 37 derece Celsius'lik bir inkübatöre yerleştirin, ardından Poli-L-lizini aspire edin ve kapları bir kez PBS ile durulayın. Sonrasında, her bir kap için 10 mililitre 293 T hücre medyumunda 7 × 10⁶ 293 T hücresi ekleyin, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için kapları dairesel olarak sallayın ve kapları inkübatöre geri yerleştirin.

Ertesi sabah, büyüme ortamını beş mililitre transfeksiyon ortamı ile değiştirin. Ardından, kültürleri altı mikrolitre 1000X stok Klorokin solüsyonu ile işlemden geçirin ve plakları 37 degrees Celsius'ye ayarlanmış inkübatöre geri yerleştirin. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, her bir Lentiviral vektör için, 600 mikrolitre Lentivektör DNA solüsyonunu, vorteksleme yaparken 600 mikrolitre 2X HEPES tamponlu salin içine damla damla ekleyin ve transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında inkübe edin.

15 dakika sonra, karışımı hazırlanan 293 T hücrelerine damla damla ve çok dikkatli bir şekilde ekleyin ve kapları inkübatöre geri yerleştirin. Beş ila altı saat sonra, besiyerini 10 mililitre virüs üretim besiyeri ile değiştirin ve plakaları tekrar inkübatöre yerleştirin. Ertesi sabah, bir gece daha inkübasyon için besiyerini dikkatlice yedi mililitre taze virüs üretim besiyeri ile değiştirin.

Ardından, her plakadaki besiyerini ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve bir gece daha inkübasyon için plakaların üzerine yedi mililitre taze virüs üretim besiyeri ekleyin. Ertesi sabah, virüs içeren ikinci besiyeri grubunu hasat ederek süpernatantı ilk virüs grubuyla birleştirin ve virüs içeren besiyerini, -80 derecede 500 mikrolitrelik alikotlar halinde saklamak üzere 0.45 mikronluk sürfaktan içermeyen selüloz asetat membran filtreden süzün. Fibroblastları indüklenmiş trofoblast kök hücrelerine dönüştürmek için, transduksiyon yapılmış fare embriyonik fibroblastlarını veya MEF'leri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından hücreleri 37 °C'de 0,5 ml Trypsin EDTA çözeltisi ile ayırın. Üç ila dört dakika sonra, hücrelerin plakadan ayrıldığını ters mikroskop altında doğrulayın ve ardından Trypsin'i 1 ml TS ortamı ile etkisizleştirin. Hücre süspansiyonlarını ayrı 15 ml'lik konik tüplere aktarın ve hücreleri santrifüjleyin.

Ardından pelletleri iki mililitre TS ortamında yeniden süspanse edin ve fibroblast büyüme faktörü dört ve Heparin içeren, Doxycycline ile desteklenmiş 10 mililitre TS ortamında, 100 mililitrelik kap başına 2 × 10⁵ mCherry veya kontrol olarak transdüksiyon yapılmamış MEF'leri gece boyu kültür için ekimleyin. Ertesi gün, bir epifloresan mikroskop altında mCherry protein ekspresyonunu kullanarak transdüksiyon verimliliğini tahmin edin. Transdüksiyon verimliliği yaklaşık %100 ise kültürleri inkübatöre geri yerleştirin ve 10. güne kadar tüm kaplardaki ortamı gün aşırı değiştirin.

Ardından, dört faktör içeren kapta transdiferansiye olmuş alanların görünümünü izlemek için ters mikroskop kullanarak hücreleri, üç haftaya kadar Doksiklin içermeyen, fibroblast büyüme faktörü dört ve Heparin içeren taze TS besiyeri ile besleyin. Bu aşamada MEF'ler morfolojik olarak trofoblast kök hücrelerine benzemediğinden, transdiferansiye olan alanların tanımlanması kritiktir. Hücre boyutları ve büyük çekirdekleri ile tanımlanan trofoblast dev hücrelerinin bitişiğinde, yoğun şekilde birikmiş kolonileri arayın.

Tekil iTSC hatlarını izole etmek için, öncelikle bakteriyel kontaminasyon riskini en aza indirmek amacıyla invert mikroskobu %70 etanol ile silin. Ardından, 96'lık U tabanlı bir kuyucuk plakasının 12 kuyucuğuna 40 µL %0,5 Trypsin EDTA ekleyin ve plakayı buz üzerine yerleştirin. Şimdi, dört faktörlü MEF transdiferansiyasyon kabındaki medyumu aspire edin ve hücreleri 10 mL PBS ile bir kez yıkayın.

Yıkama işleminden sonra, hücrelere 10 mililitre taze PBS ekleyin ve plakayı ters mikroskop tablasına yerleştirin. 40 mikrolitreye ayarlanmış 100 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, pipet ucuyla her bir tekil koloninin etrafını çevreleyin ve yüzen koloniyi aspire edin. 12 koloni toplayana kadar her bir koloniyi 96 kuyucuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.

Ardından kolonileri 37 °C'de beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda hücreleri pipetleyerek ayırın ve hücre süspansiyonlarını, gece boyu kültür için 500 µL complete TS artı fibroblast büyüme faktörü ve Heparin içeren bir 24 kuyucuklu plağın ayrı kuyucuklarına aktarın. Ertesi gün, ölü hücreleri uzaklaştırmak için besiyerini taze complete TS artı fibroblast büyüme faktörü ve Heparin besiyeri ile değiştirin ve plağı inkübatöre geri yerleştirin.

Sürekli olarak kültürler, parlak sınırlı epitelyal kolonların oluşumu açısından günlük olarak izlenir. Kolonlar gözlemlendiğinde, hücreler bir haftaya kadar veya %70 konfluensle ulaşana kadar kültüre edilir. Dört faktörün transgen ekspresyonunun aktive olduğu kültürlerde, hücreler hızla morfoloji değiştirir.

14 ile 21. günler civarında, belirgin transdiferansiye alanlar ortaya çıkar. Bu primer koloniler tipik trofoblast kök hücre morfolojisinden yoksundur; ancak alt kültür edildiklerinde, gerçek trofoblast kök hücrelerini güçlü bir şekilde anımsatan, sık kenarlara ve parlak sınırlara sahip karakteristik bir epitelyal morfoloji gözlemlenir. Dört faktörle indüklenen trofoblast kök hücreleri, trofoblast transkripsiyon faktörleri Cdx2 ve Tfap2c için pozitif kaldığında, bu hatların sonraki In vitro veya InVivo analizlerde kullanılabileceği düşünülür.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün şekilde yürütülürse altı hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, üretilen iTSC'lerin kimerizasyon potansiyeline ilişkin ek soruları yanıtlamak için blast yardımlı enjeksiyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, erken soy ayrışması alanındaki araştırmacıların farelerde embriyonik ve embriyo dışı hücre kaderi dönüşümünü incelemelerine olanak sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, yeni embriyonik fibroblastların doğrudan indüklenmiş trofoblast kök hücrelerine nasıl dönüştürüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir. Lentiviral vektörlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve biyogüvenlik seviye ikiye uygun çalışma prosedürlerinin uygulanması gibi önlemlerin her zaman takip edilmesi gerektiğini unutmayın.